黃芪甲苷對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷NLRP3 炎性小體表達(dá)的影響

李娜 穆亞平 劉春英 王陽 李曉鋒 王雪薇

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，遼寧沈陽 110847；2.沈陽市兒童醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)實驗室，遼寧沈陽 110032）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是由圍生期窒息引起的腦缺氧缺血性損害，是新生兒死亡和傷殘的主要原因。除亞低溫治療外，諸如硫酸鎂、促紅細(xì)胞生成素、間充質(zhì)干細(xì)胞移植等治療方法尚未在臨床廣泛應(yīng)用,而且存在爭議[1-2]。在接受亞低溫治療的中、重度HIE 嬰兒中，仍有近31.6%～51.4%的患者殘障存活[3-5]。因此，有必要尋找新的安全有效的治療方法來促進(jìn)HIE 患兒神經(jīng)系統(tǒng)康復(fù)。缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）是HIE 的病理過程，缺氧缺血再灌注時中性粒細(xì)胞聚集、炎癥介質(zhì)釋放增多，因此深入研究各種黏附因子和炎癥介質(zhì)的作用機(jī)制，及早發(fā)現(xiàn)拮抗措施，可能是預(yù)防和減輕HIBD 的途徑之一。Nod樣受體蛋白3（NLRP3）是一種多蛋白復(fù)合體，能夠識別病原體相關(guān)模式分子和危險因素相關(guān)模式分子等信號，激活半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），活化的Caspase-1 能夠剪切打孔Gasdermin D 蛋白（GSDMD），導(dǎo)致炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18 釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[6]。NLRP3 和Caspase-1 與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如缺血性中風(fēng)、動脈粥樣硬化斑塊形成、阿爾茨海默病、帕金森病等[7-8]。Serdar 等[9]發(fā)現(xiàn)，HIBD 24 h 后，小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元損傷與NLRP3 炎性小體基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Ystgaard 等[10]的研究則提示新生小鼠腦缺氧缺血后24 h，NLRP3 在海馬中表達(dá)上調(diào)2.6 倍，高于紋狀體和丘腦，NLRP3 炎性小體信號通路激活與神經(jīng)細(xì)胞死亡相關(guān)且不利于機(jī)體自身早期保護(hù)機(jī)制的啟動。

黃芪甲苷（astragaloside IV, AS-IV）是黃芪的主要活性成分之一，是黃芪皂苷類的單體成分，可通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11]。研究顯示，AS-IV 具有抗抑郁作用，其抗抑郁的作用是通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ 的表達(dá)來抑制小鼠海馬區(qū)NF-κB 磷酸化、降低NLRP3 炎癥小體和IL-1β 的表達(dá)發(fā)揮作用[12]。Li 等[13]研究發(fā)現(xiàn)AS-IV 通過抑制NLRP3 信號通路，減輕腦缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠短暫性認(rèn)知障礙。AS-IV 是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)劑，但其在新生兒HIBD 中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。新生兒大腦在發(fā)生HIBD后其適應(yīng)和再生能力有限，而海馬齒狀回的腦室下帶和顆粒下層是神經(jīng)發(fā)生的主要部位，因此關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信號通路的研究常集中在海馬體結(jié)構(gòu)上[14-15]。本實驗通過建立乳鼠HIBD 模型及小鼠海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞缺氧模型，觀察AS-IV對NLRP3 炎性小體的干預(yù)作用，并初步探討其治療最佳干預(yù)濃度，旨在為臨床治療新生兒HIE 提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 動物及細(xì)胞

Sprague-Dawley 雄 性2 日 齡 仔 鼠30 只 由 遼寧省長生生物技術(shù)股份有限公司提供[動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001]。小鼠海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號CL-0595）。

1.2 主要試劑及耗材

AS-IV（含量＞98%，20 mg）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（貨號J0201AS），分子量為784.97 g/mol。DMEM 高糖培養(yǎng)基（SH30022.01，HyClone 公 司， 美 國 ），DMEM 無 糖 培 養(yǎng) 基（90113）、DMSO（D8371）購自北京索萊寶科技有限公司，yo-PRO-1（V23201）、EthD-2（E3599）購自美國Thermofisher 公司，β-actin（66009-1-Ig，Proteintech 公司，美國）；磷酸鹽緩沖液、胰酶、青鏈霉素、二抗均購自美國Gibco 公司；NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD、CCK-8 一抗均購自英國Abcam 公司。

