基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的魚腥草滴眼液治療干眼作用機制探討△

農(nóng)璐琪，劉自強，韓夢雨，訾迎新，鄧宇，孟歡，金明

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中日友好醫(yī)院 眼科，北京 100029

干眼是近年來眼科門診常見疾病之一，是指任何原因?qū)е碌臏I液的質(zhì)、量或流體動力學異常造成的以眼睛干澀、燒灼感等眼部不適癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，中醫(yī)歸屬于白澀癥、神水將枯范疇，滋陰為其主要治療原則。魚腥草滴眼液是臨床眼科門診常用中藥滴眼液之一，主要用于治療急慢性角結(jié)膜炎等炎性眼表疾病。其主要組成為三白草科蕺菜的新鮮全草[1]，即魚腥草，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋等作用；藥理學研究證實魚腥草具有抗炎、抗病毒、抗菌等作用[2]。近年亦有采用魚腥草滴眼液治療干眼的研究[3]，收效甚佳?；诟裳叟c炎癥相關(guān)的發(fā)病機制，推測魚腥草滴眼液治療干眼與抗炎有關(guān)，但其治療干眼的作用機制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是近年新興的用于研究中藥活性成分和作用靶點的新策略[4]，能夠從多方面闡釋藥物治療疾病的潛在作用機制，體現(xiàn)藥物作用的整體性和系統(tǒng)性[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，構(gòu)建魚腥草-干眼的活性成分及作用靶點網(wǎng)絡(luò)，以期明確魚腥草治療干眼的作用機制，為臨床治療提供參考。

1 方法

1.1 魚腥草滴眼液活性成分收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw. com/tcmsp.php)檢索滴眼液主要組分魚腥草中含有的有效成分，根據(jù)化合物類藥性規(guī)則并結(jié)合魚腥草活性成分相關(guān)文獻對化合物進行篩選，設(shè)定篩選標準為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18或符合Lipinski類藥性五原則均納入，并結(jié)合魚腥草活性成分相關(guān)文獻對可能遺漏的有效成分進行補充[6-7]。

1.2 魚腥草作用靶點與干眼疾病靶點獲取

利用TCMSP中的藥物相關(guān)靶點預測功能，收集魚腥草有效成分的作用靶點，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)將靶點名稱統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名，合并重復靶點并刪除無對應(yīng)基因名的靶點以便后續(xù)網(wǎng)絡(luò)拓撲圖構(gòu)建。以關(guān)鍵詞“dry eye”“xerophthalmia”在GeneCards(https：//www.genecards.org/)和OMIM(https：//omim.org/)數(shù)據(jù)庫中進行檢索，得到干眼疾病相關(guān)靶點。對兩者取交集匹配，初步得到魚腥草與干眼相關(guān)的作用靶點，即魚腥草治療干眼的潛在作用靶點。

1.3 構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)拓撲圖

將所得到的魚腥草治療干眼的潛在作用靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2軟件，進行可視化操作，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)拓撲圖。其中，節(jié)點代表魚腥草及其有效成分、干眼疾病、作用靶點等；邊代表魚腥草與有效成分、有效成分與作用靶點、干眼疾病與作用靶點之間的相互關(guān)系。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將所得到的魚腥草治療干眼的潛在作用靶點數(shù)據(jù)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)中，物種定義為“Homo sapiens”，即“人類”，構(gòu)建魚腥草治療干眼的PPI網(wǎng)絡(luò)，去除無相互作用關(guān)系的靶點，輸出PPI網(wǎng)絡(luò)圖并統(tǒng)計關(guān)鍵靶點度(degree)值。

1.5 基因本體(GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用Bioconductor(http：//www.bioconductor.org/)數(shù)據(jù)庫R語言軟件包對魚腥草治療干眼的潛在作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定P<0.05，得到關(guān)鍵靶點及其參與和影響的關(guān)鍵功能和關(guān)鍵作用通路。

2 結(jié)果

2.1 魚腥草有效成分的篩選結(jié)果

TCMSP數(shù)據(jù)庫共收錄魚腥草化學成分50種，根據(jù)類藥性相關(guān)規(guī)則進行化合物篩選，并結(jié)合魚腥草活性成分相關(guān)文獻對可能遺漏的有效成分進行補充，得到包括癸醛、乙酸龍腦酯、山柰酚、槲皮素、蘆丁等在內(nèi)的有效成分共30種，化合物名稱及相對分子質(zhì)量(MW)、脂水分配系數(shù)(AlgP)、氫鍵供體數(shù)(Hdon)、氫鍵受體數(shù)(Hacc)、OB、DL數(shù)據(jù)見表1。

