二甲雙胍對(duì)非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬的影響

吳曉曼，張敏，田甜，李明，廖星晨，譚詩(shī)云

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是全世界慢性肝病的最常見原因，據(jù)估計(jì)，世界上有24%的人口患有NAFLD，到2030年，美國(guó)將有大約1億人患有NAFLD[1]。NAFLD的階段范圍從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)，進(jìn)一步可能發(fā)展為肝硬化，導(dǎo)致肝功能衰竭需要肝移植，甚至最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌[2]。NAFLD近年來(lái)大多共識(shí)為一種代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制多與脂肪代謝有關(guān)，肝細(xì)胞三酰甘油(TG)積累是NAFLD的標(biāo)志，在肝細(xì)胞中由于過(guò)多的脂質(zhì)蓄積可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)與自噬的變化[3-4]。在NAFLD發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，代謝因素(如胰島素抵抗、糖毒性和脂毒性等)、遺傳因素和其他因素促成NAFLD與2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病呈現(xiàn)相關(guān)性，患者存在T2DM增加了NAFLD進(jìn)一步發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)[5]。而二甲雙胍作為一種雙胍類降糖藥物，已被用于治療2型糖尿病超過(guò)60年[6-7]。在近期的研究中[8]，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可抑制高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)的肝脂肪變性。本研究利用游離脂肪酸(FFA)建造NAFLD細(xì)胞模型并用二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步研討ERS與自噬的調(diào)控機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株HepG2由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供。(2)試劑試藥：二甲雙胍購(gòu)于美國(guó)MCE(HY-17471A)，Gibco DMEM/H培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青公司。棕櫚酸(palmitic acid, PA)(P0500)、油酸(oleic acid, OA)(O1383)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自biosharp公司，無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購(gòu)自上海翊圣公司。兔抗RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶 (RNA-dependent protein kinase-like ER eukaryotic initiation factor-2α kinase, PERK)抗體、兔抗激活作用轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)抗體、兔抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light 3，LC3)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，兔抗P62抗體、鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)proteintech公司，兔抗磷酸化PERK抗體購(gòu)自北京博奧森公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-2301)購(gòu)自北京中杉金橋公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(BS12478)購(gòu)自美國(guó)bioworld公司。(3)儀器設(shè)備：THERMOHeracellVIOS 160i/250i CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Thermo Scientific公司)，Bio-Rad imark 全自動(dòng)酶標(biāo)儀、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)ChemiDocTMXRS+、OLYMPUS IX71顯微鏡、垂直層流潔凈工作臺(tái)(青島海爾公司)，XB70-FZ制冰機(jī)(GRANT公司)，XSR205微量稱重臺(tái)(METTLER TOLEDO公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年7—11月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化系統(tǒng)疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 FFA配置：以配置FFA 6 ml(OA︰PA=2︰1)為例，先稱量無(wú)脂肪酸BSA 1.2 g加入PBS 2.5 ml高速離心助溶后配至3 ml，配置成40%無(wú)脂BSA淡黃色澄清溶液。取NaOH 0.04 g，溶解于去離子水10 ml中，配成0.1 mol/L NaOH溶液10 ml，取NaOH溶液3 ml依次加入PA 10.24 mg、OA 25.38 μl配置40 mmol/L FFA，置于75℃水浴進(jìn)行充分皂化約30 min得到澄清液體。將其與BSA 3 ml迅速混合，可在50 ℃以下助溶，得到20 mmol/L FFA溶液6 ml為母液，4 ℃保存。