1.3 分組及模型建立

仔鼠養(yǎng)育至第7 日，SPF 級條件飼養(yǎng)。選擇體重10～14 g 的7 日齡新生大鼠24 只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、HIBD 組和AS-IV 治療組（AS-IV 組），每組均8 只。HIBD 組參照文獻(xiàn)[16]造模：仔鼠用異氟醚麻醉后行右側(cè)頸總動脈雙重結(jié)扎。術(shù)后放置2 h，待仔鼠完全清醒后再置于37℃恒溫密閉缺氧艙中，以 5 L/min 的流速向艙內(nèi)輸入8%O2+92%N2的混合氣體，持續(xù)60 min 后取出；假手術(shù)組僅用眼科器械切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總動脈，不予結(jié)扎，直接進(jìn)行皮膚縫合。AS-IV 組在造模后，立即將AS-IV（10 mg/kg）溶于DMSO 液中（10 mL/kg），根據(jù)仔鼠體重進(jìn)行計算后灌胃，每8 h 1 次，共記3 次。結(jié)束后將仔鼠放回母鼠籠中飼養(yǎng)，24 h 后異氟醚麻醉，行腦部組織取樣。

1.4 腦組織蘇木精-伊紅染色

取造模后24 h 仔鼠，3%～4%異氟醚麻醉處死，取腦組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，分級酒精脫水，石蠟包埋。腦組織石蠟塊沿冠狀面行5 μm厚度切片，然后行蘇木精-伊紅（HE）染色，萊卡DM4B 光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腦組織海馬的病理變化。

1.5 AS-IV 對仔鼠腦組織細(xì)胞焦亡的影響

采用yo-PRO-1 和EthD-2 染色劑檢測細(xì)胞焦亡[17-18]。取造模后24 h 仔鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定腦組織48 h，冷凍切片法制作切片，腦組織切片厚度為5～10 μm。將腦組織切片置于載玻片上，暗室環(huán)境中PBS 液洗4 次，每次5 min；分別加入yo-PRO-1 和EthD-2 抗體（工作濃度均為1 : 1 000），室溫孵育30 min，PBS 液洗4 次，每次5 min；最后加入DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，暗室室溫孵育20 min 后用抗熒光淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡的變化。

1.6 細(xì)胞缺氧模型構(gòu)建與給藥

小鼠海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。隨機(jī)分為對照組、氧糖剝奪（OGD）組、OGD+AS-IV 組。對照組為常規(guī)培養(yǎng)（37℃、5%CO2）的HT22 細(xì)胞；海馬神經(jīng)元細(xì)胞OGD 模型建立[19]：棄去正常培養(yǎng)基，PBS 液清洗2 次，加無糖無血清DMEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于充滿95%N2和5%CO2的厭氧袋中孵育2 h，2 h后取出細(xì)胞，棄去無糖無血清DMEM 培養(yǎng)基，換為正常培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

OGD+AS-IV 組 每 孔 加 入100 μL 2 000 個 細(xì)胞，按24 h 孵育時間標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置AS-IV 濃度梯度（50～400 μmol/L）來明確藥物的最佳濃度。

AS-IV 配 制 方 法： 將AS-IV 溶 于2.548 mL DMSO 液中，先稀釋成10 mmol/L 的儲存溶液，然后用培養(yǎng)液稀釋，使藥物終濃度分別為50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L，每 個 濃 度重復(fù)6 個復(fù)孔。

1.7 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力

將HT22 細(xì)胞接種于96 孔板，分別在常規(guī)培養(yǎng)條件和缺氧條件下培養(yǎng)24 h，再加入不同濃度AS-IV，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育1 h，在450 nm 波長測定吸光度，檢測缺氧條件下不同AS-IV 濃度對HT22 細(xì)胞活力的影響。實驗獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.8 Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

