常見消毒劑對塞內(nèi)卡病毒殺滅作用的比較研究

齊志濤，王娥娥，張云星，郝蘇云，路榮，方建國，高艷華，張燕紅，陳九連

(金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010100)

塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A，SVA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種主要引起豬水皰樣病變的病毒。早在1988年即在美國豬群中開始流行傳播，并且一直在豬群中循環(huán)[1]。我國2015年首次在廣東發(fā)現(xiàn)SVA的存在[2]，此后，在我國福建、河南等多地相繼檢出SVA。豬感染后常表現(xiàn)為鼻端及蹄冠發(fā)生水皰、潰爛，發(fā)病特征與口蹄疫、豬水泡病、水泡性口炎極為相似，臨床上難以區(qū)分。在感染豬群中，母豬最易感，發(fā)病率高達70%～90%，其次是仔豬，發(fā)病率達70%，1～4日齡仔豬感染后死亡率達15%～30%[3]。雖然SVA危害性不及口蹄疫病毒，但由于感染后的發(fā)病特征類似于口蹄疫，從而在一定程度上影響了豬的上市及交易。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018年發(fā)布了《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好SVA病防治工作的通知》，可見對該疫病的重視程度。目前尚無商品化疫苗可預(yù)防該疫病，而環(huán)境與圈舍消毒則是最為有效、實用的防范措施，國外學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)過氧化氫[4]、酚類消毒劑、漂白粉能有效殺滅該病毒，國內(nèi)尚無此方面的研究。為切實開展相關(guān)研究，為疫病防控提供數(shù)據(jù)支持，維護養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)及豬肉產(chǎn)品質(zhì)量安全，本文研究了8種常用消毒劑和紫外線對SVA的殺滅作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗毒株及細胞 毒株：SVA CH/ZZ/2016株；細胞：PK-15細胞(豬腎細胞)，由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國家工程實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 消毒劑：分析純苯酚(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，常用消毒濃度為2%～5%；新潔爾滅消毒液(山東安杰高科消毒科技有限公司)，苯扎溴銨含量為2.7%～3.3%，推薦稀釋比例(原液：水)為1∶4；84消毒液(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司)，一般物體表面消毒推薦稀釋比例(原液：水)為1∶100～1∶200，百毒殺(上海派斯德生化有限公司)，圈舍器械消毒推薦使用濃度為0.02%～0.05%；NaOH(天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司)，常用消毒濃度為2%～5%；檸檬酸(天津市申泰化學(xué)試劑有限公司)，口蹄疫疫苗生產(chǎn)車間常用消毒濃度為0.2%；復(fù)方甲酚皂消毒液(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司)，推薦稀釋比例(原液：水)為1∶2；75%酒精消毒液(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司)；

中和劑：百毒殺、新潔爾滅消毒液、84消毒液的中和劑為含有5.0 g/L硫代硫酸鈉的PBS溶液；苯酚、復(fù)方甲酚皂消毒液的中和劑為含有3%吐溫-80+3%卵磷脂的PBS溶液；檸檬酸溶液的中和劑為0.75% NaHCO3溶液；NaOH溶液的中和劑為0.5% HCl溶液[5]。

標準硬水：硬度為342 mg/L，由CaCl20.034 g，MgCl2·6H2O 0.139 g，加蒸餾水至1.0 L配制而成。

其他：0.04 mol/L PH為7.4的PBS。

1.1.3 儀器設(shè)備 二級生物安全柜(香港力申發(fā)展有限公司)、水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司 HH-420)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher 14291)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗用毒株病毒滴度測定 將SVA CH/ZZ/2016株病毒液用DMEM培養(yǎng)基進行10倍系列倍比稀釋(101～108)，分別接種于單層PK-15貼壁細胞(96孔細胞培養(yǎng)板)，每個稀釋度接種4孔，置于37 ℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)細胞感染量(TCID50)。

1.2.2 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對細胞的影響 根據(jù)衛(wèi)生2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》[6]，評價中和劑、消毒劑及中和產(chǎn)物對細胞生長狀況的影響，共設(shè)立6組試驗：

第1組為消毒劑(正式試驗的最高濃度)，分別取消毒劑1.0 mL(用標準硬水分別配制5.0%苯酚溶液、5.0%檸檬酸溶液、2% NaOH溶液、0.5%百毒殺、1∶200稀釋的84消毒液、1∶2稀釋的復(fù)方甲酚皂消毒液、1∶4稀釋的新潔爾滅溶液以及未稀釋的75%酒精)接種單層PK-15細胞，補維持液9.0 mL，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h觀察細胞生長情況。

