Nrf2/ARE 信號通路在嗎啡預處理減輕鹽酸多柔比星誘導心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機制

譚永麗，唐慧潔，田苑

云南省第一人民醫(yī)院，昆明理工大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，昆明 650032

心力衰竭（heart failure，HF）是原發(fā)性和繼發(fā)性心血管疾病的終末期表現，具有較高的發(fā)病率[1]。在對冠心病、心瓣膜引起的合并性心力衰竭患者進行心或其他器官手術時，由于其對缺血等刺激的敏感性，易發(fā)生心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI），導致心結構受損，功能障礙，嚴重威脅患者的生命安全[2]，成為臨床麻醉醫(yī)師所面對的棘手的挑戰(zhàn)。阿片類藥物是心外科手術麻醉一線鎮(zhèn)痛藥。研究表明阿片類藥物如舒芬太尼（sufentanil）、嗎啡（morphine）等可減少心肌細胞凋亡，降低心手術中心力衰竭的發(fā)生率[3]。基礎和臨床研究表明阿片類藥物預處理可抑制MIRI 中心肌細胞的異常凋亡，抑制心肌梗死，發(fā)揮心保護作用[4]。Chen 等[5]研究證實嗎啡預處理可減輕大鼠的心缺血再灌注損傷。吳運香等[6]研究證明嗎啡預處理可明顯減輕HF 大鼠離體心的缺血再灌注損傷。但有關嗎啡預處理在心力衰竭動物模型受到缺血再灌注損傷時的作用少有報道。信號通路核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）是機體內最重要的內源性抗氧化通路，其通過調控抗氧化酶如血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及轉運蛋白谷胱甘肽（glutathione，GSH）等的表達，清除細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS），抑制氧化應激，減輕缺血再灌注損傷[7]。本研究建立HF 大鼠MIRI 模型，探討Nrf2/ARE 對嗎啡預處理減輕鹽酸多柔比星誘導心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用機制，從而為臨床應用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10 周清潔級SD 雄性大鼠72 只，體重220～250 g，由本院實驗動物中心提供，動物使用許可證號SCXK（滇）2019-0001。

1.1.2 主要試劑及儀器 嗎啡（morphine，批準文號：2013071022F，Fresenius Kabi 公司，德國）；注射用鹽酸多柔比星（即阿霉素，doxorubicin，山西普德藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H14023879）；Nrf2/ARE 通路抑制劑齊墩果酸85（oleanolic acid derivative85，OAD-85，吉林金恒制藥股份有限公司，國藥準字BHX011634）；異氟烷、戊巴比妥鈉、鏈脲佐霉素、多聚甲醛購自Sigma 公司；HE 試劑盒、TTC 和DCFH-DA 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；Nrf2、HO-1 抗體購自美國abcam 公司，TUNEL 試劑盒、Western blot 試劑盒購自德國Rebstock 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 心力衰竭大鼠模型構建 以醫(yī)用生理鹽水將注射用鹽酸多柔比星配成2 mg/L 溶液，取SD 大鼠60只，將鹽酸多柔比星溶液以尾靜脈注射到大鼠體內（2 mg/kg），每周1 次，持續(xù)8 周，構建心力衰竭大鼠模型[8]；另12 只為正常組，尾靜脈注射等體積的醫(yī)用生理鹽水。8 周后心彩超測定大鼠左心室射血分數（left ventricular ejection fractions，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），大鼠LVEF＞58%，同時LVFS＞30%視為心力衰竭模型制備成功。

