三類常用消毒劑對非洲豬瘟病毒滅活效果的評價

南文龍, 鞏明霞, 鄒艷麗, 劉珊,陸游,2, 吳曉東*，陳義平*

(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032; 2.揚州大學(xué), 江蘇揚州 225009)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。自2018年8月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布沈陽沈北新區(qū)發(fā)生首起非洲豬瘟疫情[1]至今，非洲豬瘟已蔓延至我國多個省市自治區(qū)，給養(yǎng)豬業(yè)及相關(guān)行業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失和深遠影響。

ASFV對高溫、腐敗、干燥、凍融、超聲波和極端pH 值等環(huán)境條件具有較強的抵抗能力，但本身作為囊膜病毒，對消毒劑的抵抗能力較差，常用的消毒劑均可有效將其滅活[2-4]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《感染非洲豬瘟養(yǎng)殖場恢復(fù)生產(chǎn)技術(shù)指南》、《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實施方案》(2020 年第二版)、《非洲豬瘟常態(tài)化防控技術(shù)指南(試行版)》等系列防控文件中，均對用于ASFV防控用消毒劑種類和使用方法進行了推薦。

當(dāng)前我國生豬產(chǎn)業(yè)實踐中在使用多種不同類型、組方及工作濃度的消毒劑產(chǎn)品，對ASFV的滅活效力凾需科學(xué)、客觀評價。本研究選擇市售常用的戊二醛類、酚類、含氯類消毒劑，參考OIE 參考實驗室有關(guān)操作流程，評價其對ASFV的滅活效果，以期為生豬養(yǎng)殖、運輸調(diào)運、屠宰加工、檢驗檢疫等工作中消毒劑的選擇和使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 消毒劑 收集市面常見的戊二醛類、酚類、含氯類消毒劑，其中戊二醛類6 種，商品代號A1～A6；酚類6 種，商品代號B1～B6；含氯類3種，商品代號C1～C3。消毒劑產(chǎn)品詳細(xì)信息見表1，試驗時消毒劑均在有效期內(nèi)。

1.2 病毒 非洲豬瘟病毒African Swine Fever Virus isolate CN2018/1株，由國家非洲豬瘟參考實驗室分離鑒定。

1.3 試劑與耗材 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品；細(xì)胞瓶及96孔細(xì)胞板購自Corning公司。

1.4 豬肺泡巨噬細(xì)胞、豬紅細(xì)胞和血清的制備 無菌采集健康豬肺臟，向肺臟注入滅菌PBS灌洗數(shù)次，收集灌洗液，離心收集豬肺泡巨噬細(xì)胞，按5×106/mL濃度100 μL/孔接種96孔板。次日鋪板，進行測試。同步無菌采集抗凝血，離心收集血清，之后將細(xì)胞沉淀洗滌3～5次，棄去白細(xì)胞和血小板，用PBS配成10%豬紅細(xì)胞懸液，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)影響試驗 依據(jù)畜禽欄舍、運載工具、器具消毒目的，按消毒劑說明書推薦合理選擇高、中、低3個工作濃度，并將消毒劑原液制成10倍工作濃度備用。將0.1 mL 10倍工作濃度液加入到0.9 mL含1%豬血清的PBS中充分混合，混合物分別在20 ℃和4 ℃條件下作用30 min。陰性對照組，直接取1 mL含1%豬血清的PBS，按相同條件作用處理。

表1 消毒劑產(chǎn)品信息表

作用結(jié)束后，采用含1%豬血清的PBS連續(xù)10倍稀釋上述各組作用后產(chǎn)物至10-8，每孔50 μL接種豬肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物，同時加入1%豬紅細(xì)胞10 μL，每個稀釋度(含未稀釋作用產(chǎn)物即原液)做4重復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)6 d，觀察記錄細(xì)胞狀態(tài)。評估消毒劑對豬肺泡巨噬細(xì)胞和豬紅細(xì)胞狀態(tài)影響，用于消毒劑對ASFV滅活作用試驗參照。

