基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的指紋圖譜法鑒別金線蓮及其混偽品

彭琴，鄒福賢，許少華，張勛，徐偉，林羽，陳抒云* ，許文*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122)

金線蓮是蘭科開(kāi)唇蘭屬植物金線蘭[Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl]的干燥全草，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕之功效，用于治療腎炎、支氣管炎、膀胱炎、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[1]。金線蓮為新資源食品、珍貴的藥食同源植物，主要含有黃酮、多糖、有機(jī)酸、揮發(fā)性化合物和核苷類等[2-8]，具有抗糖尿病、抗氧化、保肝等多重功效[9-13]。

藥食同源金線蓮由于其價(jià)格昂貴，尤其是野生資源和林下仿野生種植，市場(chǎng)價(jià)每公斤超過(guò)萬(wàn)元[3]，課題組承擔(dān)原福建省食品藥品監(jiān)督管理局金線蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升專項(xiàng)，調(diào)研發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上充斥著存在較多的金線蓮混偽品，如長(zhǎng)片金線蘭、滇越金線蘭、麗蕾金線蘭、臺(tái)灣銀線蘭、血葉蘭、斑葉蘭和虎耳草等[14]，這些混偽品在干燥的狀態(tài)下的外觀與金線蓮極其相似，僅憑外觀評(píng)價(jià)往往難以明辨真?zhèn)?，一定程度上影響金線蓮的食用安全。林美珍等[15-16]分別對(duì)金線蓮與臺(tái)灣銀線蘭和斑葉蘭的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較區(qū)分；另有研究從多糖和總黃酮的水平比較了金線蓮與混偽品[17-19]；張鐵等[20-21]分別從DNA水平比較區(qū)分了金線蓮與滇越金線蘭和臺(tái)灣銀線蘭的區(qū)別，Hu等[22]利用ITS2序列對(duì)金線蓮及其混偽品進(jìn)行了鑒定；王海閣等[23]選用了16對(duì)SSR多態(tài)性引物可用于不同品系金線蓮與臺(tái)灣銀線蘭的鑒別；Li等[24]采用近紅外技術(shù)對(duì)金線蓮、斑葉蘭和血葉蘭進(jìn)行了鑒別。這些方法對(duì)區(qū)分金線蓮與其混偽品提供了技術(shù)手段，促進(jìn)金線蓮與真?zhèn)蔚蔫b定的水平，但是依然存在顯微鑒別、總黃酮、總多糖等方法專屬性不夠；近紅外法建庫(kù)樣本量大，缺乏全部混偽品的數(shù)據(jù)庫(kù)；DNA水平鑒別實(shí)驗(yàn)多需要新鮮嫩葉，操作容易受到樣品干擾并且在金線蓮?fù)瑢俨煌N的區(qū)分上存在難度，同時(shí)以往已有研究鑒別的混偽品相對(duì)較少，多集中于斑葉蘭、血葉蘭和臺(tái)灣銀線蘭，樣品具有局限性。

現(xiàn)代化學(xué)研究表明不同基原金線蓮植物的化學(xué)成分有差異[25]，高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜是一種建立的化學(xué)成分基礎(chǔ)上的綜合的、可量化的鑒定手段，能夠用于中草藥整體質(zhì)量控制的一種技術(shù)[26]。吳萍萍等[27]對(duì)齒唇蘭建立指紋圖譜并確定22個(gè)共有峰并成功用于銀線蓮的區(qū)分；隆林等[28]對(duì)興仁金線蓮進(jìn)行指紋圖譜建立，確定20個(gè)共有峰；秦朋[29]對(duì)金線蓮建立指紋圖譜并確定20個(gè)共有峰；黃可可[30]對(duì)6批次廣西金線蓮建立指紋圖譜，確定7個(gè)共有峰；張藏蔓等[31]建立了不同來(lái)源金線蓮的超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜指紋圖譜；陳瑩[32]建立組培、栽培、野生金線蓮HPLC指紋圖譜，比較了野生金線蓮與臺(tái)灣銀線蘭、血葉蘭的相似度，這些已有的金線蓮指紋圖譜，僅僅建立了自身的指紋共有峰，對(duì)于多種混偽品的區(qū)分不夠全面，缺乏化學(xué)計(jì)量學(xué)層面的真?zhèn)舞b別，尚未提出差異標(biāo)志物，并且指紋圖譜共有峰的指認(rèn)較少無(wú)法有效用于金線蓮的真?zhèn)舞b別。因此本研究基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的指紋圖譜法，對(duì)金線蓮及其混偽品進(jìn)行鑒別，為金線蓮鑒別和質(zhì)量控制提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 金線蓮樣品采自福建省多個(gè)金線蓮種植基地，其他混偽品于市場(chǎng)上收集，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物實(shí)驗(yàn)室范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師及生藥教研室黃澤豪教授鑒定，見(jiàn)表1和圖1；樣本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物標(biāo)本室。對(duì)照品水仙苷(純度：93.10%，批號(hào)：111997-201501)、蘆丁(純度：91.90%，批號(hào)：100080-201409)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(純度：90.80%，批號(hào)：112007-201602)、異槲皮苷(純度：92.9%，批號(hào)：111809-201403)、槲皮素(純度：97.30%，批號(hào)：100081-200406)、山柰酚(純度：95.5%，批號(hào)：110861-201611)、異鼠李素(純度：99.90%，批號(hào)：110860-201410)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；紫云英苷(批號(hào)：MUST-13022)、槲皮素3,7-二葡萄糖苷(批號(hào)：MUST-19023)、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O葡萄糖苷(批號(hào)：MUST-19072)和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷(批號(hào)：MUST-19778)均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98%。