1.2.2 心缺血再灌注損傷大鼠模型構建及分組 將60 只HF 模型大鼠隨機分為5 組，每組12 只：假手術組（sham 組），缺血再灌注組（模型組），嗎啡預處理組（MFC 組），Nrf2/ARE 信號通路抑制劑OAD-85 對照組（OAD 組），及OAD-85+嗎啡預處理組（MOA 組）。MFC 組大鼠在造模手術前1 h 予以靜脈滴注嗎啡5 min（0.1 mg/kg），輸注3 次，每次5 ml；OAD 組術前1 h靜脈滴注Nrf2/ARE 信號通路抑制劑OAD-85（0.1 mg/kg）；MOA 組術前1 h 靜脈滴注OAD-85+嗎啡（OAD-85 和嗎啡濃度均為0.1 mg/kg）；其他組輸注等體積的生理鹽水。造模采用6-0 線結扎左冠狀動脈前降支，穩(wěn)定10 min 后，收緊線結即造成左冠狀動脈閉塞心肌缺血，由左冠狀動脈所支配的局部心肌發(fā)紺，心局部搏動受限，血壓下降，ECG 顯示ST 段波動較大或抬高或降低，呈現心肌梗死改變，視為大鼠心缺血成功，松開線結即實現再灌注[9]。本實驗sham 組、正常組大鼠僅在左冠狀動脈前降支處縫線不結扎，其余組大鼠心施以左冠狀動脈前降支結扎30 min 再灌注120 min 處理。手術過程中注意保溫。每日定時進行結扎30 min，再灌注120 min，連續(xù)處理1 周，過程中所有大鼠以標準飼料，自由飲水喂養(yǎng)。

1.2.3 TTC 染色檢測各組大鼠心肌梗死比例 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈放血處死。取出心，預處理后將心組織封存在液氮中，置于-80 ℃深冷冰箱中備用。各組大鼠心標本取出10%制成冠狀切片，TTC 染色20 min，10%福爾馬林溶液固定，置于4 ℃冰醋酸上24 h，數碼相機拍照，留取圖像，并進行心肌梗死統(tǒng)計分析。

1.2.4 光鏡觀察各組大鼠心肌組織病理學改變 從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，HE 染色，制成切片，光鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理改變。

1.2.5 電鏡觀察超微病理結構 從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，用30%聚甲醛和0.05%鋨酸固定1 h，無菌脫水5 min，置于預冷4 ℃乙醇3 min，環(huán)氧樹脂812 浸透5 min，石蠟包埋，醋酸雙氧鈾（uranyl acetate）及枸櫞酸鉛（lead citrate）進行雙重染色，做成50 nm 超薄組織切片，待切片完全干燥后載于銅網上，上透射電鏡觀察超微病理結構。

1.2.6 TUNEL 染色檢測各組大鼠心肌細胞凋亡 從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，常規(guī)方法固定，冰凍切片，二甲苯浸洗兩次，梯度酒精浸洗5 min，風干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min，PBS 漂洗3 次，每次3 min，然后4 ℃預冷乙醇上進行如下操作：0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS 漂洗3 次，每次3 min，加入TUNNEL 反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37 ℃，PBS 漂洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.7 DCFH-DA 染色檢測ROS 含量評估各組大鼠心的氧化應激反應 從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，用10 μmol/L 的DCFH-DA 染色2 h，熒光顯微鏡下拍照，隨機選取鏡下5 個不重復區(qū)圖像，用圖像分析軟件ImageJ 1.41 分析5 個視野綠色熒光的平均強度值。按照各試劑盒說明書要求，使用MDA 試劑盒、SOD 試劑盒檢測心肌組織中與氧化反應相關的底物水平。

1.2.8 Western blot 檢測各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 表達水平 從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，裂解離心，留取上清，測定各蛋白濃度后，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜，封閉2 h，加入一抗（1：1 000），4 ℃過夜，次日加入二抗（1：10 000），恒溫孵育2 h，顯色，Bio-rad 凝膠成像下進行記錄蛋白灰度，以GAPDH 作為參照物，分別表示目的蛋白的相對表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據統(tǒng)計采用SPSS 16.0 軟件，作圖工具采用Graphpad5.01，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠心肌組織TTC 染色結果及心肌梗死比例