1.6 消毒劑對非洲豬瘟病毒滅活作用試驗 參考OIE參考實驗室開展的消毒劑對ASFV滅活效力評估操作流程，制定本試驗方案。按1.5方法，稀釋消毒劑至10倍工作濃度備用。測試組，將0.1 mL 10 倍工作濃度液和0.1 mL ASFV培養(yǎng)物加入到0.8 mL含1%豬血清的PBS中充分混合，混合物分別在20 ℃和4 ℃ 條件下作用30 min。陽性對照組，將0.1 mL ASFV 培養(yǎng)物加入到0.9 mL含1%豬血清的PBS中充分混合，按相同條件作用處理。陰性對照組，直接取1 mL含1%豬血清的PBS，按相同條件作用處理。

作用結(jié)束后，用含1%豬血清的PBS連續(xù)10倍稀釋各組作用后產(chǎn)物至10-8，每孔50 μL接種豬肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物，同時加入1%豬紅細(xì)胞10 μL，每個稀釋度(含未稀釋作用產(chǎn)物即原液)做4重復(fù)孔。將96 孔板置于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)6 d，每天觀察、記錄并統(tǒng)計各稀釋度培養(yǎng)孔中紅細(xì)胞吸附(Hemadsorption, HAD)反應(yīng)結(jié)果；如結(jié)果可疑或無法判定，再次傳代后綜合判定結(jié)果。重復(fù)試驗2次，統(tǒng)計消毒劑不同工作濃度下各培養(yǎng)孔中HAD結(jié)果，采用Reed-Muench法計算半數(shù)紅細(xì)胞吸附量(HAD50)，測定病毒滴度Log10HAD50/mL。參照衛(wèi)生部頒布的2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》[5]計算平均滅活對數(shù)值，消毒后平均滅活對數(shù)值≥4，判為有效滅活A(yù)SFV。平均滅活對數(shù)值按如下方法計算：設(shè)陽性對照組平均病毒感染滴度(HAD50)為N0，試驗(消毒)組平均病毒感染滴度(HAD50)為Nx，平均滅活對數(shù)值 = log10N0-log10Nx。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)影響試驗結(jié)果 戊二醛類、酚類、含氯類消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)影響結(jié)果詳見表2。其中，戊二醛類、酚類消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)影響可見于原液、10-1～10-3稀釋孔中，主要表現(xiàn)為豬肺泡巨噬細(xì)胞和豬紅細(xì)胞死亡固定(當(dāng)細(xì)胞孔中消毒劑有效成分含量較高時)與不同程度的破碎、崩解。含氯類消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)影響相對較小，僅消毒劑C1的1∶300、C2的1∶200、C3的 1∶200和1∶400工作濃度的原液孔中，與陰性對照組相比，豬肺泡巨噬細(xì)胞和豬紅細(xì)胞輪廓略顯模糊、折光性下降，狀態(tài)相對較差，但形態(tài)未見明顯異常。

表2 消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)影響試驗結(jié)果

2.2 消毒劑對非洲豬瘟病毒滅活作用試驗結(jié)果 陽性對照組培養(yǎng)6 d后發(fā)生顯著細(xì)胞病變，豬肺泡巨噬細(xì)胞大量萎縮、死亡脫落，部分豬肺泡巨噬細(xì)胞聚團且附著大量豬紅細(xì)胞，經(jīng)Reed-Muench法計算病毒液滴度為107.2HAD50/mL。陰性對照組中細(xì)胞形態(tài)無異常，豬肺泡巨噬細(xì)胞輪廓清晰，大多數(shù)呈圓形或橢圓形，均勻附著于96孔板底，豬紅細(xì)胞均勻散落于豬肺泡巨噬細(xì)胞間隙中。

