基于實(shí)體語法系統(tǒng)的澤漆治療肺癌的作用機(jī)制研究△

張憲寶，王耘

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

澤漆為大戟科植物澤漆EuphorbiahelioscopiaLinn.的干燥全草，廣布于全國[1]。澤漆味苦，性微寒，有毒，歸肺、小腸、大腸經(jīng)，具有很好的利水消腫、消痰退熱、散結(jié)殺蟲等功效[2]。雖然有毒，但其毒性較小[3]。在古今臨床應(yīng)用中，澤漆具有確切的治療肺癌的功效。《金匱要略》中記載：“咳而脈沉者，澤漆湯主之”，因該論述太過簡略，導(dǎo)致澤漆沒有得到應(yīng)有的重視[4]。隨著現(xiàn)代中藥在腫瘤治療方面的應(yīng)用效果良好，澤漆也被證實(shí)有良好的抗腫瘤活性，澤漆湯[5]、澤漆湯加減[6]、葶藶澤漆湯[7]等方劑在臨床肺癌治療中都發(fā)揮了確切的治療作用。然而目前對(duì)澤漆的研究多為成分鑒定、分析及體內(nèi)、體外活性的初步研究[8]，其治療肺癌的分子機(jī)制和途徑尚不完全明確，有待深入解析。

本研究結(jié)合中藥學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域多種數(shù)據(jù)庫(中藥成分、靶點(diǎn)、蛋白相互作用及疾病相關(guān)靶點(diǎn)等)，以實(shí)體語法系統(tǒng)(entity grammar system，EGS)為框架，利用定性推理技術(shù)系統(tǒng)地推導(dǎo)澤漆成分的作用靶點(diǎn)與肺癌相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，解析澤漆治療肺癌的分子機(jī)制和途徑，為澤漆的進(jìn)一步研究提供參考。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

澤漆中含有的化學(xué)成分來源于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)[9](traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)。澤漆化學(xué)成分的靶點(diǎn)信息以及化學(xué)成分對(duì)靶點(diǎn)的作用信息(促進(jìn)或抑制)來源于DrugBank[10]、STITCH[11](search tool for interacting chemicals)、BindingDB[12](bingding database)和TTD[13](therapeutic target database)數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)相互作用背景網(wǎng)絡(luò)來源于String[14]數(shù)據(jù)庫。為了保證應(yīng)用EGS進(jìn)行定性推理的準(zhǔn)確性，本研究只采用了具有明確抑制作用或者促進(jìn)作用的蛋白-蛋白相互作用(PPI)關(guān)系。肺癌相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)來源于OMIM[15](online mendelian inheritance in man)、GENE[16]、KEGG[17](Kyoto Encyclopedia of genes and genomes)和DrugBank數(shù)據(jù)庫。

1.2 EGS定性推理系統(tǒng)的數(shù)學(xué)原理

EGS是一種形式化的語法系統(tǒng)，朝向復(fù)雜生物系統(tǒng)建模[18]。一般情況下，EGS用五元組G=(VN，VT，F(xiàn)，P，S)表示，其中VT(末端字符)和VN(非末端字符)指系統(tǒng)中的基本元素，F(xiàn)表示基本元素之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系，P代表由已知實(shí)體產(chǎn)生新實(shí)體的推理規(guī)則，S表示系統(tǒng)初始狀態(tài)。當(dāng)無需考慮或者區(qū)分末端字符和非末端字符時(shí)，實(shí)體語法系統(tǒng)可以用四元組G=(V，F(xiàn)，P，S)表示，其中V=VN∪VT。由于EGS具有可擴(kuò)展性，已經(jīng)被用于建立化學(xué)過程的調(diào)控工程圖模型[19]并用于闡明中藥的分子機(jī)制[20]。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的性質(zhì)，在作用機(jī)制解析時(shí)本研究采取了如下考慮。對(duì)應(yīng)給定的疾病D，中藥的化學(xué)成分可以分為3個(gè)部分，第一部分為直接作用于疾病D靶點(diǎn)的成分，第二部分為可通過蛋白相互作用等生物作用間接作用于疾病D靶點(diǎn)的成分，第三部分為和疾病D靶點(diǎn)無關(guān)的成分。EGS利用有向網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行推理的優(yōu)點(diǎn)為不僅可以獲得中藥中直接作用于疾病的成分和靶點(diǎn)，也可以獲得通過間接方式作用于疾病的成分和靶點(diǎn)。

