基于化學(xué)動(dòng)力學(xué)的異綠原酸A在水溶液中的降解規(guī)律研究*

王冬萍，王萌，任曉亮

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，教育部工程研究中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617）

異綠原酸A，又稱3，5-二咖啡?？鼘幩?，屬于咖啡酰奎寧酸類。異綠原酸A不僅存在于菊科、忍冬科、豆科等藥食兩用植物中[1]，在水果（如杏、李子）和蔬菜（胡蘿卜）等食品中也大量存在[2-3]。作為功能性天然產(chǎn)物，異綠原酸A的研究已深入到食品、醫(yī)藥和保健等多個(gè)領(lǐng)域。綠原酸類物質(zhì)為眾多中藥材（如金銀花、茵陳蒿、杜仲）以及中成藥（如復(fù)肝寧、雙花注射液、粉刺口服液、銀黃顆粒）的主要藥效成分[4]，2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定異綠原酸A為銀黃顆粒的指標(biāo)性成分[5]。現(xiàn)代藥理研究表明，異綠原酸A具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎、抗氧化、降血壓等作用[6-8]，并能有效抑制人體免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的復(fù)制[9]。異綠原酸A屬于酚類化合物，該類物質(zhì)的酯鍵、不飽和雙鍵在水溶液中可能發(fā)生水解，酚羥基易發(fā)生氧化降解[10-11]，但目前尚無(wú)系統(tǒng)的有關(guān)異綠原酸A穩(wěn)定性研究的報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)依照《人用藥物技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)理事會(huì)》（ICH）和《國(guó)家藥品監(jiān)督管理局》（NMPA）對(duì)藥物穩(wěn)定性的指導(dǎo)原則，采用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法系統(tǒng)研究了異綠原酸A在多種物理、化學(xué)環(huán)境下的降解規(guī)律，預(yù)期為含有異綠原酸A的藥物制劑在開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)、貯藏及合理應(yīng)用上提供參考。

1 材料

1.1 試劑和藥品 異綠原酸A對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B21539，純度≥98%）；乙腈、甲醇[色譜純，賽默飛世爾（中國(guó)）科技有限公司]；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；鹽酸（分析純，天津化學(xué)試劑一廠）；甲酸（色譜純，美國(guó)ROE SCIENTIFIC INC）；氯化鐵、氯化亞鐵（分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）；氫氧化鈉、氯化鈉（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；3% H2O2（分析純，河北吉捷生物科技有限公司）。

1.2 儀器 Acquity H-class超高效液相色譜（美國(guó)Waters公司）；SB-3200D數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AX224ZH十萬(wàn)分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州金壇良友儀器有限公司）；DELTA 320 pH儀（瑞士Mettler Toledo公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 超高液相色譜（UPLC）色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱；流速0.2 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)212 nm；梯度洗脫0～6 min：10%～40%乙腈。

2.2 對(duì)照品及樣品溶液制備 精密稱取異綠原酸A對(duì)照品5.12 mg，置于5 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1.024 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液200 μL置于10 mL棕色容量瓶中，用純水及各穩(wěn)定性研究介質(zhì)溶液定容至刻度，搖勻，得到濃度為20.48 μg/mL的對(duì)照品溶液和穩(wěn)定性試驗(yàn)用樣品溶液。