處理后的各組細(xì)胞加入RIPA 細(xì)胞裂解液，在預(yù)制電泳膠中按照每孔10 μL 加入蛋白樣品及marker，空白孔中補(bǔ)充10 μL 蛋白上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，TBST 緩沖液洗膜，3%脫脂奶粉封閉3 h，分別加入一抗NLRP3、Caspase-1、GSDMD（均為1 : 1 000稀釋）、IL-1β（0.1 μg/mL），以β-actin（1 : 10 000稀釋）為內(nèi)參，4℃孵育過夜，洗膜后分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG（1 : 3 000）和山羊抗兔IgG（1 : 10 000）二抗孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值之比計算目的蛋白的相對表達(dá)量。實驗獨(dú)立重復(fù)3 次。

取仔鼠腦組織損傷側(cè)海馬組織進(jìn)行勻漿并加入裂解液，Western blot 法檢測AS-IV 對HIBD 新生大鼠海馬組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白的影響，操作步驟同細(xì)胞實驗。

1.9 RT-qPCR 法 檢 測 細(xì) 胞 內(nèi)GSDMD、NLRP3、IL-1β、Caspase-1 的mRNA 水平

收集各組細(xì)胞后使用TRIzol 法提取各組細(xì)胞總RNA，并測定濃度。使用One Step TB Green?PrimeScript?RT-PCR Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）進(jìn)行檢測。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×Buffer 10 μL，Ex Taq HS 0.4 μL，enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ0.4 μL，Total RNA 2 μL，RNase Free dH2O 6 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40 個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCT法計算mRNA 的相對表達(dá)量。引物序列由沈陽實創(chuàng)生物技術(shù)有限公司合成（表1）。實驗獨(dú)立重復(fù)3 次。

表1 RT-PCR 引物序列

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS-IV 對HIBD 新生大鼠的影響

造模24 h 后腦組織HE 染色顯示，與假手術(shù)組比較，HIBD 組海馬區(qū)錐體細(xì)胞層細(xì)胞密度降低、排列松散、層次紊亂，部分細(xì)胞可見空泡樣變性和典型急性缺血性紅色神經(jīng)元；AS-IV 組海馬神經(jīng)元細(xì)胞變性程度減輕，急性缺血性改變明顯減少（圖1）。

采用yo-PRO-1 和EthD-2 染色劑檢測細(xì)胞焦亡，HIBD 組焦亡細(xì)胞（核內(nèi)綠/藍(lán)雙陽性，青色為主）明顯增多，同時可見少量壞死細(xì)胞（陽性細(xì)胞核內(nèi)呈紅色）；AS-IV 組則顯示焦亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞均明顯減少。見圖2。

2.2 AS-IV 對乳鼠焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組比較，HIBD 組腦組織NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 表 達(dá) 水 平 明 顯 升 高（P＜0.05）；AS-IV 組 腦 組 織NLRP3、Caspase-1及GSDMD 表達(dá)水平顯著低于HIBD 組（P＜0.05），且與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；AS-IV 組腦組織IL-1β 表達(dá)水平與HIBD 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）。見表2 和圖3。

2.3 不同濃度AS-IV 對缺氧處理后HT22 細(xì)胞活力的影響

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，HT22 細(xì)胞OGD 模型建立后，細(xì)胞活力較對照組明顯下降（P＜0.05）；與OGD 組比較，缺氧處理后的HT22 細(xì)胞應(yīng)用100～400 μmol/L AS-IV 干預(yù)后，HT22 細(xì)胞活力均升高（P＜0.05）；AS-IV 藥物濃度在200 μmol/L 時能明顯減輕缺氧損害，與OGD 組比較，細(xì)胞活力升高最明顯。見表3。

圖1 AS-IV 對HIBD 新生大鼠腦組織的影響（蘇木精-伊紅染色，×200） 與假手術(shù)組比較，HIBD 組細(xì)胞排列層次紊亂，可見典型急性缺血性紅色神經(jīng)元及細(xì)胞空泡樣改變；AS-IV 治療后，急性缺血性紅色神經(jīng)元明顯減少，細(xì)胞空泡樣變性程度降低。白色箭頭示缺血性神經(jīng)元，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮，紅染；黑色箭頭示細(xì)胞空泡樣改變。

