甜瓜細菌性果斑病病菌鑒定及不同材料抗病性測定

劉夢華 盧霞 李騰

摘要 為明確近幾年江蘇地區(qū)甜瓜葉片及瓜上發(fā)生的某一細菌性病害，以江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司設(shè)施大棚中甜瓜發(fā)病葉片為研究對象，經(jīng)分離純化得到菌株LG08，觀察病菌形態(tài)初步判定該病原菌為甜瓜細菌性果斑病菌，為進一步明確該病菌，分別用4對細菌性果斑病菌通用標記（BX、BX-S、ERC和WFB）、3對甜瓜細菌性果斑病菌特異性標記（AcM380、AcM797、AcM13）及16S測序進行分析。結(jié)果表明，菌株LG08為燕麥嗜酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp.citrulli）。苗期和坐果期對西甜瓜部分材料接種菌株LG08，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株LG08對西甜瓜都有致病性。該研究不僅有利于進一步了解甜瓜細菌性果斑菌的特性，為果斑病的防治提供參考，而且也有助于甜瓜抗病品種的選育。

關(guān)鍵詞 甜瓜;細菌性果斑病菌;分離純化;抗病材料

Abstract To identify the pathogen causing leaves and fruits disease in melon these years in Jiangsu Province， diseased materials were sampled from solar greenhouse of Jiangsu Greenport Modern Agriculture Development Co.， Ltd.. In this study，the isolated pathogen named LG08 was purified and initially identified as melon Bacterial Fruit Blotch （BFB） pathogen based on its colonies morphological characterization. Further， four pairs of commonly used BFB markers BX， BX-S， ERC and WFB as well as three pairs of melon specific BFB markers AcM380， AcM797 and AcM13 were used for molecular characterization. In addition， DNA sequencing of LG08 was performed based on 16S amplified fragments. Together， LG08 was ultimately confirmed as a strain of Acidovorax avenae Subsp. citrulli（Aac）. It was found that LG08 was pathogenic to melon and watermelon upon inoculating it to some of their plants materials during seedling and fruit setting period. This study not only helps to more understanding the characteristics of BFB， but also provides resistant lines to melon breeding program while constituting a reference for the prevention and treatment of BFB.

Key words Melon;Bacterial fruit blotch;Isolation and purification;Resistant materials

甜瓜（Cucumis melo）為葫蘆科甜瓜屬一年生蔓性草本植物，是我國最早利用為果品的瓜類[1]，世界各地廣泛栽培，我國甜瓜栽培面積也在逐漸增加，但隨著全球氣候變暖及設(shè)施大棚的普及，甜瓜病害的種類也逐年增多，其中細菌性果斑病對甜瓜的危害特別嚴重，造成甜瓜大范圍的減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。該病最早于1969年在佛羅里達州發(fā)現(xiàn)[2]。1978年Schaad等[3]將其病原菌鑒定為西瓜燕麥嗜酸菌（Acidovorax citrulli）。劉丹丹等[4]通過在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)該病原菌48 h后觀察其形態(tài)呈圓形，直徑1～2 mm，乳白色、半透明、光滑菌落。李俊閣等[5]對甜瓜苗期接種果斑病菌，發(fā)現(xiàn)該病害發(fā)病初期子葉出現(xiàn)水漬狀病斑，從葉脈開始發(fā)展直至葉片失綠，病斑周圍有黃色暈圈或壞死。于海博等[6]在遼寧西甜瓜上也發(fā)現(xiàn)細菌性果斑病，該病害不僅危害西甜瓜葉片，而且也危害果實，在葉片上初期為水漬狀病斑，后逐漸壞死且病斑周圍有黃色暈圈;果實感病時，初期呈綠褐色水漬狀病斑，隨后病斑擴大病菌侵入果肉組織造成水浸狀、褐腐或木栓化。2016年Eckshtain-Leiv等[7]在以色列甜瓜上發(fā)現(xiàn)細菌性果斑病菌株M6。2019年P(guān)ark等[8]在韓國西瓜上也發(fā)現(xiàn)了該細菌性果斑病菌株KACC17005。