第2組為中和劑，分別取1.0 mL含5.0 g/L硫代硫酸鈉的PBS溶液、含3%吐溫-80+3%卵磷脂的PBS溶液、0.75% NaHCO3溶液和0.5% HCl溶液接種單層PK-15細胞，補維持液9.0 mL，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h觀察細胞生長情況。

第3組為中和產(chǎn)物，分別取消毒劑(5.0%苯酚溶液、5.0%檸檬酸溶液、2% NaOH溶液、0.5%百毒殺、1∶200稀釋的84消毒液、1∶2稀釋的復(fù)方甲酚皂消毒液、1∶4稀釋的新潔爾滅溶液)與適量相對應(yīng)中和劑混合，作用10 min后混合液即為中和產(chǎn)物，分別取中和產(chǎn)物1.0 mL接種單層PK-15細胞，補維持液9.0 mL，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h觀察細胞生長情況。

其余3組為對照組，分別取標準硬水、PBS和細胞維持液對照組各1.0 mL，接種單層PK-15細胞，補維持液9.0 mL，置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h觀察細胞生長情況。

1.2.3 中和劑中和效果鑒定、中和劑及中和產(chǎn)物對SVA TCID50的影響 根據(jù)衛(wèi)生2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》[6]，評價中和劑的中和作用，以及中和劑、中和產(chǎn)物對病毒滴度的影響，試驗共設(shè)立6組：

第1組為消毒劑+病毒液，分別取消毒劑5.0 mL(用標準硬水分別配制10%苯酚溶液、10%檸檬酸溶液、4% NaOH溶液、1%百毒殺、1∶100稀釋的84消毒液、1∶2稀釋的新潔爾滅溶液以及未稀釋的復(fù)方甲酚皂消毒液)與5.0 mL SVA病毒液混合，另取9.0 mL 75%酒精與1.0 mL SVA病毒液混合，于20 ℃水浴作用60 min，取樣測定TCID50；

第2組為(消毒劑+病毒液)+中和劑，分別取消毒劑5.0 mL(用標準硬水分別配制10%苯酚溶液、10%檸檬酸溶液、4% NaOH溶液、1%百毒殺、1∶100稀釋的84消毒液、1∶2稀釋的新潔爾滅溶液以及未稀釋的復(fù)方甲酚皂消毒液)與5.0 mL SVA病毒液混合，另取4.5 mL 75%酒精與0.5 mL SVA病毒液混合，于20 ℃水浴作用60 min取出混合液0.1 mL，加0.9 mL相應(yīng)中和劑室溫作用5 min，75%酒精試驗組加0.9 mL維持液稀釋即可，分別取樣測定TCID50；

第3組為中和產(chǎn)物(消毒劑+中和劑)+病毒液，分別取消毒劑1.0 mL(用標準硬水分別配制10%苯酚溶液、10%檸檬酸溶液、4% NaOH溶液、1%百毒殺、1∶100稀釋的84消毒液、1∶2稀釋的新潔爾滅溶液以及未稀釋的復(fù)方甲酚皂消毒液)加入9.0 mL相應(yīng)中和劑室溫作用5 min，分別取混合液5.0 mL與等量SVA病毒液混合，20 ℃水浴作用60 min，取樣測定TCID50；

第4組為(標準硬水+病毒液)+中和劑，取標準硬水5.0 mL與等量SVA病毒液混合，于20 ℃水浴作用60 min后取4.0 mL均分4份，每份1.0 mL，分別加入4種中和劑9.0 mL作用5 min，取樣測定TCID50；

第5組為(標準硬水+病毒液)+PBS，取標準硬水5.0 mL與等量SVA病毒液混合，于20 ℃水浴作用60 min后取1.0 mL，加入1.0 mL PBS作用5 min，取樣測定TCID50；