圖2 AS-IV 對HIBD 新生大鼠細(xì)胞焦亡的影響（免疫熒光，×100） 與假手術(shù)組比較，HIBD 組焦亡細(xì)胞（核內(nèi)綠/藍(lán)雙陽性，青色為主）明顯增多，同時可見少量壞死細(xì)胞（陽性細(xì)胞核內(nèi)呈紅色）。白色箭頭示焦亡細(xì)胞，紅色箭頭示壞死細(xì)胞。

表2 各組腦組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白檢測結(jié)果比較 （n=8）

表2 各組腦組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白檢測結(jié)果比較 （n=8）

注：[NLRP3] Nod 樣受體蛋白3；[IL-1β]白細(xì)胞介素-1β；[Caspase-1]半胱氨酸蛋白酶-1；[GSDMD] Gasdermin D 蛋白。a 示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b 示與HIBD 組比較，P＜0.05。

組別 NLRP3 IL-1β Caspase-1 GSDMD假手術(shù)組 0.084±0.029 0.107±0.029 0.225±0.099 0.144±0.031 HIBD 組 0.187±0.017a 0.259±0.030a 0.315±0.029a 0.189±0.027a AS-IV 組 0.064±0.029b 0.254±0.030a 0.188±0.017b 0.141±0.030b F 值 23.339 42.939 23.341 4.415 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.037

圖3 Western blot 法檢測各組新生大鼠海馬組織中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白的表達(dá)

2.4 不同濃度AS-IV 對細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，OGD 組 NLRP3、IL-1β、Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達(dá)水平均上升（P＜0.05）；與OGD 組比較，應(yīng) 用50～400 μmol/L 4 個 濃 度AS-IV 干 預(yù)OGD 細(xì)胞 后，NLRP3、IL-1β、Caspase-1 和GSDMD 蛋 白表達(dá)水平均下降（P＜0.05）；NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1 蛋 白 表 達(dá) 水 平 在200 μmol/L 和400 μmol/L 兩個濃度組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4 和表4。

2.5 不 同 濃 度AS-IV 對NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β mRNA 水平的影響

不同濃度AS-IV 干預(yù)HT22 缺氧細(xì)胞后，應(yīng)用RT-qPCR 法檢測NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β 的mRNA 水 平。與 對 照 組 比 較，OGD 組NLRP3、IL-1β、Caspase-1 和GSDMD 的mRNA 表達(dá)水平均上升（P＜0.05）；與OGD 組比較，應(yīng)用50～400 μmol/L 4 個濃度AS-IV 干預(yù)OGD 細(xì)胞后，NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平均明顯下降（P＜0.05）；與200 μmol/L 比較，其他濃度AS-IV 干預(yù)后NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β mRNA 表 達(dá) 水 平 均 有 所 上 升（P＜0.05），提示200 μmol/L AS-IV干預(yù)OGD細(xì)胞時，上述炎性小體和細(xì)胞因子下降最明顯。見表5。

表3 不同濃度AS-IV 對缺氧HT22 細(xì)胞活力的影響（，%，n=8）

表3 不同濃度AS-IV 對缺氧HT22 細(xì)胞活力的影響（，%，n=8）

注：a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OGD 組比較，P＜0.05。

組別 AS-IV 劑量(μmol/L) 細(xì)胞活力對照組 - 74.8±4.1 OGD 組 - 55.6±6.6a OGD+AS-IV 組 50 57.2±5.2a 100 62.1±2.1a,b 200 67.4±1.7a,b 400 64.9±2.3a,b

圖4 Western blot 法檢測不同濃度AS-IV 對各組HT22 細(xì) 胞 中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白的影響

表4 各組HT22 細(xì)胞NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白檢測結(jié)果比較 （，n=3）

表4 各組HT22 細(xì)胞NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 蛋白檢測結(jié)果比較 （，n=3）

注：[NLRP3] Nod 樣受體蛋白3；[GSDMD] Gasdermin D 蛋白；[IL-1β]白細(xì)胞介素-1β；[Caspase-1]半胱氨酸蛋白酶-1。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OGD 組比較，P＜0.05；c 示與50 μmol/L 組比較，P＜0.05；d 示與100 μmol/L 組比較，P＜0.05。