1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，配置光電二極管陣列檢測(cè)器)；Welch Ultimate XB-C18色譜柱[4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技(上海)股份有限公司]；CPA225D型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500DE臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFY-500型500克搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；甲醇、乙醇和乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；Milli-Q超純水(美國(guó)Millipore公司)；其余試劑均為分析純。

表1 樣品信息表

A.金線蘭；B.長(zhǎng)片金線蘭；C.滇越金線蘭；D.麗蕾金線蘭；E.大花斑葉蘭；F.血葉蘭；G.臺(tái)灣銀線蘭；H.虎耳草圖1 金線蓮及其混偽品圖

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取槲皮素3,7-二葡萄糖苷2.46 mg、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O葡萄糖苷2.79 mg、蘆丁4.94 mg、異槲皮苷6.38 mg、山柰酚-3-O-蕓香糖苷1.94 mg、水仙苷4.69 mg、紫云英苷4.48 mg、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷4.32 mg、槲皮素5.48 mg、山柰酚5.15 mg和異鼠李素2.09 mg分別到10 mL量瓶中，加入40%甲醇進(jìn)行溶解并定容，精密吸取上述各對(duì)照品母液適量至20 mL量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液，濃度分別為24.6、27.9、24.7、12.76、19.4、93.8、89.6、43.2、10.96、10.3、10.9 μg·mL-1，供指紋峰定性比對(duì)使用。

1.2.2 供試品溶液制備 取金線蓮及其混偽品干燥全草粉碎，過(guò)60目篩，精密稱定0.25 g，置具塞三角瓶中，精密加入40%甲醇25 mL，稱定，在40 ℃、250 W功率下超聲處理15 min，放冷至室溫再稱量，40%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，0.22 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 色譜條件 采用Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-(0.1%甲酸)水(B)，梯度洗脫0～22 min，12%A→18%A；22～34 min，18%A→24%A；34～44 min，24%A→30%A；44～52 min，30%A→40%A；52～54 min，40%A→40%A；54～58 min，40%A→12%A；58～60 min，12%A→12%A，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)對(duì)樣品色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并計(jì)算各樣品的相對(duì)峰面積，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)樣品色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和主成分分析，然后使用SIMCA-P14.1軟件對(duì)金線蓮及其混偽品進(jìn)行OPLS-DA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn) 取同一批(S15)供試品，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以7號(hào)峰(水仙苷)為參照峰，測(cè)得16個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.04%～0.16%，相對(duì)峰面積RSD在1.06%～4.49%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批(S15)供試品，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以7號(hào)峰(水仙苷)為參照峰，測(cè)得16個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.17%～0.52%，相對(duì)峰面積RSD在0.82%～4.64%，表明重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批(S15)供試品，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件于0、3、6、12、18、24 h測(cè)定，以7號(hào)峰(水仙苷)為參照峰，測(cè)得16個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.17%～1.02%，相對(duì)峰面積RSD在0.76%～4.99%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 金線蓮指紋圖譜的建立及共有峰的鑒定 按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備17批供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得到17批金線蓮樣品HPLC指紋圖譜，見(jiàn)圖2。將其全部導(dǎo)入《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2012版)，設(shè)定S15為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗為0.3，多點(diǎn)矯正后生成共有模式圖，共確定16個(gè)共有色譜峰。通過(guò)與對(duì)照品圖譜對(duì)照，指認(rèn)其中11個(gè)色譜峰，即峰2為槲皮素3,7-二葡萄糖苷、峰3為異鼠李素-3-O-蕓香糖-7-O-葡萄糖苷、峰4為蘆丁、峰5為異槲皮苷、峰6為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、峰7為水仙苷、峰8為紫云英苷、峰9為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷，峰11為槲皮素、峰13為山柰酚、峰14為異鼠李素，以分離度較好、峰面積較大且保留時(shí)間適中的7號(hào)峰(水仙苷)為參照峰，分別計(jì)算17批金線蓮的共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2～3。