我國海南[9]、新疆[10]、內(nèi)蒙古[4]、山東[11]等地區(qū)也都在西甜瓜上發(fā)現(xiàn)并分離出該病原菌，但江蘇地區(qū)很少報道。甜瓜細菌性果斑病具有發(fā)病迅速、傳播速度快、暴發(fā)性強、防病難等特點，已成為影響我國瓜類生產(chǎn)的主要病害之一，對甜瓜生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失，該病原菌可通過傷口和氣孔侵染瓜類子葉和果實，高溫高濕極易發(fā)病[4]，一旦發(fā)病將難以控制，如何有效地防治細菌性果斑病成為生產(chǎn)中的重中之重。目前我國主要通過化學藥劑防治細菌性果斑病，但使用的大部分農(nóng)藥效果不是很理想，且對環(huán)境污染較大，容易產(chǎn)生抗藥性[5]，所以篩選果斑病抗性品種是廣大育種工作者目前亟待解決的問題。

隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展，許多用于細菌種類鑒定的分子標記被開發(fā)。利用這些分子標記能夠快速、準確地檢測和鑒定該病原菌，韓盛等[10]使用擴增細菌ITS序列的通用引物L1/L2證實引起新疆甜瓜發(fā)病的7個病原菌均為嗜酸菌燕麥西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli），吉訓聰?shù)萚9]使用細菌通用引物16S rDNA將甜瓜菌株鑒定為嗜酸菌燕麥西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp citrulli Willems）。2008年Bahar等[12]用 3對分子標記BX、BX-S、ERC鑒定葫蘆科細菌性果斑病菌;2014年Walcott等[13]用分子標記WFB鑒定細菌性果斑病菌。2019年Islam等[14]用3對分子標記AcM380、AcM797和AcM13鑒定甜瓜細菌性果斑病菌。筆者以發(fā)病甜瓜葉片為研究對象，通過病菌分離純化、形態(tài)學觀察、分子標記檢測及16S rRNA基因測序分析等方法，鑒定所分離的甜瓜葉片病原菌，并通過致病性接種檢測試驗篩選出抗病的甜瓜種質(zhì)資源，為甜瓜育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 甜瓜細菌性果斑病標本的采集。2020年3月在江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司（簡稱：江蘇綠港）拱棚采集病葉帶回實驗室進行分離純化。

1.1.2 西甜瓜材料。哈密瓜類7份，玉菇類19份，羊角脆類型10份，厚皮甜瓜10份，薄皮甜瓜4份，西瓜4份材料均由江蘇綠港育種研究所提供。供試材料定植于單棟拱棚，依照江蘇綠港西甜瓜作物栽培管理標準體系進行栽培管理。

1.1.3 培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)用KMB固體培養(yǎng)基（20 g胰蛋白胨、1.5 g硫酸鎂、10 g丙三醇、10 g瓊脂、3 g磷酸氫二鉀，定容至1 000 mL，pH=7）。

搖菌用NB液體培養(yǎng)基（3 g牛肉膏、5 g蛋白胨，定容至1 000 mL，pH=7）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離、純化。將采集的病葉用自來水沖洗病斑表面、晾干，在生物安全柜中用已滅菌的剪刀將葉片病健交界處組織剪至2～3 mm片段，先用70%乙醇沖洗20 s、無菌水沖洗30 s，重復3次，晾干。將葉片組織放在KMB固體培養(yǎng)基上，每皿5～6片組織，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用10 μL滅菌的槍頭挑取葉片邊緣的菌落至新的KMB固體培養(yǎng)基上，劃線培養(yǎng)，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，選取單菌落進行純化培養(yǎng)，挑單菌落至加入氨芐抗生素的KMB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，如此重復3次，挑取單菌落至加入氨芐抗生素的NB液體培養(yǎng)基中搖菌，置于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將純化后的菌株保存在冰箱（4 ℃）中待用。

1.2.2 病原菌形態(tài)觀察。將分離純化后的菌株接種于KMB培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)、大小、透明度及表面光滑程度等性狀。

1.2.3 病原菌PCR檢測。PCR 擴增時采用的反應體系為25 μL 體系，其中菌液2 μL，2×Taq MasterMix（Dye）12.5 μL，正反引物各1 μL，加入滅菌的超純水至25 μL;PCR反應程序：94 ℃預變性2 min;然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s;最后延伸 2 min，置于4 ℃保存。PCR檢測時引物（表1）為4對細菌性果斑病菌通用標記（BX、BX-S、ERC和WFB）及3對甜瓜細菌性果斑病菌特異性標記（AcM380、AcM797、AcM13）。PCR產(chǎn)物在加有溴化乙錠（EB）的2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳緩沖液為1× TAE緩沖液，電壓為150 v。電泳結(jié)束后在凝膠成像分析儀中觀察電泳條帶，在365 nm波長下分析DNA電泳條帶大小，掃描圖像并保存。