第6組為標準硬水+PBS不接毒組，取標準硬水5.0 mL與等量PBS混合，于20 ℃水浴作用60 min后取樣測定TCID50。

1.2.4 SVA殺滅試驗 用標準硬水將所有消毒劑配制為雙倍試驗濃度，即4.0%、10.0%的苯酚溶液，復(fù)方甲酚皂原液及1∶2稀釋液，0.4%、4.0%、10.0%檸檬酸溶液，1.0%、2.0%、4.0%、10.0%NaOH溶液，0.04%、0.1%、0.4%、1.0%百毒殺，1∶2、1∶4稀釋的新潔爾滅，1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋的84消毒液，分別吸取5.0 mL上述消毒劑及5.0 mL標準硬水置于15 mL離心管內(nèi)，于20 ℃水浴中作用5 min，分別加入5.0 mL SVA病毒液，另取9.0 mL 75%酒精加入1.0 mL SVA病毒液，立即混勻于20 ℃水浴中作用至試驗規(guī)定時間(10 min、30 min、60 min)，立即取出0.1 mL混合液，加入0.9 mL相應(yīng)中和劑混勻，75%酒精組及標準硬水組加入0.9 mL細胞維持液，作用10 min后測定TCID50。如此試驗重復(fù)3次，計算各組平均滅活對數(shù)值。

取SVA病毒液5.0 mL加5.0 mL細胞維持液混勻，吸取2.5 mL平鋪于底面積為12.56 cm2的平皿中，平皿開蓋置于生物安全柜中用紫外線照射，照射強度為90 μW/cm2，同時設(shè)立同等條件下遮擋紫外線的對照組。作用至試驗規(guī)定時間(10 min、30 min、60 min)，立即取出0.1 mL，加入0.9 mL細胞維持液混勻，測定TCID50。如此試驗重復(fù)3次，計算各組平均滅活對數(shù)值。

1.2.5 平均滅活對數(shù)值的計算及對比： 設(shè)陽性(病毒)對照組TCID50為NO，試驗(消毒)組TCID50)NX，平均滅活對數(shù)值= log No-log Nx[6]，對比各種消毒劑對SVA的殺滅效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗用毒株病毒滴度測定 經(jīng)測定，試驗用SVA病毒液TCID50為10-7.0/0.1 mL。

2.2 消毒劑、中和劑及中和產(chǎn)物對細胞生長狀況的影響 結(jié)果如圖1所示，除百毒殺組(H所示)細胞出現(xiàn)稍許變圓、漂浮、數(shù)量減少以外，其他各組消毒劑均未對細胞生長產(chǎn)生明顯影響；5.0 g/L硫代硫酸鈉的PBS組(M所示)細胞出現(xiàn)少量變圓、漂浮的情況，其他中和劑實驗組細胞生長未見異常；各中和產(chǎn)物對細胞生長未造成顯著影響；由消毒劑或中和劑造成的細胞異常生長與SVA引起的細胞病變有明顯區(qū)別。

注：圖A～C分別為細胞維持液、PBS、標準硬水對細胞生長影響的情況；圖D細胞病變；圖E～L分別為消毒劑苯酚溶液、復(fù)方甲酚皂溶液、NaOH溶液、百毒殺溶液、新潔爾滅溶液、84消毒液、75%酒精及檸檬酸溶液對細胞生長影響情況；圖M～P分別為中和劑5.0 g/L硫代硫酸鈉的PBS、3%吐溫-80+3%卵磷脂的PBS、0.75%碳酸氫鈉溶液及0.5% HCl溶液對細胞生長影響情況；圖Q～W分別為苯酚、復(fù)方甲酚皂、檸檬酸、NaOH、百毒殺、新潔爾滅和84消毒液與相應(yīng)中和劑的中和產(chǎn)物對細胞生長影響情況。

2.3 中和劑中和效果鑒定、中和劑及中和產(chǎn)物對SVA TCID50的影響 表1、表2結(jié)果顯示，第1組試驗中苯酚組、NaOH組和84消毒液組TCID50檢測結(jié)果為0，其他消毒劑組均不低于5.50；第2組試驗中，苯酚組TCID50為2.50，NaOH組和84消毒液組TCID50為2.00，其他消毒劑組為5.50；第3、4、5組測定結(jié)果相同，TCID50在5.00～5.50之間；第6組細胞生長未見異常。結(jié)果表明，試驗中所用中和劑均可中和相應(yīng)消毒劑的消毒作用，中和劑及中和產(chǎn)物均不影響病毒滴度。

2.4 SVA殺滅試驗結(jié)果 以下結(jié)果為不同消毒劑對SVA的平均滅活對數(shù)值，滅活對數(shù)值越大，表明滅活效果越強。

2.4.1 不同濃度苯酚溶液對SVA殺滅試驗結(jié)果 表3結(jié)果顯示，濃度為5.0%的苯酚溶液與SVA作用時間至少為10 min時，對其滅活對數(shù)值為5.50，表明SVA被完全殺滅；當苯酚濃度為2.0%時，與SVA作用60 min滅活對數(shù)值為3.00，表明病毒未完全殺滅。