TTC 染色結果如圖1 示，正常組和sham 組基本無心肌梗死現象，與sham 組和正常組相比，模型組大鼠心肌梗死明顯（P＜0.05）；與模型組相比，MFC 組大鼠心肌梗死比例減少（P＜0.05）；與MFC 組相比，MOA組大鼠心肌梗死比例增加（P＜0.05）；與模型組、MFC組、MOA 組相比，OAD 組大鼠心肌梗死比例增加（P＜0.05）。

2.2 大鼠心肌組織病理學改變

圖1 大鼠心肌組織TTC 染色圖片及統(tǒng)計圖A：正常組，心肌組織正常 B：sham 組，心肌組織基本正常 C：模型組，心肌缺血發(fā)紺明顯 D：MFC組，心肌梗死比例低于模型組 E：MOA 組，心肌梗死比例高于MCF 組F：OAD 組，心肌梗死比例高于其他組*P＜0.05，與正常組和sham 組相比#P＜0.05，與模型組相比△P＜0.05，與MFC 組相比 ☆P＜0.05，與模型組、MFC 組、MOA 組相比Fig.1 TTC staining images and statistical chart of rat myocardial tissueA: Normal group,normal myocardial tissue；B: Sham group,myocardial tissue was basically normal；C:Model group,obvious myocardial ischemia cyanosis；D:MFC group,the rate of myocardial infarction was lower than that of the model group；E: MOA group,the rate of myocardial infarction was higher than that of the MCF group；F:OAD group,the rate of myocardial infarction was higher than other groups*P＜0.05,compared with normal group and sham group;#P＜0.05,compared with model group;△P＜0.05,compared with MFC group;☆P＜0.05,compared with model group,MFC group,MOA group Ratio

HE 染色光鏡觀察，正常組大鼠心肌細胞結構完整，排列整齊，清晰可辨，細胞間質無水腫，心肌橫紋清晰且規(guī)則。sham 組大鼠心肌細胞腫脹且排列不規(guī)則、細胞間質水腫明顯及細胞外基質增多，較多炎性細胞浸潤；模型組心肌細胞排列更加紊亂，部分核膜破裂，消失，可見部分細胞胞膜缺失，細胞呈現凋亡狀態(tài)，出現炎性細胞浸潤；與模型組相比，MFC 組心肌細胞排列較規(guī)則，炎性細胞浸潤明顯減少，基本無出血點，細胞凋亡狀態(tài)明顯改善；與MFC 組相比，MOA組心肌細胞排列雜亂，炎性細胞浸潤增多，細胞凋亡數量明顯增多；與模型組、MFC 組、MOA 組相比，OAD 組心肌細胞核質界限重合、層疊嚴重，界限不清晰，細胞凋亡狀態(tài)更加明顯（圖2）。

電鏡下觀察各組大鼠心肌組織超微結構，正常組大鼠心肌肌節(jié)排列整齊，橫紋清楚，細胞核形狀規(guī)則位于細胞中央，線粒體結構清晰可辨，嵴結構規(guī)整連續(xù)，心肌細胞明帶、暗帶清晰可見；sham 組大鼠心肌細胞胞核出現明顯膨脹，形狀及結構變形明顯，線粒體結構出現較為明顯的損傷，線粒體嵴可見部分重疊，但仍充滿整個線粒體腔；模型組心肌肌節(jié)排列紊亂，有大面積的溶解現象，細胞胞核明顯擴大，核質界限不清晰，核質固縮明顯，線粒體嚴重腫脹，嵴結構不規(guī)則，變短變疏，模糊不清，可見明顯空泡狀變性；與模型組相比，MFC 組心肌細胞排列較為規(guī)則，線粒體水腫程度明顯減輕，嵴斷裂、缺失程度較模型組減輕，部分嵴清晰可辨，可見較為穩(wěn)定的內質網環(huán)繞在細胞核周圍，心肌膠原纖維排列較為整齊，病變程度較輕；與MFC 組相比，MOA 組心肌細胞排列無序，有溶解現象出現，心肌細胞器損傷明顯較MFC 組加重，但比模型組較輕。與模型組、MFC 組、MOA 組相比，OAD組大鼠心肌細胞損傷明顯加重，見圖3。