組別 NLRP3 GSDMD IL-1β Caspase-1對照組 0.320±0.021 0.628±0.012 0.472±0.011 0.324±0.062 OGD 組 1.735±0.042a 0.969±0.051a 0.986±0.017a 0.900±0.041a 50 μmol/L 組 1.616±0.095a 0.857±0.063a,b 0.720±0.094a,b 0.716±0.032a,b 100 μmol/L 組 0.531±0.047a,b 0.662±0.037a,b,c 0.653±0.057a,b 0.583±0.042a,b,c 200 μmol/L 組 0.224±0.085a,b,c,d 0.539±0.018b,c,d 0.420±0.049b,c,d 0.275±0.055b,c,d 400 μmol/L 組 0.250±0.056a,b,c,d 0.570±0.027b,c,d 0.450±0.039b,c,d 0.296±0.078b,c,d F 值 27.953 168.171 48.391 80.776 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表5 各組HT22 細(xì)胞NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 的mRNA 檢測結(jié)果比較 （，n=3）

表5 各組HT22 細(xì)胞NLRP3、IL-1β、Caspase-1 及GSDMD 的mRNA 檢測結(jié)果比較 （，n=3）

注：[NLRP3] Nod 樣受體蛋白3；[GSDMD] Gasdermin D 蛋白；[IL-1β]白細(xì)胞介素-1β；[Caspase-1]半胱氨酸蛋白酶-1。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與OGD 組比較，P＜0.05；c 示與50 μmol/L 組比較，P＜0.05；d 示與100 μmol/L 組比較，P＜0.05，e 示與200 μmol/L 組比較，P＜0.05。

組別 NLRP3 GSDMD IL-1β Caspase-1對照組 0.426±0.001 0.683±0.013 0.622±0.026 0.681±0.015 OGD 組 1.000±0.021a 1.000±0.022a 1.000±0.032a 1.000±0.035a 50 μmol/L 組 0.658±0.019a,b 0.627±0.005a,b 0.627±0.012a,b 0.629±0.003b 100 μmol/L 組 0.642±0.013a,b 0.689±0.008a,b,e 0.577±0.012b,c 0.643±0.016b 200 μmol/L 組 0.582±0.006b,c,d 0.565±0.008b,c,d 0.446±0.010b,c,d 0.574±0.012b,c,d 400 μmol/L 組 0.651±0.021b,e 0.725±0.058b,c,e 0.717±0.031b,c,d,e 0.702±0.002b,c,d,e F 值 281.247 105.143 278.747 261.974 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

HIE 是導(dǎo)致足月兒死亡和兒童期殘疾的主要原因。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，HIE 的神經(jīng)保護(hù)策略、神經(jīng)康復(fù)技術(shù)及相關(guān)基礎(chǔ)研究均取得了較大進(jìn)步，但目前HIE 的治療仍以穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境為目的的支持療法為主，尚無理想的治療方法[20]。AS-IV是黃芪的主要成分，具有抗神經(jīng)炎癥、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管神經(jīng)修復(fù)等多重效應(yīng)。Wang 等[21]系統(tǒng)評估了AS-IV 對實驗性急性缺血性卒中的有效性和可能的機(jī)制后認(rèn)為AS-IV 在腦缺血再灌注損傷過程中可能通過抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。近年來已有臨床醫(yī)生應(yīng)用黃芪注射液治療HIE、腦性癱瘓等疾病且取得較好的臨床效果[22-23]，但這類治療均處于臨床摸索狀態(tài)，其治療HIE 的具體分子機(jī)制需要更深入的研究。

神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種基本的先天免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病因素之一。缺氧缺血引起血管內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)是新生兒腦損傷病理生理學(xué)的重要因素。然而，免疫激活特別是適應(yīng)性免疫反應(yīng)對HIBD 的長期影響仍不清楚[24-25]。NLRP3 在實現(xiàn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的同時及時關(guān)閉固有免疫反應(yīng)，因此防止炎性小體過度激活對控制炎癥級聯(lián)反應(yīng)尤為重要。抑制NLRP3 炎性小體活性可能成為治療腦外傷、神經(jīng)退行性疾病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病一種潛在而有效的治療策略[26-27]。唐標(biāo)等[28]認(rèn)為AS-IV 可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，并抑制NF-κB 磷酸化及NLRP3 炎癥小體活化。