2.3 異綠原酸A穩(wěn)定性研究

2.3.1 酸堿性對(duì)異綠原酸A穩(wěn)定性的研究 綠原酸和異綠原酸A分屬于單咖啡酰奎尼酸和二咖啡?？崴?，生物合成途徑相似，常常共存在植物體內(nèi)[10]。綠原酸由一分子咖啡酸和一分子奎寧酸縮合而成，分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及二元酚3種不穩(wěn)定基團(tuán)，堿性條件下酯鍵極不穩(wěn)定，容易水解[11]。為了考察酸堿性對(duì)異綠原酸A穩(wěn)定性的影響，采用氫氧化鈉和鹽酸溶液配制成不同pH值溶液（pH 3.0、5.0、6.2、8.0、10.0），用多點(diǎn)校正過(guò)的 pH 計(jì)測(cè)定其pH值。采用“2.2”項(xiàng)下樣品配制方法，取異綠原酸A儲(chǔ)備液200 μL置于10 mL棕色容量瓶中，分別采用以上不同pH水溶液定容至刻度，精密制得質(zhì)量濃度為20.48 μg/mL的樣品溶液，密封后置80℃水浴中。間隔一定時(shí)間取樣，UPLC測(cè)定異綠原酸A在不同pH值中的含量變化，得到不同pH值下異綠原酸A的降解動(dòng)力學(xué)曲線并計(jì)算降解速率常數(shù)k。異綠原酸A對(duì)照品及堿性樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 異綠原酸A對(duì)照品（A）及堿性樣品（B）UPLC色譜圖

以Ln（Ct/C0）為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到在不同pH值條件下異綠原酸A的降解動(dòng)力學(xué)曲線，見(jiàn)圖2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得異綠原酸A在不同pH值下的降解均符合一級(jí)反應(yīng)過(guò)程，且在所有試驗(yàn)條件下的動(dòng)力學(xué)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.98。

圖2 80℃不同pH值條件下異綠原酸A在水溶液中的降解動(dòng)力學(xué)曲線

以不同pH值和其所對(duì)應(yīng)的Ln（K）作圖，得到pH值與異綠原酸A降解速率的關(guān)系圖，見(jiàn)圖3。異綠原酸A在酸性條件下較穩(wěn)定；在堿性條件，特別是強(qiáng)堿條件下易降解。在pH 3～10下，隨著pH的增大，降解速率加快，pH 10和pH 3水溶液中異綠原酸A的降解速率常數(shù)分別為0.546 4、0.010 8，pH 10條件下的降解速率常數(shù)為pH 3條件下的52倍，表明異綠原酸A在堿性水溶液中的水解過(guò)程可能由氫氧根離子催化發(fā)生。

圖3 異綠原酸A降解速率與pH值的關(guān)系圖

表1 異綠原酸A在不同pH條件下的降解速率常數(shù)k及半衰期t1/2

2.3.2 溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響 多酚綠原酸類物質(zhì)由于其結(jié)構(gòu)中的多個(gè)酚羥基，高溫加熱情況下容易分解[11]。一般來(lái)說(shuō)，溫度升高時(shí)大部分化學(xué)反應(yīng)的速率會(huì)升高。研究證明，溫度每升高10℃，化學(xué)反應(yīng)速率會(huì)增加2～4倍[12]。為了考察溫度對(duì)異綠原酸A穩(wěn)定性的影響，采用“2.2”項(xiàng)下樣品配制方法，取異綠原酸A儲(chǔ)備液200 μL置于10 mL棕色容量瓶中，用純水定容至刻度，精密制得質(zhì)量濃度為20.48 μg/mL的樣品溶液，密封后分別置于 37、60、80℃水浴中。間隔一定時(shí)間取樣，UPLC測(cè)定異綠原酸A在不同溫度下的含量變化，得到異綠原酸A在不同溫度下的降解動(dòng)力學(xué)曲線并計(jì)算降解速率常數(shù)k。以Ln（K）為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)作圖，得到溫度對(duì)異綠原酸A降解速率的影響，見(jiàn)圖4。可得異綠原酸A隨溫度升高，降解速率明顯加快。通過(guò)阿侖尼烏斯方程Ln（K）=LnA-Ea/RT計(jì)算異綠原酸A降解反應(yīng)的活化能，式中A表示異綠原酸A水解反應(yīng)的指前因子，Ea表示活化能（J/mol），R表示摩爾氣體常數(shù)（8.314 J/K/mol），T表示絕對(duì)溫度（K）。計(jì)算得出異綠原酸A在25℃，中性條件下降解速率常數(shù)k為 0.000 5，降解半衰期（t1/2）為 1 381.9 h，活化能（Ea）為 96.71 kJ/mol。