2.3 TUNEL 染色檢測大鼠心肌組織細胞凋亡

TUNEL 染色顯示，與正常組和sham 組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高；與模型組相比，經過嗎啡預處理后，MFC 組心肌細胞凋亡率明顯降低；與MFC 組相比，添加信號通路抑制劑后，MOA 組心肌細胞凋亡率明顯升高；與模型組、MFC 組、MOA組相比，OAD 組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,見如圖4～5。

2.4 大鼠心肌組織氧化應激檢測

圖2 大鼠心肌組織病理切片A：正常組，心肌細胞結構完整，排列整齊，細胞間質無水腫，心肌橫紋清晰規(guī)則 B：sham 組，心肌細胞腫脹且排列不規(guī)則、細胞間質水腫明顯及細胞外基質增多，較多炎性細胞浸潤 C：模型組，心肌細胞排列更加紊亂，部分核膜破裂，消失，部分細胞胞膜缺失，細胞呈凋亡狀態(tài)，炎性細胞浸潤 D：MFC 組，心肌細胞較模型組排列規(guī)則，炎性細胞明顯減少，基本無出血點，細胞凋亡明顯改善 E：MOA 組，心肌細胞較MFC 組排列雜亂，炎性細胞浸潤增多，細胞凋亡數量明顯增多F：OAD 組，心肌細胞核質界限重合、層疊嚴重，細胞凋亡較其他組更加明顯Fig.2 Pathological section of myocardial tissueA: Normal group,myocardial cells with complete structure,orderly arrangement,no edema in intercellular stroma,clear and regular myocardial transverse striations；B: Sham group,swollen and arranged irregularly in myocardial cells,with obvious intercellular edema,increasing extracellular matrix,and more infiltrated inflammatory cells；C:Model group,disordered arrangement of myocardial cells and infiltrated inflammatory cells,some of the nuclear membrane ruptured and disappeared,and some of the cell membrane was missing.The cells were in apoptotic state；D: MFC group,compared with the model group,myocardial cells were in regular arrangement.The number of inflammatory cells significantly reduced,and there was almost no bleeding point.The cell apoptosis significantly improved；E: MOA group,compared with the MFC group,the myocardial cells were disorderly arranged,the infiltration of inflammatory cells increased,and the number of cell apoptosis increased；F: OAD group,the plasmic boundaries of myocardium were overlapping seriously,the cell apoptosis was more obvious in myocardium than in other groups