2.2 魚腥草治療干眼潛在作用靶點預測

共收集到魚腥草有效成分作用靶點347個，干眼疾病靶點3650個，藥物與疾病靶點取交集后得到潛在作用靶點128個。

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)拓撲圖分析

構(gòu)建的魚腥草治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖如圖1所示，圖中共有節(jié)點153個，分別代表藥物魚腥草(綠色塊)、干眼(紅色塊)、有效成分(紫色塊)及基因靶點(藍色塊)；邊412條，代表各屬性之間的相互作用關(guān)系。從圖1中可以看出，魚腥草治療干眼的有效成分有23個，包括癸醛、乙酸龍腦酯、山柰酚、槲皮素、蘆丁等；根據(jù)Cytoscape 3.7.2軟件分析結(jié)果(表2)，其中起主要作用(與各靶點聯(lián)系較多，即度值較高的)的有山柰酚、槲皮素、蘆丁等。

表1 魚腥草有效成分

圖1 魚腥草治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)拓撲圖

表2 魚腥草治療干眼的核心化合物

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

魚腥草治療干眼的潛在作用靶點之間PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建見圖2，為顯示更簡潔，設(shè)定最小combined score>0.9。圖中蛋白質(zhì)節(jié)點共128個，相互作用的邊383條，其中度值排名前20位的靶點見圖3，前10名關(guān)鍵靶點分別是Jun、蛋白激酶B1(Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、白細胞介素-6(IL-6)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RelA)、白細胞介素-8(CXCL8)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)、MAPK8和IL-1β。

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集結(jié)果分析

圖4所示為魚腥草治療干眼的潛在作用靶點GO功能富集結(jié)果，可以看到潛在靶點參與調(diào)控的功能主要有細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活動(receptor ligand activity)、細胞因子活性(cytokine activity)、核受體活性(nuclear receptor activity)等。

注：圖中圓圈代表蛋白；圈與圈之間連線代表兩者之間存在相互作用關(guān)系。

圖3 魚腥草治療干眼排名前20的靶點

魚腥草治療干眼的潛在作用靶點KEGG通路富集結(jié)果如圖5所示，主要富集在與糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物及其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)、白細胞介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、缺氧誘導因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、細胞凋亡(apoptosis)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)等有關(guān)的通路上，提示魚腥草治療干眼的機制可能與抗晚期糖基化、抗炎、抑制細胞凋亡等相關(guān)。

3 討論

干眼是近年來得到廣泛關(guān)注的眼表疾病之一，截至2018年，全球的干眼發(fā)病率為5.5%～33.7%，我國的干眼發(fā)病率為21%～30%[8]。干眼的發(fā)病因素很多，包括環(huán)境、年齡、性別及全身性疾病在內(nèi)的許多因素都會導致干眼[9]。此外，還有視屏終端綜合征、空氣污染等危險因素。中醫(yī)認為陰虛津虧、燥傷津液是干眼發(fā)病的主要原因[10]，而西醫(yī)則認為其發(fā)病除淚膜不穩(wěn)定這一核心機制外，與眼表高滲透壓、眼表炎癥、神經(jīng)感覺異常等機制亦有關(guān)聯(lián)[9]。針對這些病因，臨床干眼治療多從保持眼球濕潤、抗炎、滋陰等方面入手，西醫(yī)主要方法是使用針對病因的滴眼液點眼治療，此種方法作用效果單一，因此魚腥草滴眼液等中藥滴眼液近年在臨床使用日趨廣泛。

圖4 魚腥草治療干眼靶點的GO功能富集分析

圖5 魚腥草治療干眼靶點的KEGG通路富集分析

本研究通過構(gòu)建魚腥草滴眼液治療干眼的“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)，對魚腥草治療干眼的潛在作用機制進行探究。結(jié)果顯示，魚腥草在治療干眼時發(fā)揮核心作用的化合物有槲皮素、山柰酚和蘆丁，三者均屬黃酮類化合物，具有豐富的藥理活性，廣泛存在于食用和藥用植物中。實驗證實，山柰酚能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生[11]，減少TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表達，發(fā)揮抗氧化和抗炎作用；還可抑制凋亡蛋白表達，發(fā)揮抗凋亡作用[12]；此外還具有抗癌、保護神經(jīng)等作用[13]。槲皮素作用與其類似[14]，除抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用外，還具有廣譜抑菌活性，對包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種細菌發(fā)揮抑制作用[15]，而金黃色葡萄球菌是容易導致眼表炎癥的重要細菌之一。蘆丁可清除自由基，抗氧化作用顯著，亦可發(fā)揮抗病毒、抑菌、抗炎等作用[16]。