圖4 不同溫度下異綠原酸A的降解速率常數(shù)k

2.3.3 金屬離子對(duì)穩(wěn)定性的影響 按照藥典規(guī)定，綠原酸是評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)金銀花保存在鐵容器中時(shí)，綠原酸的含量會(huì)明顯下降[13]。本研究采用不同價(jià)態(tài)的金屬離子（Fe3+、Fe2+、Na+）考察其對(duì)異綠原酸A降解速率的影響。采用“2.2”項(xiàng)下樣品配制方法，取異綠原酸A儲(chǔ)備液200μL置于10mL棕色容量瓶中，分別用含有0.1mol/L FeCl3、FeCl2、NaCl的水溶液定容至刻度，精密制得質(zhì)量濃度為20.48 μg/mL的樣品溶液，密封后置于80℃水浴中。間隔一定時(shí)間取樣，UPLC測(cè)定異綠原酸A在不同價(jià)態(tài)金屬離子條件下的含量變化，得到異綠原酸A在不同價(jià)態(tài)金屬離子中的降解動(dòng)力學(xué)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖5，異綠原酸A在水溶液和加入0.1 mol/L Fe3+、Fe2+和 Na+的溶液中的 t1/2分別為3.458 h、0.020 h、0.295 h、3.185 h。結(jié)果證明 Fe3+對(duì)異綠原酸A的降解速率影響明顯，F(xiàn)e2+次之，而Na+對(duì)異綠原酸A降解速率無(wú)明顯影響。

圖5 異綠原酸A受不同金屬離子的降解動(dòng)力學(xué)曲線

2.3.4 初始藥物濃度對(duì)穩(wěn)定性的影響 采用“2.2”項(xiàng)下樣品配制方法，分別取異綠原酸A儲(chǔ)備液100、200、400 μL分別置于10 mL棕色容量瓶中，用純水定容至刻度，精密制得質(zhì)量濃度分別為10.24、20.48、40.96 μg/mL的樣品溶液，密封后置于60℃水浴中。間隔一定時(shí)間取樣，UPLC測(cè)定異綠原酸A含量變化，得到異綠原酸A在不同初始濃度的降解速率常數(shù)。以降解速率常數(shù)對(duì)各樣品質(zhì)量濃度作圖，結(jié)果見(jiàn)圖6?？芍惥G原酸A的初始藥物濃度增大，其降解速率無(wú)明顯變化，說(shuō)明初始藥物濃度對(duì)異綠原酸A的降解速率無(wú)影響。

圖6 不同初始藥物濃度下異綠原酸A的降解速率

2.3.5 光照對(duì)穩(wěn)定性的影響 光照在中藥儲(chǔ)存、晾曬、過(guò)程中不可避免，同時(shí)也易造成藥材發(fā)生氧化、分解等化學(xué)反應(yīng)[14]。綠原酸類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有的酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚是其光不穩(wěn)定的主要原因[15-17]。采用“2.2”項(xiàng)下樣品配制方法，取異綠原酸A儲(chǔ)備液200 μL置于10 mL棕色容量瓶中，用純水定容至刻度，精密制得質(zhì)量濃度為20.48 μg/mL的樣品溶液，密封后分別于日光燈（1.55×106lux）、紫外燈（4.16×105lux）及避光條件下放置。間隔一定時(shí)間取樣，UPLC測(cè)定異綠原酸A在不同光照條件下的含量變化。在光源一定時(shí)，藥物在光照射下的含量下降的程度與入射光的強(qiáng)度E和時(shí)間t的乘積Et（累計(jì)光量）有關(guān)[12]。計(jì)算異綠原酸A在兩種不同光照條件下的累計(jì)光量，得到異綠原酸A累計(jì)光量與含量的關(guān)系圖。從圖7可知，異綠原酸A的降解速率為紫外燈＞日光燈，表明紫外光對(duì)異綠原酸A的降解速率影響更大。因此，異綠原酸A及含該成分的相關(guān)藥物在殺菌過(guò)程中應(yīng)避免使用紫外線殺菌，防止其發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。

