加壓溶劑萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定植物源性食品中的氟吡菌胺

張振洋

(英格爾檢測技術服務(上海)有限公司， 上海 201109)

0 引言

氟吡菌胺(fluopicolide)，化學名稱為 2,6-二氯-N-[(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶基)甲基]苯甲酰胺(結構式見圖1[1])，是由德國拜耳作物科學公司開發(fā)的苯甲酰胺類殺菌劑，該產品具有優(yōu)良的系統(tǒng)傳導性和較強的薄層穿透力，對病原菌各主要形態(tài)均有較好的抑制作用，能夠為新葉、莖干、塊莖、幼果提供全面和持久保護，主要應用于葡萄和蔬菜種植中，對霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等常見卵菌綱病害具有良好防效，而對作物和環(huán)境則相對安全[2-5].

圖1 氟吡菌胺的化學結構式

目前，氟吡菌胺已在世界范圍內被廣泛應用于蔬菜、水果和糧作物的疾病防治[6]. 植物源性食品中氟吡菌胺的殘留檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法[7]和氣相色譜-串聯(lián)質譜法[6-9]，前處理一般采用的是農產品檢測快速樣品前處理技術(簡稱QuEChERS)[10]，固相萃取[11]、液液萃取[12]和分散固相萃取[6-8]，后兩種前處理法屬于傳統(tǒng)前處理方法，費時且消耗大量的有機試劑；QuEChERS[13]前處理法雖在時間上比傳統(tǒng)的固相萃取、液-液萃取和分散固相萃取[14]有優(yōu)勢，有機試劑消耗少，但是QuEChERS法是在非密閉條件下進行，且萃取液無法濃縮處理；使用QuEChERS 前處理法對植物性樣品中的色素是無法去除的，大濃度的色素對后續(xù)質譜分析會產生一定的影響. 同時，在前處理過程中需要加入凝膠滲透色譜(GPC)粉，GPC粉用量對目標物質的影響目前尚未有詳細的研究。另外，對于含水量低或者脂肪含量高的樣品，凈化效果不理想，提取效率低、凈化過程損失大.

本研究建立了一種以乙腈為萃取劑，在密閉條件下采用加壓溶劑萃取，結合高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定植物源性食品中氟吡菌胺殘留量的分析方法。該方法具有前處理簡單、萃取率高、檢出限低、準確度和精密度高等優(yōu)點.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑Agilent 1290 Infinity Ⅱ/6460 Triple Quad LC-MS/MS高效液相色譜-三重四級桿質譜聯(lián)用儀，配AJS ESI離子源；電子天平(Sartorius，BT25S)：德國賽多利斯公司，感量為0.1 mg；快速萃取儀：E-916型(BUCHI Labortechnik AG)；渦旋混合器：QL-866，其林貝爾(海門)；氟吡菌胺標準物質：農殘級，CAS：239110-15-7，100.3 mg/L；氟吡菌胺標準儲備溶液Ⅰ：10.03 μg/mL，稱取氟吡菌胺標準物質1.00 mL于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；氟吡菌胺標準儲備溶液Ⅱ：1.00 μg/mL，移取1.00 mL儲備液Ⅰ于10.0 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；乙腈：農殘級；甲醇：農殘級.

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：C18 2.1×100 mm×3.5 μm； 柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A(5 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液)，B(甲醇)梯度洗脫.梯度洗脫條件見表1.

表1 梯度脫洗程序

1.2.2 質譜條件 離子源溫度：350 ℃；電噴霧電壓：4.0 kV；干燥氣：氮氣；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多重反應監(jiān)測(MRM)；保留時間、定性及定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量及保留時間見表 2.

表2 質譜采集參數

1.2.3 快速溶劑萃取儀條件 加熱溫度100 ℃，載氣壓力100 psi，靜態(tài)萃取5 min，萃取池淋洗體積為60%池體積，氮氣吹掃時間60 s，循環(huán)靜態(tài)萃取次數為2次.

1.3 試驗方法準確稱取約5 g植物源性粉碎樣品，與一定量的無水硫酸鈉充分混勻、脫水，反復研磨成細小顆粒，全部轉移至萃取池中，以乙腈為萃取劑進行快速溶劑萃取。萃取液經自動濃縮儀濃縮至約0.5 mL，用萃取溶劑準確定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后轉移到自動進樣小瓶中，按上述儀器條件進行測定.

2 結果與討論

2.1 氟吡菌胺標準品的高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析按上述色譜條件，待儀器穩(wěn)定后連續(xù)注入氟吡菌胺標準溶液，直至連續(xù)兩次進樣儀器響應保留時間相對變化小于1%。其色譜和質譜分別見圖2與圖3. 可見，氟吡菌胺保留時間為5.12 min，響應值最大的子離子質荷比為172.9，次級響應離子質荷比為364.9.

圖2 氟吡菌胺標準溶液色譜圖

圖3 氟吡菌胺標準溶液質譜圖

1-索氏提取；2-超聲提??；3-加壓溶劑萃取圖4 不同提取方法對氟吡菌胺回收率的影響

2.2 萃取條件的選擇

2.2.1 不同提取方法的比較 對比了索氏提取、超聲提取和加壓溶劑萃取3種不同提取方法的回收率，見圖4. 可以看出，加壓溶劑萃取法回收率明顯高于索氏提取和超聲提取法. 在整個萃取過程中，加壓溶劑萃取儀器始終處在密閉的高溫、高壓下進行，而高溫和高壓有助于提高氟吡菌胺在溶劑中的溶解度，顯著提高了萃取效率. 其次，在密封的條件下減少了揮發(fā)損失，從而也有助于提高萃取效率.