消毒劑對ASFV 滅活檢測結(jié)果詳見表3。6 種戊二醛類消毒劑和6種酚類消毒劑，在本試驗中各工作濃度下原液及不同稀釋度培養(yǎng)孔中均未發(fā)現(xiàn)HAD現(xiàn)象，與陽性對照相比，平均滅活對數(shù)為7.2，表明有效滅活A(yù)SFV。參照消毒劑說明書主要成分綜合分析，戊二醛類消毒劑中，有效成分濃度≥0.1%的戊二醛(A1的1∶200工作濃度)，或≥0.05%戊二醛+ 0.03%苯扎氯銨(A3的1∶300工作濃度)，或≥0.0025%戊二醛+0.0025%癸甲溴銨(A5、A6的1∶2000工作濃度)，均可有效滅活A(yù)SFV。酚類消毒劑中，有效成分濃度≥0.1%的酚41%～ 49%、醋酸22%～26%和十二烷基苯磺酸(B5的1∶1000工作濃度)，或≥0.015%鄰苯基苯酚+0.015%對氯間甲酚(B3的1∶800工作濃度)，均可有效滅活A(yù)SFV。3種含氯類消毒劑(成分二氯異氰脲酸鈉)則需在說明標(biāo)明濃度范圍的較高工作濃度——C1的1∶300、C2的1∶200及C3的1∶200和1∶400才未發(fā)現(xiàn)HAD現(xiàn)象，綜合分析有效成分濃度≥0.1%有效氯時，平均滅活對數(shù)為7.2，表明有效滅活A(yù)SFV。

3 討論與結(jié)論

目前，在非洲豬瘟疫情應(yīng)急處置和養(yǎng)殖場日常防控工作中，主要依靠撲殺和執(zhí)行高水平的生物安全措施，使用化學(xué)消毒劑殺滅病毒阻斷傳播，仍是現(xiàn)階段ASFV防控依賴的重要手段。

本研究中所用消毒劑對ASFV均有滅活作用，但滅活效果因消毒劑的種類和工作濃度不同有所差異。相同工作濃度的同一消毒劑產(chǎn)品，在4 ℃和20 ℃這兩種條件下的滅活效果基本一致。戊二醛類和酚類消毒劑，在說明書推薦的工作濃度下，均可有效滅活A(yù)SFV；含氯類消毒劑需在其說明書標(biāo)明濃度范圍的較高工作濃度時，即有效氯濃度≥0.1%時，可有效滅活A(yù)SFV。

表3 消毒劑對非洲豬瘟病毒滅活試驗結(jié)果

與含氯類消毒劑相比，戊二醛類和酚類消毒劑對細(xì)胞毒性作用更加明顯，臨場使用保證消毒效果的同時，應(yīng)注意控制工作濃度并減少人員暴露。含氯類消毒劑毒性相對較小，但消毒效果易受到環(huán)境有機物影響。Shirai等[6]研究表明，有效氯濃度為0.03%～0.0075%的次氯酸鈉，即在細(xì)胞水平上有效滅活A(yù)SFV，平均滅活對數(shù)為4.5。Krug等[7]研究顯示，濃度為2000 ppm 次氯酸鈉才可有效滅活木材表面上的ASFV，平均滅活對數(shù)為4.43，其所用工作濃度顯著高于細(xì)胞水平驗證濃度。本研究測試有效成分為二氯異氰脲酸鈉的消毒劑，有效氯濃度為0.1%時，可有效滅活細(xì)胞培養(yǎng)物中的ASFV，臨場使用時可根據(jù)消毒對象性質(zhì)適當(dāng)提高其工作濃度。

本研究從細(xì)胞水平上評價了戊二醛類、酚類、含氯類消毒劑對ASFV的滅活效力，結(jié)果表明在適當(dāng)工作濃度下三類消毒劑均可有效滅活A(yù)SFV。臨場消毒時，除選擇適當(dāng)?shù)南緞┓N類和工作濃度外，在消毒前進行有效機械清潔，并確保適當(dāng)作用溫度和時間，方可獲得較好消毒效果[8]。本研究將為生豬養(yǎng)殖、運輸調(diào)運、屠宰加工、檢驗檢疫等工作中的消毒劑選擇和使用提供參考。