圖7 異綠原酸A在不同光照條件下累計(jì)光量與含量關(guān)系圖

2.3.6 氧化對(duì)穩(wěn)定性的影響 多酚類物質(zhì)以其良好的抗氧化活性成為科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)[18]。綠原酸是重要的膳食抗氧化成分，其能夠提供氫原子給自由基，抑制氧化損傷的發(fā)生。提供氫原子后，綠原酸被氧化成苯氧基自由基，苯氧基自由基進(jìn)一步通過(guò)共振而達(dá)到穩(wěn)態(tài)[19]。為了考察氧化對(duì)異綠原酸A穩(wěn)定性的影響，采用“2.2”項(xiàng)下樣品配制方法，用3% H2O2精密制得20.48 μg/mL的異綠原酸A水溶液，保持溫度25℃。間隔一定時(shí)間取樣，UPLC測(cè)定異綠原酸A的含量變化，得到異綠原酸A在氧化條件下的降解動(dòng)力學(xué)曲線。由圖8可知，加入3% H2O2的樣品溶液與水溶液相比，降解速率常數(shù)變化不明顯，說(shuō)明異綠原酸A的穩(wěn)定性受H2O2的影響較小。

圖8 氧化條件下異綠原酸A的降解動(dòng)力學(xué)曲線

3 討論

研究表明異綠原酸A在多種物理、化學(xué)環(huán)境中均不穩(wěn)定，且在各條件下的水解作用均遵循（偽）一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。異綠原酸A的降解過(guò)程呈現(xiàn)明顯的pH及溫度依賴性，在酸性環(huán)境中異綠原酸A的穩(wěn)定性較好，溶液堿性增強(qiáng)及溫度升高均會(huì)使降解反應(yīng)速度加快；而初始藥物濃度及氧化對(duì)降解速率的影響不明顯；金屬離子Fe3+、Fe2+的引入以及紫外光均會(huì)使異綠原酸A的降解反應(yīng)速率加快。異綠原酸A的活化能為96.71 kJ/mol，表明異綠原酸A在中性水溶液中的降解反應(yīng)對(duì)于溫度較為敏感，降解反應(yīng)隨著溫度升高而大大加快。因此，異綠原酸A及含有該成分的相關(guān)藥物應(yīng)在低溫條件下保存，在開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)及使用含有異綠原酸A藥物時(shí)應(yīng)使用弱酸性的條件，并控制容器及溶劑中存在的鐵離子，避免與紫外光接觸，防止其降解。在堿性條件下發(fā)現(xiàn)異綠原酸A產(chǎn)生兩種降解產(chǎn)物，但目前暫無(wú)對(duì)異綠原酸A降解產(chǎn)物的研究。異綠原酸A屬于二咖啡酰奎尼酸，為兩分子咖啡酸和一分子奎寧酸結(jié)合而成的酯類化合物[10，20]。從異綠原酸A結(jié)構(gòu)組成出發(fā)，推測(cè)其兩種降解產(chǎn)物可能為咖啡酸和奎寧酸。本實(shí)驗(yàn)研究了異綠原酸A在不同條件下的降解規(guī)律，具體降解產(chǎn)物的研究會(huì)在后續(xù)進(jìn)行。本研究從化學(xué)動(dòng)力學(xué)的角度，探究了異綠原酸A在不同環(huán)境中的降解規(guī)律，為異綠原酸A及含有該成分的藥物制劑的合理使用提供了依據(jù)。