圖3 電鏡觀察心肌組織超微結構A：正常組：心肌肌節(jié)排列整齊，橫紋清楚，細胞核形狀規(guī)則位于細胞中央，線粒體結構清晰可辨，嵴結構規(guī)整連續(xù)，心肌細胞明帶、暗帶清晰可見 B：sham 組：心肌細胞核明顯膨脹，形狀及結構變形，線粒體結構明顯損傷，線粒體嵴部分重疊，但仍充滿整個線粒體腔 C：模型組：心肌肌節(jié)排列紊亂，有大面積溶解，細胞胞核明顯擴大，核質界限不清晰，核質固縮明顯，線粒體嚴重腫脹，嵴變短變疏不規(guī)則，模糊不清，可見明顯空泡狀變性 D：MFC 組：心肌細胞較模型組排列規(guī)則，線粒體水腫程度明顯減輕，嵴斷裂、缺失程度較模型組輕，部分嵴清晰可辨，可見較為穩(wěn)定的內質網環(huán)繞在細胞核周圍，心肌膠原纖維排列較為整齊 E：MOA 組：心肌細胞較MFC 組排列無序，有溶解現象，心肌細胞器損傷明顯較重，但比模型組較輕F：OAD 組：心肌細胞損傷較其他組明顯加重Fig.3 Electron microscope observation of the ultrastructure of myocardial tissueA:Normal group,myocardial sarcomere were arranged orderly with clear grains,the mitochondria were clearly identifiable,the cristae were orderly and continuous,and the bright and dark bands of myocardial cells were clearly visible；B: Sham group,nuclei of myocardium were obviously swollen,the shape and structure were deformed,and the mitochondrial structure was obviously damaged.The mitochondrial cristae partially overlapped,but still filled with the whole mitochondrial cavity；C: Model group,myocardial sarcomere arrangement was disordered,with unclear nucleoplasmic boundary,obvious nucleoplasmic pyknosis and seriously swollen mitochondria,the cristae became short,sparse and irregular,ambiguous,and obvious vacuolar degeneration can be seen；D:MFC group,compared with the model group,the arrangement of myocardial cells was regular,the degree of mitochondrial edema significantly reduced.Some cristae were clearly discernible,with stable endoplasmic reticulum surrounding the nucleus,and the arrangement of myocardial collagen fibers was orderly；E:MOA group,compared with the MFC group,the myocardial cells were disordered and lytic,and the damage of myocardial organelles was more serious,but less severe than that of the model group；F: OAD group,the damage of myocardial cells was more serious than that of other groups

DCFH-DA 染色結果如圖6～7 所示，與正常組和sham組相比，模型組大鼠心肌細胞的熒光明顯增強，ROS含量明顯增多；與模型組相比，MFC 組心肌細胞熒光強度明顯減弱，ROS 含量明顯降低；與MFC 組相比，MOA 組心肌細胞熒光明顯增強，ROS 含量明顯增多，但比模型組熒光強度明顯較弱，ROS 含量較少；與模型組、MFC 組、MOA 組相比，OAD 組大鼠心肌細胞熒光明顯增強，ROS 含量明顯增多。與正常組和sham組相比，模型組大鼠心肌細胞MDA 含量明顯增加，而SOD 酶活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，MFC 組心肌細胞MDA 含量明顯降低，SOD 酶活性明顯增強；與MFC 組相比，MOA組心肌細胞MDA 含量明顯增加，SOD 酶活性明顯降低；與模型組、MFC 組、MOA 組相比，OAD 組大鼠心肌細胞MDA 含量明顯增加，SOD 酶活性明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5 Western blot 檢測大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1表達

Western blot 結果如圖8 所示，與正常組和sham組相比，模型組大鼠Nrf2 和HO-1 的表達明顯升高；與模型組相比，MFC 組Nrf2 和HO-1 的表達明顯升高；與MFC 組相比，MOA 組Nrf2 和HO-1 的表達明顯下降；與模型組、MFC 組、MOA 組相比，OAD 組Nrf2和HO-1 的表達明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

圖4 TUNEL 染色檢測心肌細胞凋亡A：正常組，無明顯細胞凋亡 B：sham 組，細胞凋亡較少 C：模型組，細胞凋亡較多 D：MFC 組，細胞凋亡較模型組減少 E：MOA 組，細胞凋亡較MFC 組增多F：OAD 組，細胞凋亡較其他組明顯增多紅色箭頭指凋亡的心肌細胞Fig.4 Myocardial apoptosis detected by TUNEL stainingA: Normal group,no obvious cell apoptosis；B: Sham group,less cell apoptosis；C: Model group,more cell apoptosis；D: MFC group,cell apoptosis was less than that of the model group；E: MOA group,cell apoptosis was more than that of the MFC group；F: OAD group,cell apoptosis was more than any other groups；Red arrow point to apoptosis cells