1.2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)：將凍存的HepG2細(xì)胞置于37 ℃恒溫水浴中約1 min內(nèi)迅速解凍，離心5 min后去除凍存液，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基重懸之后移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，3～4 d傳代1次。傳代操作如下：棄去培養(yǎng)基，PBS 3～4 ml清洗2次，加入胰酶1～2 ml，置于培養(yǎng)箱中消化1～2 min，倒置顯微鏡下觀察，若細(xì)胞大部分變圓分散，則在培養(yǎng)瓶中加入與胰酶等量含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞后離心棄上清，以1∶3比例傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 NAFLD細(xì)胞造模及分組：取合適數(shù)量的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞接種于孔板中，分為4組：對(duì)照組(BSA組)、模型組(FFA組)、二甲雙胍低濃度組(Met L組)、二甲雙胍高濃度組(Met H組)。隔夜觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，進(jìn)行藥物干預(yù)。二甲雙胍先用去離子水配置500 mmol/L 母液，-20 ℃保存。Met L組和Met H組分別采用二甲雙胍1、10 mmol/L終濃度進(jìn)行預(yù)處理1 h，然后FFA、Met L、Met H組分別加入等量FFA進(jìn)行干預(yù)，使FFA作用濃度為1 mmol/L，BSA組加入與FFA等量的BSA，作用24 h后結(jié)束NAFLD細(xì)胞造模及藥物處理進(jìn)行其他檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,以5 000/孔的密度接種于96孔板中，每孔含 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基100 μl，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用PBS清洗1遍加入新的培養(yǎng)基100 μl，并分別以0、10、20、40、80 mmol/L濃度的Met處理細(xì)胞,空白對(duì)照組加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)基,放回孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基和 CCK-8試劑10 μl，于37℃恒溫箱中避光孵育1.5 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=[(干預(yù)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.3.2 Western-blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中,每孔加入DMEM 2 ml完全培養(yǎng)基37℃恒溫箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分組加入藥物干預(yù)24 h后, PBS洗滌3遍。按照RIPA∶磷酸酶抑制劑∶PMSF=100∶2∶1配置裂解液，每孔加入配置好的裂解液100 μl，冰上裂解10 min，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞進(jìn)行超聲裂解，然后于4℃離心取上清加入loading buffer，100℃煮沸10 min。BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)得濃度調(diào)整上樣量。將蛋白樣品加入十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)膜結(jié)束后的PVDF膜取出，轉(zhuǎn)入含5%脫脂奶粉的TBST中封閉60 min。分別孵一抗，稀釋比1∶1 000，4℃過(guò)夜，回收一抗，加入TBST洗滌5次，每次10 min，二抗稀釋比1∶2 500，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。用ECL 化學(xué)發(fā)光液浸潤(rùn)1 min，于凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像。

1.3.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATF4基因表達(dá)水平：細(xì)胞接種及分組同上，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞提取總RNA，計(jì)算出RNA濃度，按試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA，并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)ATF4表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)條件為95 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)。ATF4正向引物為5'-GTCCTGTCCTCCACTCCAGATC-3'，反向引物為5'-TGGGCTCATACAGATGCCACT-3'；GAPDH正向引物為5'-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3'，反向引物為5'-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'。目的基因擴(kuò)增用ΔΔCT法計(jì)算，A=CT(目的基因, 實(shí)驗(yàn)樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因, 實(shí)驗(yàn)樣本)，B=CT(目的基因, 對(duì)照樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因, 對(duì)照樣本)，K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K。

2 結(jié) 果

2.1 二甲雙胍對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 采用不同濃度(0、10、20、40、80 mmol/L)二甲雙胍干預(yù)HepG2細(xì)胞24 h后,檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果顯示，相同時(shí)間范圍內(nèi),不同濃度的二甲雙胍對(duì)HepG2細(xì)胞活力的抑制隨劑量升高而增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F/P=1 759.000/0.000)，見圖1。

圖1 不同濃度的二甲雙胍對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

2.2 各組HepG2細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)比較 Western-blot結(jié)果顯示，與BSA組比較，F(xiàn)FA組PERK磷酸化程度明顯升高 (t/P=3.273/0.029)；與FFA組比較， Met L組和Met H組PERK磷酸化程度降低 (F/P=70.310/0.000)；與Met L組比較，Met H組PERK磷酸化程度降低更明顯(t/P=6.402/0.000)，見圖2。

圖2 各組PERK磷酸化程度比較

Western-blot結(jié)果顯示，與BSA組比較，F(xiàn)FA組ATF4蛋白表達(dá)水平明顯升高 (t/P=47.290/0.000)；與FFA組比較，Met L組和Met H組ATF4表達(dá)水平降低 (F/P=995.600/0.000)；與Met L組比較，Met H組ATF4表達(dá)水平降低更明顯(t/P=25.590/0.000)，見圖3。

圖3 各組ATF4蛋白表達(dá)比較

2.3 各組HepG2細(xì)胞ATF4 mRNA表達(dá)比較 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，與BSA組比較，F(xiàn)FA組ATF4 mRNA水平明顯增高 (t/P=13.730/0.000);與FFA組比較,Met L組和Met H組ATF4 mRNA表達(dá)水平均降低(F/P=66.960/0.000)；與Met L組比較，Met H組ATF4 mRNA表達(dá)水平降低(t/P=3.511/0.048)，見圖4。

圖4 各組HepG2細(xì)胞ATF4 mRNA表達(dá)比較

2.4 各組HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬水平比較 通過(guò)Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白p62和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)情況，與BSA組比較，F(xiàn)FA組p62蛋白表達(dá)升高(t/P=16.190/0.000)，LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)降低(t/P=17.980/0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與FFA組比較， Met L組和Met H組細(xì)胞p62蛋白顯著降低(F/P=106.700/0.000)，而細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白比例顯著升高(F/P=166.400/0.000)。且與Met L組比較，Met H組LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白比例升高(t/P=3.474/0.028)，見圖5。