1.2.4 16S rRNA擴增及基因測序分析。用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對分離病菌進行PCR 擴增。PCR反應體系（25 μL）：菌液2.0 μL，2×Taq MasterMix（Dye）12.5 μL，正反引物各1.0 μL，加入滅菌的超純水至25 μL;PCR反應程序：94 ℃預變性2 min;然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s;最后延伸 2 min。反應結(jié)束后，吸取10 μL在2%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測。

用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，與pMD-19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。篩選陽性克隆，PCR法鑒定是否含有外源目標插入片段，將含有目標DNA的轉(zhuǎn)化子進行測序，測序工作由杭州尚亞塞生物技術(shù)有限公司完成。利用DNAMAN7生物信息學軟件對獲得的序列進行比對。

1.2.5 致病性測定及甜瓜材料抗性鑒定。將分離純化的菌株在NB液體培養(yǎng)基中搖菌48 h，待搖渾后，將菌株配成1×108 CFU/mL的菌懸液。隨機選取50份甜瓜材料、4份西瓜材料進行致病性測定和甜瓜抗性試驗，每份材料播種7粒，兩葉一心定植，甜瓜和西瓜緩苗結(jié)束后，在苗齡為4～6葉期時，將菌懸液用噴霧法接種至西甜瓜葉片上，以無菌水噴霧作對照。接種后加大棚內(nèi)的溫濕度，隔3～7 d觀察記錄發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

江蘇綠港甜瓜田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，感病甜瓜初期葉片出現(xiàn)不規(guī)則褐色斑點，葉脈先發(fā)病逐漸向整個葉片蔓延;果實癥狀比較明顯，初期出現(xiàn)水漬狀病斑，逐漸擴大成水漬狀大斑，侵入果肉引起果肉腐爛（圖1 a和b）。

2.2 菌株形態(tài)特征

將所采病樣1份經(jīng)3次單菌落的分離純化，通過菌落形態(tài)觀察，結(jié)果得到1株菌株，編號為LG08。菌株在KMB培養(yǎng)基上形成多菌落，且菌落形態(tài)單一。菌落呈凸狀，光滑至略帶顆粒，乳白色，邊緣帶半透明（圖1c）。

2.3 分子鑒定

為了明確分離得到的菌株LG08是否是瓜類細菌性果斑病，利用4對細菌性果斑病通用標記BX、BX-S、ERC、WFB對菌株LG08進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分別擴增出476、279、342、360 bp的條帶（圖1d），且?guī)颓逦摻Y(jié)果與之前報道的結(jié)果一致，表明菌株LG08為細菌性果斑病菌。為了進一步驗證其是否為甜瓜細菌性果斑病菌，利用3對甜瓜細菌性果斑病特異性標記AcM 380、AcM 797、AcM 13對菌株LG08進行PCR擴增，其結(jié)果與之前文獻報道的結(jié)果一致，同樣擴增出了大小分別為853、938、724 bp清晰片段（圖1e）。

2.4 16S rRNA基因測序分析

對菌株LG08的16S rDNA序列進行PCR擴增，獲得了1 571 bp的PCR產(chǎn)物（圖1d），將PCR產(chǎn)物回收測序，測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），菌株LG08與已報道的燕麥嗜酸菌西瓜亞種具有高度同源性，即與KACC17005[8]序列同源性達99.80%，與AAC00-1[15]和M6[7]序列同源性高達99.87%;說明菌株LG08也屬于燕麥嗜酸菌西瓜亞種（A.avenae subsp.citrulli）。

2.5 病原菌的致病性鑒定及甜瓜抗性鑒定 將菌株LG08分別在苗期和坐果期接種到西甜瓜上，5 d后觀察西甜瓜葉片均有發(fā)病，且發(fā)病癥狀與上述描述的甜瓜細菌性果斑病的癥狀一致（圖2）。再次對西甜瓜發(fā)病葉片和果實進行分離純化，得到與菌株形態(tài)特征相同的菌株，表明菌株LG08可能為細菌性果斑病病原菌。