2.槲皮素3,7-二葡萄糖苷；3.異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O葡萄糖苷；4.蘆??；5.異槲皮苷；6.山柰酚-3-O-蕓香糖苷；7.水仙苷；8.紫云英苷；9.異鼠李素-3-O-葡萄糖苷；11.槲皮素；13.山柰酚；14.異鼠李素圖2 金線蓮的HPLC指紋圖譜及其16個(gè)共有峰

表2 17批金線蓮共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 17批金線蓮共有峰的相對(duì)峰面積

2.2.2 金線蓮指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 以17批樣品指紋圖譜共有模式為對(duì)照，計(jì)算各批次樣品相似度，結(jié)果見(jiàn)表4。S14～S17和S9的相似度為在0.851～0.899之間，其余批號(hào)相似度均大于0.9。

表4 17批金線蓮與對(duì)照指紋圖譜的相似度

2.2.3 指紋圖譜識(shí)別金線蓮混偽品 按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備金線蓮7種混偽品的供試品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得到相應(yīng)樣品的HPLC圖譜，并和17批次金線蓮得到的對(duì)照指紋圖譜一起全部導(dǎo)入《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2012版)，設(shè)定金線蓮對(duì)照指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗為0.3，進(jìn)行全峰匹配后計(jì)算相似度，結(jié)果見(jiàn)表5和圖3～4。

表5 金線蓮混偽品的相似度

S18～S25.臺(tái)灣銀線蘭；S26～S27.長(zhǎng)片金線蘭；S28～S29.滇越金線蘭；S30～S31.麗蕾金線蘭；S32～S47.血葉蘭；S48～S51.大花斑葉蘭；S52～S53.虎耳草圖3 金線蓮對(duì)照指紋圖譜與混偽品HPLC圖譜

A.金線蘭；B.臺(tái)灣銀線蘭；C.長(zhǎng)片金線蘭；D.滇越金線蘭；E.麗蕾金線蘭；F.血葉蘭；G.大花斑葉蘭；H.虎耳草圖4 金線蓮及其偽品對(duì)照指紋圖譜

2.3 聚類分析 以16個(gè)共有峰峰面積為變量，將金線蓮及其混偽品的峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，選擇平方歐式距離為測(cè)度進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)分類距離為16時(shí)，可分為2類，金線蓮聚為一類(S1～S17)，混偽品聚為一類(S18～S53)。金線蓮17批次中S1和S5～S14聚為一類(距離12)，然后與批次S15～S17聚為一類(距離15)，最后與批次S2～S4聚為一類(距離16)；混偽品中虎耳草(S52～S53)的距離最遠(yuǎn)，與血葉蘭(S32～S47)、臺(tái)灣銀線蘭批次(S20、S21、S24、S25)、臺(tái)灣銀線蘭批次(S18、S19、S22、S23)聚為一類(距離5)，然后和麗蕾金線蘭(S30～S31)聚為一類(距離7)，進(jìn)一步與大花斑葉蘭(S48～S51)聚為一類(距離8)；長(zhǎng)片金線蘭(S26～S27)和滇越金線蘭(S28～S29)聚為一類(距離10)。