2.4.2 不同濃度復(fù)方甲酚皂溶液對SVA殺滅試驗結(jié)果 表4結(jié)果顯示，以1∶2和1∶4稀釋的復(fù)方甲酚皂消毒劑，與SVA作用60 min時，滅活對數(shù)值分別為0.75和0.25，表明病毒未被殺滅。

2.4.3 不同濃度檸檬酸溶液對SVA殺滅試驗結(jié)果 表5結(jié)果顯示，濃度為0.2%與2.0%的檸檬酸溶液與SVA作用60 min時，兩種濃度消毒劑對病毒的平均滅活對數(shù)值為0.75，濃度為5.0%的檸檬酸溶液與病毒作用60 min時，滅活對數(shù)值為1.5，結(jié)果表明，試驗所用濃度的檸檬酸溶液不能殺滅SVA。

表1 中和產(chǎn)物對病毒滴度的影響

表2 中和劑對病毒滴度的影響

表3 苯酚對SVA殺滅試驗結(jié)果

表4 不同濃度甲酚皂溶液對SVA殺滅試驗結(jié)果

表5 檸檬酸溶液對SVA殺滅試驗結(jié)果

2.4.4 不同濃度NaOH溶液對SVA殺滅試驗結(jié)果表6結(jié)果顯示，用濃度為0.5%、1.0%、2.0%和5.0%的NaOH溶液，分別與SVA作用至少10 min時，各組滅活對數(shù)值均為5.50，表明該病毒被完全殺滅。

2.4.5 不同濃度百毒殺溶液對SVA殺滅試驗結(jié)果表7結(jié)果顯示，濃度為0.02%的百毒殺與SVA作用60 min時，滅活對數(shù)值為0.50；同樣作用60 min，百毒殺濃度為0.05%及0.2%時，滅活對數(shù)值為0.75，百毒殺濃度為0.5%時，滅活對數(shù)值為1.00，表明病毒未被殺滅。

2.4.6 不同濃度新潔爾滅溶液對SVA殺滅試驗結(jié)果 表8結(jié)果顯示，以1∶4比例稀釋的新潔爾滅消毒液與SVA作用60 min，平均滅活對數(shù)值為1.00；1∶8稀釋組平均滅活對數(shù)值為0.50，表明SVA未被殺滅。

表6 NaOH對SVA殺滅試驗結(jié)果

表7 百毒殺對SVA殺滅試驗結(jié)果

表8 新潔爾滅對SVA殺滅試驗結(jié)果

2.4.7 不同濃度84消毒液對SVA殺滅試驗結(jié)果表9結(jié)果顯示，以1∶100、1∶200比例稀釋的84消毒液與SVA作用10 min，對病毒平均滅活對數(shù)值為5.50，表明病毒被完全殺滅，以1∶400、1∶800比例稀釋的84消毒液對SVA作用60 min，平均滅活對數(shù)值為1.00，表明病毒未被完全殺滅。

表9 84消毒液對SVA殺滅試驗結(jié)果

表10 75%酒精、紫外線對SVA殺滅試驗結(jié)果

圖2 不同消毒劑對SVA殺滅效果的對比

2.4.8 75%酒精、紫外線對SVA殺滅試驗結(jié)果75%酒精與SVA作用10 min時，平均滅活對數(shù)值為3.50，作用30 min時，滅活對數(shù)值為5.00，當作用60 min時，平均滅活對數(shù)值為5.50，表明75%酒精作用60 min可將SVA完全殺滅；在紫外線照射作用10 min時，對SVA的平均滅活對數(shù)值為4.25；照射30 min時，平均滅活對數(shù)值為5.50，表明SVA被完全殺滅；紫外線對照組平均滅活對數(shù)值為0，表明毒價未降低；標準硬水與SVA作用60 min平均滅活對數(shù)值為0，表明標準硬水對SVA無殺滅作用，上述試驗成立。

2.5 不同消毒劑對SVA殺滅效果的對比 選取上述結(jié)果中消毒劑對SVA最佳殺滅濃度，以及完全殺滅病毒的最低濃度數(shù)據(jù)進行對比分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，5.0%苯酚溶液、0.5%NaOH溶液對SVA殺滅效果最好，均可在10 min殺滅病毒；其次為1∶200稀釋的84消毒液，作用30 min即可將SVA完全殺滅；紫外線對病毒殺滅作用比1∶200的84消毒液稍弱，但也能在30 min殺滅SVA；75%酒精對SVA殺滅作用不及前幾種消毒劑，需要60 min才能殺滅；其他消毒劑，包括1∶2復(fù)方甲酚皂消毒液、5.0%檸檬酸溶液、0.5%百毒殺及1∶4新潔爾滅溶液對SVA殺滅作用弱，60 min內(nèi)不能殺滅病毒。