圖5 二甲雙胍對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬水平的影響

3 討 論

二甲雙胍屬于雙胍類藥物，是目前臨床首選降糖藥，主要通過(guò)減少肝臟葡萄糖的輸出和改善外周胰島素抵抗而降低血糖[9]。有研究表明[10]，二甲雙胍在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠中可明顯降低凋亡水平，說(shuō)明二甲雙胍具有治療非酒精性脂肪性肝病的潛力。為進(jìn)一步探討二甲雙胍作用于非酒精性脂肪性肝病的體外作用機(jī)制， 應(yīng)用CCK8法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞活力的影響。本結(jié)果篩選出對(duì)細(xì)胞影響最小的濃度范圍，選擇1、10 mmol/L的二甲雙胍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，二甲雙胍可劑量依賴性地降低HepG2細(xì)胞活力，與Guo等[11]研究結(jié)果一致。

研究表明，F(xiàn)FA可引起肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，ERS水平升高[12-14]。ERS是指由于細(xì)胞受到外界刺激或自身某些變化因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生非折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(unfolded protein response,UPR)，進(jìn)而消除和避免未折疊蛋白質(zhì)的進(jìn)一步積累，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。ERS有3條經(jīng)典的信號(hào)通路：PERK、IRE1α和ATF6，當(dāng)ERS被激活時(shí)，這3種蛋白分別活化并進(jìn)一步激活下游的信號(hào)分子傳遞信號(hào)[15-16]。其中PERK通路被證實(shí)參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[17]，在本實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步證實(shí)其下游信號(hào)分子ATF4參與FFA建造的NAFLD細(xì)胞模型的疾病發(fā)展機(jī)制。PERK通過(guò)自身磷酸化被激活，進(jìn)一步磷酸化eIF2α，然后ATF4水平上升進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。自噬存在3種不同類型，分別為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)。廣義自噬多指巨自噬，指在細(xì)胞內(nèi)形成包裹部分細(xì)胞老化細(xì)胞器或碎片的雙膜囊泡，即自噬體，自噬體與溶酶體結(jié)合使其包裹內(nèi)物質(zhì)降解，是細(xì)胞自我消化的一種方式[18-19]。Song等[20]研究表明，ERS下游PERK信號(hào)通路參與誘導(dǎo)自噬，但本研究中FFA組誘導(dǎo)ERS PERK信號(hào)通路激活且下游ATF4同樣被激活，與BSA組比較，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，自噬水平降低。LC3有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2種分子形式，發(fā)生自噬時(shí)，溶質(zhì)形式的LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺綴合形成LC3Ⅱ，隨后被募集到自噬體膜中，是自噬的特異性標(biāo)志[21]。最近的研究表明[22]，高脂飲食喂養(yǎng)建造的NAFLD小鼠模型中，自噬水平降低，在體外實(shí)驗(yàn)中也證明棕櫚酸干預(yù)會(huì)使自噬通量受阻，與本研究結(jié)果一致。ERS與自噬之間的相互作用在不同的疾病或模型中有所不同，在NAFLD模型中，多出現(xiàn)ERS水平上升及自噬受阻。

本研究也進(jìn)一步證實(shí)了二甲雙胍在NAFLD模型中對(duì)ERS的影響，這與Chen等[23]研究一致，二甲雙胍可降低癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)誘導(dǎo)的ERS水平，通過(guò)PERK-eIF2α-C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP/GADD153)信號(hào)通路可直接減少SE模型中的凋亡水平。在NAFLD模型中二甲雙胍也可影響ERS PERK信號(hào)通路，且在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步說(shuō)明其下游分子ATF4也受二甲雙胍調(diào)控。無(wú)論在何種細(xì)胞內(nèi)，二甲雙胍均可激活腺苷酸活化蛋白激酶，AMPK作為一種已知的細(xì)胞代謝傳感器,參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)[24]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是自噬調(diào)節(jié)的重要信號(hào)分子，而AMPK的激活可抑制mTOR[25]。Hu等[24]研究表明，二甲雙胍可調(diào)控mTOR信號(hào)通路，而mTOR信號(hào)通路也可進(jìn)一步負(fù)調(diào)控自噬。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二甲雙胍組可明顯增加因FFA降低的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值，且自噬相關(guān)蛋白p62水平明顯降低，說(shuō)明二甲雙胍可恢復(fù)因FFA脂毒性降低的自噬水平，可能有助于進(jìn)一步減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

綜上所述，二甲雙胍可有效保護(hù)肝細(xì)胞免受FFA的脂毒性，緩解其ERS并增強(qiáng)自噬水平，對(duì)NAFLD有潛在的治療作用。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

吳曉曼、張敏：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；田甜、李明：分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；廖星晨：資料搜集整理；譚詩(shī)云：課題設(shè)計(jì)，論文終審