圖5 TUNEL 染色檢測結果統(tǒng)計圖（n=12）A：正常組 B：sham 組 C：模型組 D：MFC 組 E：MOA 組F：OAD 組* P＜0.05，與正常組和sham 組相比 # P＜0.05，與模型組相比 △P＜0.05，與MFC 組相比 ☆P＜0.05，與模型組、MFC 組、MOA 組相比Fig.5 Statistical chart of the detection results of TUNEL staining（Bar=50 μm，n=12）A:Normal group; B: Sham group; C: Model group; D: MFC group; E:MOA group;F:OAD groupcompared with normal group and sham group,* P＜0.05;compared with model group,# P＜0.05;compared with MFC group,△P＜0.05;compared with model group,MFC group,MOA group Ratio,☆P＜0.05

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是多種合并性心外科手術后心力衰竭患者所要面對不可避免的器官功能受累，可導致患者心肌細胞異常凋亡，心室重構，心肌纖維化加劇進而造成心肌梗死等嚴重后果[10]。因此尋找有效方法控制心力衰竭心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡，減小心肌梗死面積在臨床上具有保障患者生命安全的重大意義。

圖6 DCFH-DA 染色檢測大鼠心肌組織氧化應激A：正常組,無明顯陽性細胞 B：sham 組,有少量熒光 C：模型組,心肌細胞熒光增強，ROS 含量明顯增多 D：MFC 組,心肌細胞較模型組熒光減弱，ROS 含量降低 E：MOA 組,心肌細胞較MFC 組熒光增強，ROS 含量增多，但較模型組熒光減弱，ROS 含量減少F：OAD 組,心肌細胞較其他組熒光明顯增強，ROS 含量明顯增多Fig.6 Oxidative stress in myocardial tissue of the rats detected by DCFH-DA stainingA: Normal group,no obvious positive cells; B: Sham group,little bit of fluorescence; C: Model group,the fluorescence of cardiomyocytes and ROS content increased; D: MFC group,compared with the model group,the fluorescence of cardiomyocytes and ROS content decreased; E: MOA group,compared with the MFC group,the fluorescence of cardiomyocytes and ROS content increased,while compared with the model group,the fluorescence and ROS content decreased; F:OAD group,compared with any other groups,the fluorescence of cardiomyocytes and ROS content increased

圖7 DCFH-DA 染色檢測結果統(tǒng)計圖A：正常組 B：sham 組 C：模型組 D：MFC 組 E：MOA 組F：OAD 組*P＜0.05，與正常組和sham 組相比#P＜0.05，與模型組相比△P＜0.05，與MFC 組相比 ☆P＜0.05，與模型組、MFC 組、MOA 組相比Fig.7 Statistical chart of the detection results of DCFH-DAA:Normal group; B:Sham group; C:Model group; D:MFC group; E:MOA group; F:OAD group compared with normal group and sham group,* P＜0.05;compared with model group,# P＜0.05;compared with MFC group,△P＜0.05;compared with model group,MFC group,MOA group Ratio,☆P＜0.05

鹽酸多柔比星是臨床常用的抗腫瘤藥物，與心受體具有較高的親和力而表現出明顯的心毒性，注射用鹽酸多柔比星誘導的心力衰竭動物模型病理學、機體內激素水平的改變以及血流動力學改變接近人心力衰竭時的改變[11]，本研究采用尾靜脈注射鹽酸多柔比星復制心力衰竭大鼠模型，HE 光鏡及電鏡超微結構觀察，與正常組相比，sham 組大鼠呈現明顯心力衰竭癥狀，大鼠心結構呈現心力衰竭改變，心力衰竭動物模型構建成功。冠狀動脈左前支是心的最主要的供血血管，本研究采用結扎冠狀動脈左前支復制MIRI模型，TTC 結果表明模型組大鼠心肌梗死比例增大（P＜0.05）。楊婉[12]研究表明嗎啡預處理可減輕MIRI的心肌損傷，降低心肌梗死比例；本研究結果表明，與模型組相比，MFC 組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低，心肌梗死比例明顯下降，與之研究結果一致。