圖5 金線蓮及其混偽品聚類分析樹狀圖

2.4 主成分分析 主成分分析是在盡可能保持原有數(shù)據(jù)信息的前提下，通過(guò)降維處理達(dá)到簡(jiǎn)化指標(biāo)的計(jì)量學(xué)方法。將所有樣品的16個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表6～7和圖6。由表6可知，提取特征值大于1的3個(gè)成分，其方差的累積貢獻(xiàn)率為79.82%，表明這3個(gè)成分能夠代表16個(gè)指標(biāo)在這批樣品中大部分的信息。由圖6可知，樣品被明顯分為兩類，一類為金線蓮，另一類為金線蓮的混偽品。載荷的絕對(duì)值越大，對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大，由表7可知，峰7(水仙苷)、峰8(為紫云英苷)、峰9(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷)和峰12在主成分1上有較高的載荷(載荷絕對(duì)值大于0.9)，該結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)、聚類分析結(jié)果基本一致。

表6 主成分分析特征值與貢獻(xiàn)率

表7 旋轉(zhuǎn)后公共因子載荷矩陣

圖6 主成分得分圖

2.5 OPLS-DA分析 正交偏最小二乘判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法。將金線蓮及其混偽品的16個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1軟件，進(jìn)行OPLS-DA，獲得相應(yīng)模型。

圖7 OPLS-DA得分散點(diǎn)圖(A)和VIP圖(B)

2.6 差異標(biāo)志物驗(yàn)證 采用HPLC法對(duì)所有批次的金線蓮及其混偽品進(jìn)行差異標(biāo)志物峰7(水仙苷)的含量測(cè)定[33]，結(jié)果見(jiàn)表8、圖9。

圖8 OPLS-DA模型置換驗(yàn)證圖

表8 金線蓮與混偽品的水仙苷含量

圖9 金線蓮及其混偽品的差異標(biāo)志物含量

3 討論

3.1 指紋圖譜條件優(yōu)化 在金線蓮混偽品中，大花斑葉蘭[34]和金線蓮?fù)瑢僦参稞X唇蘭[27]及興仁金線蓮[28]的指紋圖譜研究已有相關(guān)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)前期分別采用相同的液相條件對(duì)金線蓮和混偽品供試品進(jìn)行分析，結(jié)果部分色譜峰未能較好分離、后期基線漂移嚴(yán)重。因此對(duì)其色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，考察Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Welch Ultimate AQ-C18(4.6 mm×100 mm,3 μm)；Welch Ultimate Polar-RP(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×150 mm,2.7 μm)；Waters XSelect HSS T3(4.6 mm×250 mm,5 μm)；Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)等6根不同的色譜柱，在相同的液相條件下Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)能夠?qū)⒏髂繕?biāo)峰均分離開(kāi)，且分離度較好，最終優(yōu)選Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相通過(guò)比較甲醇-水，甲醇-0.1%甲酸水，乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水最佳；檢測(cè)波長(zhǎng)，經(jīng)DAD全波長(zhǎng)圖譜對(duì)比，同時(shí)考慮基線，發(fā)現(xiàn)360 nm下峰容量大，圖譜平穩(wěn)，因?yàn)檫x擇檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

3.2 金線蓮及其混偽品指紋圖譜分析 通過(guò)比較金線蓮混偽品與金線蓮對(duì)照指紋圖譜的相似度發(fā)現(xiàn)，所有混偽品的相似度均在0.8以下，其中與金線蓮?fù)瑢僦参锏呐_(tái)灣銀線蘭、長(zhǎng)片金線蘭、滇越金線蘭和麗蕾金線蘭的相似度在0.072～0.765，其他的混偽品血葉蘭、大花斑葉蘭和虎耳草的相似度均在0.2以下。通過(guò)比較各混偽品與金線蓮的16個(gè)共有峰發(fā)現(xiàn)，臺(tái)灣銀線蘭與金線蓮的差異主要在臺(tái)灣銀線蘭無(wú)峰4(蘆丁)、峰5(異槲皮苷)、峰6(山柰酚-3-O-蕓香糖苷)、峰8(紫云英苷)、峰13(山柰酚)和峰14(異鼠李素)；麗蕾金線蘭和金線蓮的差異主要在其無(wú)峰1、峰2(槲皮素3,7-二葡萄糖苷)、峰3(異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O葡萄糖苷)、峰8(紫云英苷)、峰10、峰11(槲皮素)、峰12、峰13(山柰酚)和峰14(異鼠李素)；滇越金線蘭和金線蓮的差異主要在其無(wú)峰1、峰2(槲皮素3,7-二葡萄糖苷)、峰5(異槲皮苷)、峰8(紫云英苷)、峰9(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷)、峰10、峰11(槲皮素)、峰12、峰13(山柰酚)和峰14(異鼠李素)；長(zhǎng)片金線蘭和金線蓮的差異主要在其無(wú)峰5(異槲皮苷)、峰8(紫云英苷)、峰9(異鼠李素-3-O-葡萄糖苷)、峰10、峰11(槲皮素)、峰12、峰13(山柰酚)和峰14(異鼠李素)；血葉蘭與金線蓮相比，血葉蘭中僅含有峰6(山柰酚-3-O-蕓香糖苷)和峰7(水仙苷)，且含量極低，其他14個(gè)峰均不含有；大花斑葉蘭與金線蓮相比，16個(gè)共有峰中僅含有峰4(蘆丁)；虎耳草與金線蓮相比，16個(gè)共有峰均不含有。