本研究發(fā)現(xiàn)，HIBD 組乳鼠腦組織海馬區(qū)錐體細(xì)胞層細(xì)胞密度降低、層次紊亂，部分細(xì)胞可見空泡樣變性和典型紅色神經(jīng)元改變，部分神經(jīng)元出現(xiàn)急性壞死。細(xì)胞焦亡是近年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡形式，目前已有學(xué)者將焦亡作為治療放射性腦損傷、HIBD 等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個潛在治療靶點(diǎn)[29-30]。為了更深入探討HIE 后是否存在焦亡現(xiàn)象，本實驗采用yo-PRO-1 和EthD-2 兩種不同分子量染色劑檢測細(xì)胞焦亡。yo-PRO-1 是一種細(xì)胞膜封閉的陽離子，可以檢測細(xì)胞膜通透性變化[18]；而EthD-2 由于分子量較大，不能透過焦亡細(xì)胞的膜孔，但是可以穿透壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜。作為附加優(yōu)勢，EthD-2 在激活后的單核細(xì)胞內(nèi)不會與其他顏色熒光染色劑共存。本研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠HIBD 后壞死細(xì)胞應(yīng)用EthD-2 染色后未與yo-PRO-1 和DAPI 共存，考慮與HIBD 后激活單核細(xì)胞導(dǎo)致炎癥介質(zhì)Caspase-1、IL-1β 的釋放增多有關(guān)，此與文獻(xiàn)報道相符[17]。本實驗通過yo-PRO-1和EthD-2 雙染初步證實了HIE 存在焦亡現(xiàn)象，且應(yīng)用AS-IV 預(yù)處理可減少焦亡的發(fā)生。為了深入探討新生大鼠HIBD 后機(jī)體內(nèi)焦亡的發(fā)生情況和后期AS-IV 預(yù)處理對焦亡的調(diào)控情況，本次實驗還研究了焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD 的表達(dá)情況。炎性Caspase 的底物GSDMD蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵“殺手蛋白”，它是細(xì)胞焦亡的直接和最終參與者[31]。GSDMD 可靶向作用于細(xì)胞膜并且誘導(dǎo)在質(zhì)膜中形成大的滲透性孔，因此GSDMD 被認(rèn)為是形成細(xì)胞焦亡孔的候選者[32]。本研究應(yīng)用AS-IV 治療后，發(fā)現(xiàn)AS-IV 能明顯下調(diào)GSDMD 表達(dá)。HIBD 組乳鼠損傷側(cè)腦組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)水平均明顯升高，提示HIBD 后，大鼠腦組織存在焦亡現(xiàn)象，應(yīng)用AS-IV 治療后NLRP3、Caspase-1 表達(dá)減少，而IL-1β 干預(yù)前后無明顯變化考慮與蛋白表達(dá)延遲相關(guān)，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，擴(kuò)大觀察時間點(diǎn)進(jìn)一步論證。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的通路通常集中在海馬，HT22細(xì)胞來源于永生化的小鼠海馬細(xì)胞系HT-4，非常適合于體外缺氧應(yīng)激研究[33]。我們在動物實驗研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用CCK-8 法檢測AS-IV 對缺氧損傷的HT22 細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示缺氧處理后的HT22 細(xì)胞活力較對照組明顯下降，AS-IV（100～400 μmol/L）能提高OGD 組的細(xì)胞存活率，且200 μmol/L AS-IV 干預(yù)效果最好。為進(jìn)一步明確AS-IV 對NLRP3 炎性小體表達(dá)的影響，我們同時檢測了不同濃度AS-IV 對HT22 細(xì)胞缺氧后焦亡相 關(guān) 因 子NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD 的蛋白水平及mRNA 表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示應(yīng)用AS-IV 干預(yù)后，NLRP3 表達(dá)較OGD 組下降，其下游因子GSDMD、Caspase-1 和IL-1β 均明顯下調(diào)。這些結(jié)果均說明了AS-IV 對缺氧損傷的海馬神經(jīng)元細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究初步證實了AS-IV 對新生大鼠HIBD 的神經(jīng)保護(hù)作用。AS-IV 可以通過降低腦缺氧缺血后NLRP3 炎性小體的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用，具有一定的臨床應(yīng)用前景。