3 討論與結(jié)論

選取8種常見消毒劑和紫外線，設(shè)置不同濃度和作用時間，評估對SVA的殺滅效果。結(jié)果表明，5.0%的苯酚溶液、0.5%以上的NaOH溶液、低于1∶200濃度的84消毒液、75%酒精以及紫外線對SVA有較強的殺滅作用，其他消毒劑對SVA殺滅作用較弱甚至無作用。

臨床上常用1.0%～5.0%的苯酚溶液對醫(yī)療器械及排泄物進行消毒[7]，有研究表明，苯酚類消毒劑也適用于潔凈室的常規(guī)清潔消毒。Azad Singh等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，使用推薦濃度的酚醛類消毒劑在25 ℃和4 ℃的溫度下，能殺滅物體表面82.41%的SVA，本研究證明，5.0%的苯酚溶液對SVA有較強殺滅作用，且苯酚濃度符合國標[9]。因此，開展SVA相關(guān)研究的實驗室，可以參考用5.0%的苯酚溶液處理某些試驗器械及廢棄物，以保證實驗室生物安全；復(fù)方甲酚皂消毒劑與苯酚同屬于酚類消毒劑，但使用推薦濃度對SVA殺滅作用遠遠不及苯酚溶液。

NaOH價格低廉、消毒作用強。養(yǎng)殖場在實際生產(chǎn)過程中，通常用2.0%～5.0%的NaOH溶液，對空舍、車輛及人員鞋底進行消毒。依據(jù)本研究結(jié)果，用0.5%的NaOH溶液作用10 min即可有效殺滅SVA，遠低于通常使用濃度，為豬場對SVA病的預(yù)防提供了重要的理論依據(jù)。0.2%濃度檸檬酸溶液對口蹄疫病毒具有良好的消毒效果，但0.2%、2.0%和5.0%三種濃度檸檬酸溶液對SVA均無明顯殺滅作用。研究結(jié)果提示，SVA與口蹄疫在發(fā)病臨床癥狀極為相似，但病原理化特性差異較大，適合口蹄疫病毒的消毒劑或消毒方法可能并不完全適用于SVA。

百毒殺主要成分是溴化二甲基二癸基烴銨，畜舍、器具消毒推薦使用濃度為0.015%～0.05%。本研究發(fā)現(xiàn)，以推薦濃度對SVA進行消毒，效果極其微弱，甚至10倍推薦濃度的百毒殺對SVA作用也不顯著。新潔爾滅與百毒殺同屬于季銨鹽類消毒劑，推薦使用濃度(1∶4稀釋，苯扎溴銨含量約0.6%)對SVA殺滅效果也不理想，可見生產(chǎn)中不適合用百毒殺和新潔爾滅對SVA進行消毒。

84消毒液的主要成分是次氯酸鈉，是一種常見的含氯消毒劑。研究發(fā)現(xiàn)，推薦濃度的84消毒液(有效氯含量700～100 mg/L)對SVA殺滅作用強，濃度低于1∶400以下時，對SVA殺滅效果明顯降低；Azad Singh等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，稀釋度為1∶20的漂白粉在10 min～15 min內(nèi)可殺滅物體表面99%以上的SVA，84消毒液與漂白粉都屬于次氯酸鹽，說明SVA對次氯酸鹽較敏感，臨床上可用此類消毒劑殺滅豬場圈舍地面或排泄物中的SVA。

研究發(fā)現(xiàn)75%酒精對SVA有一定殺滅作用，但不能瞬間殺滅病毒，作用時間需要60 min以上。酒精易揮發(fā)，通常用噴灑或涂擦的方式對物體表面消毒，噴灑或涂擦后濃度難以維持60 min，因此，在實驗室內(nèi)不建議使用75%酒精處理SVA。

紫外線對消毒物品損傷小，且不涉及藥物殘留及污染的問題，在口蹄疫生產(chǎn)車間常用于空氣和操作臺表面消毒[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，SVA經(jīng)生物安全柜內(nèi)的紫外線照射30 min，即可被殺滅。此結(jié)果提示，在生產(chǎn)中，可以用紫外線照射的方式對物體表面、無菌操作室及空氣消毒，以防止SVA的散播。