從聚類分析結(jié)果可以看出虎耳草科的虎耳草距離最遠(yuǎn)，與混偽品蘭科血葉蘭屬血葉蘭聚成一類，并且這一類中也包括了蘭科開(kāi)唇蘭屬的臺(tái)灣銀線蘭，然后與開(kāi)唇蘭屬的麗蕾金線蘭(S30～S31)聚為一類(距離7)，再與蘭科斑葉蘭屬的大花斑葉蘭(S48～S51)聚為一類(距離8)，最后與開(kāi)唇蘭屬的長(zhǎng)片金線蘭(S26～S27)和滇越金線蘭(S28～S29)聚為一類(距離16)，從混偽品的聚類來(lái)看，與金線蓮比較接近的混偽品為長(zhǎng)片金線蘭(S26～S27)和滇越金線蘭，該結(jié)果與相似度的評(píng)價(jià)結(jié)果也互相吻合，同時(shí)與以往的指紋圖譜研究相比[23,28]血葉蘭、臺(tái)灣銀線蘭、斑葉蘭確實(shí)從本次的結(jié)果來(lái)看確有明顯的區(qū)分，不同于金線蓮。因此指紋圖譜的聚類分析結(jié)果提示不同基原的混偽品成分與金線蓮不一致，食用或藥用均建議應(yīng)予以區(qū)分使用

3.3 金線蓮及其混偽品的PCA和OPLS-DA分析 經(jīng)化學(xué)計(jì)量學(xué)聚類分析，分類距離為16時(shí)即分為2類，金線蓮聚為一類，混偽品聚為一類，與相似度結(jié)果基本一致；經(jīng)化學(xué)計(jì)量學(xué)PCA的分析前3個(gè)主成分方差的累積貢獻(xiàn)率為79.82%，3個(gè)主成分分別為水仙苷、紫云英苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷；經(jīng)化學(xué)計(jì)量學(xué)正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，經(jīng)VIP統(tǒng)計(jì)，篩選出1個(gè)差異標(biāo)志峰，為水仙苷，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定驗(yàn)證，金線蓮中水仙苷含量顯著高于其混偽品。17批次金線蓮的水仙苷含量在1 098～1 528 μg·g-1，8批次臺(tái)灣銀線蓮則僅3批次含有水仙苷，其水仙苷含量在15～50 μg·g-1，長(zhǎng)片金線蘭的水仙苷含量在356.67～360.41 μg·g-1；滇越金線蘭的水仙苷含量在281.29～286.56 μg·g-1；麗蕾金線蘭的水仙苷含量在378.75～379.96 μg·g-1；16批次血葉蘭中10批未檢測(cè)到水仙苷，其余6批含量在132～208 μg·g-1；大花斑葉蘭水仙苷含量在29.23～36.04 μg·g-1，虎耳草中未檢測(cè)到水仙苷。

綜上，本研究采用HPLC指紋圖譜結(jié)合相似度評(píng)價(jià)以及化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)金線蓮及其混偽品進(jìn)行鑒別，并篩選出差異標(biāo)志物水仙苷，該方法能夠較好地區(qū)分金線蓮的7種混偽品：臺(tái)灣銀線蓮、長(zhǎng)片金線蘭、滇越金線蘭、麗蕾金線蘭、血葉蘭、大花斑葉蘭和虎耳草，為金線蓮的質(zhì)量控制提供參考。