2.2.2 萃取溶劑的選擇 萃取溶劑的選擇對目標化合物的提取影響非常大。分別選擇甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、正己烷-二氯甲烷(1∶1)和丙酮-二氯甲烷(1∶2)為提取溶劑，固定加熱溫度120 ℃，載氣壓力120 psi，靜態(tài)萃取15 min，萃取池淋洗體積70%池體積，氮氣吹掃時間90 s，循環(huán)靜態(tài)萃取次數2次，按照色譜條件進行檢測，考察萃取溶劑對氟吡菌胺回收率的影響，結果見圖5.

由圖5知，在相同實驗條件下，乙腈的回收率最高，達到了95%～98%，明顯優(yōu)于其他萃取溶劑，因此本試驗選擇乙腈作為萃取溶劑.

1-正己烷；2-甲醇；3-乙腈；4-丙酮；5-正己烷-二氯甲烷；6-丙酮-二氯甲烷圖5 萃取劑對氟吡菌胺回收率的影響

2.2.3 萃取溶劑的用量 萃取劑乙腈的用量是影響試驗結果的重要因素之一，試驗對比了乙腈用量分別為5、10、15、20、25、30 mL時對氟吡菌胺回收率的影響，結果見圖6.

圖6 萃取溶劑的用量對氟吡菌胺回收率的影響

由圖6知，隨著乙腈用量的不斷增加，目標化合物氟吡菌胺的回收率先逐漸升高，后逐漸趨于平衡，乙腈用量在15 mL時，氟吡菌胺回收率達到最高值，平均回收率在90%以上. 顯然少量的乙腈不能夠將目標物質完全的萃取，隨著乙腈用量增加，氟吡菌胺萃取效果達到最優(yōu)，回收率達到最高值，但隨著萃取溶劑用量不斷增加，萃取達到相對動態(tài)平衡，回收率變化不明顯. 通過試驗最終確定萃取溶劑乙腈用量最佳為15 mL.

2.2.4 靜態(tài)萃取時間和萃取壓力的選擇 分別設定靜態(tài)萃取時間為2、3、5、8、10、12 min，考察萃取回收率。圖7顯示，萃取5 min時，回收率在90%以上，再延長萃取時間，目標物的回收率基本不變，故靜態(tài)萃取時間選擇5 min。分別選擇50、70、100、120和150 psi萃取壓力，考察回收率的變化，結果見圖8. 可見，氟吡菌胺的萃取回收率隨著萃取壓力的增加而逐漸提高，在100、120和150 psi萃取壓力下，回收率無明顯變化，因此，萃取壓力確定為100 psi.

圖7 萃取時間對氟吡菌胺回收率的影響

圖8 萃取壓力對氟吡菌胺回收率的影響

2.3 液相色譜和質譜分析條件的優(yōu)化分別考察了甲醇-10 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液、甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相對氟吡菌胺分析的影響，結果顯示，甲醇-5 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液為流動相時，目標物峰形最佳，響應最靈敏.

文獻報道的氟吡菌胺液相色譜-質譜聯(lián)用法一般采用電噴霧離子正離子模式[5]，本文中在全掃描模式下對比了正、負離子模式下氟吡菌胺的響應，結果表明，在正離子模式下氟吡菌胺靈敏度更高，因此選擇正離子模式進行分析.在MS/MS模式中，以錐孔電壓48 V進行目標物的子離子檢測，以豐度最大(m/z)172.9作為定量離子，以次靈敏響應離子m/z364.9作為定性離子，優(yōu)化質譜分析參數見表2.

2.4 標準曲線和檢出限將氟吡菌胺標準儲備溶液用乙腈逐級稀釋成0.025 μg/mL、0.050 μg/mL、0.125 μg/mL、0.250 μg/mL、0.500 μg/mL標準系列溶液，準確稱取與試樣基質相應的陰性試樣5 g(精確至0.01 g)，分別加入標準系列溶液200 μL，與試樣同時進行提取，制成最終濃度為5.00 ng/mL、10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100 ng/mL標準系列工作溶液。按儀器條件對系列進行測定，在5.00～100 ng/mL范圍內，濃度值與其對應的峰面積呈線性關系，標準曲線回歸方程為Y=48 697X-4 711，相關系數R2>0.999 0，定量限為1.00 μg/kg.

2.5 精密度和準確度試驗稱取6份5 g樣品，在線性范圍內分別加入低、中、高系列濃度分析物，按照前處理過程和儀器條件對6份樣品進行測定，計算相對標準偏差(RSD%)和加標回收率，結果如表3所示.

表3 精密度和準確度試驗結果 (n=6)

2.6 樣品測定隨機抽取三家菜市場，每一菜市場選取2種日常食用蔬菜，分別為白菜、西藍花、西紅柿、黃瓜、芹菜和四季豆，按照本方法的前處理和儀器條件進行分離分析，結果在上述蔬菜中均未檢測出氟吡菌胺殘留.同時，對種植過程中噴灑了氟吡菌胺農藥的芹菜和白菜分別進行殘留量測定，結果見表4.其中，芹菜和白菜的施藥劑量均為953(a.i.) g/hm2，施藥次數均為3次，采集樣品時間至最后一次施藥完成后的第7 d.

表4 氟吡菌胺在芹菜和白菜中的殘留量 (μg/kg，n=3)

3 結論

本工作建立了以乙腈提取，加壓溶劑萃取-高效液相色譜-三重四級串聯(lián)質譜法測定植物源性食品中氟吡菌胺殘留量的方法，提取方法操作簡單，目標化合物損失小，準確度高，且方法線性良好、精密度、準確度均能滿足定量限在1.00 μg/kg的檢測分析要求，適用于植物源性食品中氟吡菌胺農藥殘留量的檢測.