圖8 Western blot 檢測大鼠心肌組織相關蛋白表達及其統(tǒng)計圖A：正常組，無Nrf2 和HO-1 表達 B：sham 組，少量Nrf2 和HO-1 表達 C：模型組，Nrf2 和HO-1 表達明顯增多 D：MFC 組，Nrf2 和HO-1 表達較模型組明顯增多 E：MOA 組，Nrf2 和HO-1 表達較MFC 組明顯減少F：OAD 組，Nrf2 和HO-1 表達較其他組明顯減少*P＜0.05，與正常組和sham 組相比#P＜0.05，與模型組相比△P＜0.05，與MFC 組相比 ☆P＜0.05，與模型組、MFC 組、MOA 組相比Fig.8 The protein expression in myocardial tissue of the rats detected by Western blotA: Normal group,without the Nrf2 and HO-1 expression; B: Sham group,a little few Nrf2 and HO-1 expression; C:Model group,the Nrf2 and HO-1 expression increased; D:MFC group,compared with the model group,the Nrf2 and HO-1 expression increased; E: MOA group,compared with the MFC group,the Nrf2 and HO-1 expression decreased; F:OAD group,compared with any other groups,the Nrf2 and HO-1 expression decreasedCompared with normal group and sham group,* P＜0.05;compared with model group,# P＜0.05;compared with MFC group,△P＜0.05;compared with model group,MFC group,MOA group Ratio,☆P＜0.05

研究表明血液再灌注期氧化應激水平升高是導致MIRI 的最基本的病理改變[13]。在MIRI 的再灌注期，心血管內皮細胞內線粒體功能受損、兒茶酚胺自我氧化增強，中性粒細胞呼吸驟增，均使ROS 產生增多，細胞內抗氧化酶相關轉運蛋白活性和表達降低，心肌細胞自我防御能力下降，ROS 在細胞和組織的大量富集，與細胞內的組分發(fā)生氧化反應，導致心肌細胞結構和能量代謝障礙，誘發(fā)細胞凋亡。Kalogeris 等[14]研究指出線粒體中ROS 水平的升高，細胞內能量代謝失衡，細胞基礎結構失去穩(wěn)定，是導致MIRI 心肌細胞異常凋亡的關鍵因素。本研究顯示模型組大鼠ROS 以及與氧化還原相關的酶和底物水平均升高，心肌細胞凋亡率隨之增高，與之前的研究一致。

Nrf2/ARE 是機體最重要的內源性抗氧化信號通路。Nrf2/ARE 調控的多數下游靶標與心血管疾病密切相關。FU 等[7]研究表明在正常生理狀態(tài)下Nrf2 與分子伴侶結合而穩(wěn)定存在于細胞漿，當心發(fā)生缺血再灌注時，富集的ROS 直接刺激Nrf2 應激轉位入核與ARE 結合，活化下游靶蛋白諸如HO-1，SOD，醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1），GSH 等的表達發(fā)揮抗氧化作用，但這種自我的抗氧化調節(jié)不足以清除MIRI 中所富集的ROS。這也是本研究中模型組大鼠ROS 量仍比sham 組和正常組高的原因。與之相比，經過嗎啡預處理后，MFC 組大鼠的ROS 明顯下降，Nrf2 的表達明顯增加；添加Nrf2/ARE 抑制劑后，MOA 組的結果與之相反，說明嗎啡預處理保護MIRI損傷是通過Nrf2/ARE 信號通路來發(fā)揮作用的，嗎啡預處理后激活Nrf2/ARE 通路，發(fā)揮抗氧化功能。

綜上所述，Nrf2/ARE 通路參與嗎啡預處理減輕鹽酸多柔比星誘導心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注損傷病理過程，嗎啡能激活Nrf2/ARE 通路，發(fā)揮抗氧化功能。但是否還有其他通路參與這一過程還需要進一步研究。