由表2可知，在所有供試甜瓜類型中發(fā)病情況有明顯的差別。哈密瓜類型的10份材料90%都表現(xiàn)出感病;玉菇類的19份材料中，有12份表現(xiàn)出不同程度的抗病情況，7份表現(xiàn)感病，有可能因為這7份感病材料與其他12份玉菇類的材料無親緣關(guān)系;羊角脆類型的7份材料中，5份表現(xiàn)出不同程度的抗病性，2份表現(xiàn)出感病，這主要是由于個體存在差異性;其他4份薄皮甜瓜均表現(xiàn)出抗性?？傮w而言，甜瓜薄皮系列、玉菇類具有較強的抗性，哈密瓜類型比較容易感病。由于厚皮甜瓜類型多，控制甜瓜性狀的基因也多，其抗感性不易確定。

3 結(jié)論與討論

甜瓜細菌性果斑病主要侵染甜瓜的植株、果實和種子，造成苗期死亡或者果實腐爛等嚴重現(xiàn)象，對甜瓜育種及生產(chǎn)者造成巨大的影響。該研究采集江蘇綠港疑似甜瓜細菌性果斑病病葉1份，對其進行分離純化，獲得1株菌株LG08。

用7對細菌性果斑病相關(guān)標記BX、BX-S、ERC、WFB、AcM380、AcM797及AcM13對菌株LG08進行PCR擴增檢測，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，均顯示出清晰條帶，且經(jīng)16S rDNA測序分析結(jié)果表明該菌株LG08與之前西瓜上分離出的ACC00-1、KAC17005菌株和甜瓜上分離出的M6菌株均具有高度的同源性。將分離純化得到的菌株LG08回接到健康甜瓜、西瓜幼苗上。接種結(jié)果表明，該菌株LG08能引起健康甜瓜、西瓜植株發(fā)病。筆者對接種后發(fā)病西甜瓜植株葉片再次分離純化，得到與菌株LG08在菌落形態(tài)等方面一致的菌株，且發(fā)病葉片癥狀與田間發(fā)病癥狀相同，由此確定該菌株LG08可能是引起江蘇地區(qū)西甜瓜的細菌性果斑病菌。Islam等[14]利用其自主開發(fā)的3對甜瓜細菌性果斑病特異的標記AcM 380、AcM797和AcM13對甜瓜菌株NIHHS15-280和KACC18782進行PCR擴增檢測，發(fā)現(xiàn)其能擴增出清晰的目標片段，田間接種甜瓜、西瓜等材料，結(jié)果只在甜瓜上發(fā)病，而在西瓜上不發(fā)病，因此Islam等[14]認為菌株NIHHS15-280和KACC18782對甜瓜具有高度毒性而對西瓜基本無毒性。Islam等[14]用同樣的3對標記對2株西瓜菌株ACC00-1、KAC17005也進行了PCR擴增，未擴增出目標條帶。而該研究發(fā)現(xiàn)，用3對Islam等[14]開發(fā)的標記AcM 380、AcM79、AcM13對LG08進行PCR擴增，均擴增出了目標片段，且與Islam等[14]從甜瓜上分離菌株NIHHS15-280和KACC18782擴增的條帶大小相同，且田間接種試驗表明該菌株LG08不僅能侵染甜瓜而且能引起西瓜發(fā)病。該研究利用標記16S僅對保守細菌基因進行測序，而不是對整個基因組進行測序，因此序列相似性結(jié)果可能會產(chǎn)生偏差，從而影響序列分析的可靠性。將PCR檢測、16S序列分析以及田間致病性結(jié)果綜合起來，菌株LG08可能與菌株NIHHS15-280和KACC18782相同或存在差異。另外，試驗條件和材料背景也可能會影響菌株的致病性。

為了篩選抗細菌性果斑病的甜瓜種質(zhì)資源，該研究對50份甜瓜材料接種菌株LG08進行致病性檢測，觀察苗期發(fā)病情況。在供試的甜瓜材料中，甜瓜類型與抗性之間存在一定差異，哈密瓜類比較容易感病;玉菇類甜瓜總體上都表現(xiàn)出一定的抗病性，羊角脆類甜瓜中70%抗病，其中有2份材料表現(xiàn)感病，可能因為個體的差異性。由于環(huán)境及設(shè)施條件可能達不到菌株最適宜的生長環(huán)境，抗感材料觀察結(jié)果可能會有一定的誤差，后期會進一步克服外界因素，進行大規(guī)模甜瓜抗性篩選試驗。該研究可為甜瓜細菌性果斑病抗病基因QTL定位奠定基礎(chǔ)，將來可以選取更多甜瓜材料，包括該研究中已選擇的材料，設(shè)計3種不同的甜瓜栽培模式（露地栽培、日光溫室栽培和拱棚栽培），進行大規(guī)模的甜瓜抗性篩選試驗。

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