魚腥草治療干眼的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子Jun、Akt1、MAPK1、IL-6、RelA、CXCL8、VEGFA、EGFR、MAPK8和IL-1β10個靶點可能是與作用機制相關(guān)的關(guān)鍵靶點，而GO分析則提示，上述關(guān)鍵靶點通過影響細胞因子受體結(jié)合、受體配體活動、細胞因子活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、整合蛋白結(jié)合等功能對干眼進行調(diào)控。干眼的發(fā)生發(fā)展過程涉及眾多細胞因子，這些細胞因子及其受體配體的活性影響炎癥、細胞凋亡等相關(guān)發(fā)病過程[9]。Jun參與了轉(zhuǎn)錄因子激活子蛋白-1(AP-1)的合成，轉(zhuǎn)錄因子AP-1不僅調(diào)控細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化，還參與了體內(nèi)免疫系統(tǒng)調(diào)控，從而能夠影響炎癥反應(yīng)[17]。Akt1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)控細胞凋亡與生長增殖方面發(fā)揮著重要作用。CXCL-8即IL-8，與IL-6、IL-1β都是重要的炎癥介質(zhì)，在干眼患者淚液及血液中的高表達證實了干眼由炎癥介導的發(fā)病機制，一定程度上對干眼的嚴重程度產(chǎn)生了影響[18-19]。它們與受體結(jié)合后能夠使多種炎癥因子釋放[20]，并導致信號轉(zhuǎn)導通路介導的生物效應(yīng)發(fā)生，絲裂原激活的蛋白激酶通路就是其中之一。MAPK1和MAPK8均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，其表達與細胞生長發(fā)育相關(guān)。有研究表明，MAPK信號通路參與了高滲透壓導致的角膜上皮損傷，這是干眼發(fā)病機制的又一新線索[21]。RelA是核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的一種蛋白質(zhì)亞基，其翻譯后修飾能夠參與調(diào)控NF-κB的各項功能，如抑制細胞凋亡[22]。EGFR與相應(yīng)配體結(jié)合后會激活相應(yīng)通路控制相應(yīng)細胞增殖分化，淚液中表皮生長因子(EGF)對于維持眼表微環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義[23]，而干眼的眼表微環(huán)境損害則可能與EGF表達下調(diào)有關(guān)。VEGFA為VEGF的一種，VEGF參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展過程，在糖尿病干眼患者淚液中有高表達[24]，VEGF及其受體與角膜損傷過程亦有密切的關(guān)系[25]。這些靶點都是魚腥草治療干眼的關(guān)鍵靶點，提示魚腥草治療干眼可能與抑制或阻止角膜上皮損傷形成有關(guān)。

根據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果，魚腥草治療干眼的潛在作用靶點主要富集在與炎癥、細胞凋亡、腫瘤代謝等過程相關(guān)的通路上，其中糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物及其受體信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路和HIF-1信號通路顯著性較高。糖尿病晚期糖基化被認為是糖尿病角膜神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展的重要因素[26]，而角膜神經(jīng)病變可進一步引起淚腺功能受到抑制，進而導致干眼；該通路中包含的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號通路被證實與細胞凋亡密切相關(guān)，同時還能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，參與機體炎癥反應(yīng)的調(diào)控過程[27]，發(fā)揮與TNF及IL-17相似的作用。HIF-1由α和β2個亞單位組成，其中HIF-1α能夠調(diào)控免疫細胞的存活和促炎因子的表達，同時作為介導缺氧信號的轉(zhuǎn)導中樞參與多條細胞信號通路，影響著與細胞增殖凋亡、腫瘤生長、細胞自噬等有關(guān)的各種生理過程[28]。

4 結(jié)論

綜上分析推測，魚腥草滴眼液治療干眼的作用機制是通過調(diào)節(jié)潛在作用靶點相關(guān)蛋白的表達，調(diào)控與炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等相關(guān)的通路，達到抗炎、抑制細胞凋亡等目的，從而抑制角膜上皮損傷，抑制干眼的發(fā)生發(fā)展。但這一結(jié)論僅是數(shù)據(jù)推測，存在一定的局限性，比如化合物篩選標準不全面，可能遺漏實際有效成分；疾病靶點數(shù)據(jù)庫范圍較小，可能不能囊括所有與干眼相關(guān)的基因靶點，推測結(jié)果可能與實際關(guān)鍵靶點不符等，故此結(jié)論仍有待后續(xù)實驗進一步論證。