本研究基于EGS構(gòu)建澤漆治療肺癌的作用機(jī)制解析系統(tǒng)：V包含各種不同的節(jié)點(diǎn)，中藥(澤漆)、化學(xué)成分、蛋白質(zhì)和疾病(肺癌)；F包含包括各種節(jié)點(diǎn)間的關(guān)系以及相互作用；P則定義了節(jié)點(diǎn)之間的推理規(guī)則；S為系統(tǒng)的初始狀態(tài)。其具體的數(shù)學(xué)原理如下。

V=V1∪V2∪V3∪V4∪V5

V1是中藥的集合，此處V1={澤漆}，V2是中藥澤漆化學(xué)成分的集合，V3是澤漆化學(xué)成分靶標(biāo)的集合，V4是人類蛋白質(zhì)的集合，V5是肺癌目前已知相關(guān)蛋白的集合，其中V4?V3∪V5；

F={include(X，Y)，com2tar(X，Y，Z)，dis_tar(X)，link(X，Y，Z)，draw(X，Y，Z，M)，step(X，Y，Z，M)，minstep(X，Y，Z，M)}.

在include(X，Y)中，X=“澤漆”，Y∈V3；在com2tar(X，Y，Z)中，X∈V2，Y∈V3，Z∈{“activation”，“inhibition”}；在dis_tar(X)中，X∈V5；在link(X，Y，Z)中，X∈V4，Y∈V4，Z∈{“activation”，“inhibition”}；在draw(X，Y，Z，M)中，X∈V2，Y∈V4，Z∈{“activation”，“inhibition”}，M∈{1，2，3，…，n}；在step(X，Y，Z，M)中，X∈V2，Y∈V5，Z∈{“activation”，“inhibition”}，M∈{1，2，3，…，n}；在minstep(X，Y，Z，M)中，X∈V2，Y∈V5，Z∈{“activation”，“inhibition”}，M∈{1，2，3，4，…，n}。

上述F中包含的基本關(guān)系類型為初始狀態(tài)以及在系統(tǒng)推理過程中產(chǎn)生的全部節(jié)點(diǎn)關(guān)系。include(X，Y)定義中藥X含有化學(xué)成分Y，本研究中X特指澤漆；com2tar(X，Y，Z)表示了中藥成分X和作用靶標(biāo)Y之間的作用關(guān)系為Z；link(X，Y，Z)定義了蛋白質(zhì)X和蛋白質(zhì)Y之間的作用關(guān)系為Z；draw(X，Y，Z，M)定義了中藥成分X經(jīng)過M步以作用方式Z作用于蛋白質(zhì)Y；step(X，Y，Z，M)表示中藥成分X經(jīng)過M步以作用方式Z作用于肺癌相關(guān)蛋白Y，而minstep(X，Y，Z，M)則表示中藥成分X作用于肺癌相關(guān)蛋白Y所需的最小步數(shù)。值得注意的是，在不同的節(jié)點(diǎn)關(guān)系中，變量X、Y、Z、M、N等可表示不同的意義，而在相同的節(jié)點(diǎn)關(guān)系中盡管表示變量的字母不同，其含義相同，即字母在變量中的位置決定變量的具體含義。

P=P1∪P2∪P3∪P4∪P5∪P6∪P7，

P1={include(H，X)，com2tar(X，Y，R) ? draw(X，Y，R，1)}，

P2={draw(X，Y，“activation”，N)，

link(Y，B，“activation”)，M=N+1 ? draw(X，B，“activation”，M)}，

P3={draw(X，Y，“activation”，N)，

link(Y，B，“inhibition”)，M=N+1 ? draw(X，B，“inhibition”，M)}，

P4={draw(X，Y，“inhibition”，N)，

link(Y，B，“activation”)，M=N+1 ? draw(X，B，“inhibition”，M)}，

P5={draw(X，Y，“inhibition”，N)，

link(Y，B，“inhibition”)，M=N+1 ? draw(X，B，“activation”，M)}，

P6={draw(X，Y，Z，M)，dis_tar(D)，Y=D? step(X，D，R，M)}，

P7={#min{M：step(X，D，R，M)}=W，step(X，D，R，W) ? minstep(X，D，R，W)}.

規(guī)則P1用來推理中藥澤漆的化學(xué)成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系并作為推理的起點(diǎn)；規(guī)則P2～P5用來推理中藥化學(xué)成分到肺癌相關(guān)蛋白的作用關(guān)系和所有路徑的距離，在此可根據(jù)具體研究設(shè)置不同對(duì)N作限定；規(guī)則P2中X到Y(jié)的作用方式為“activation”，Y到B的作用方式為“activation”，則X到B的作用方式為“activation”，同理可了解P3～P5中包含的另外3種作用方式的推理；一個(gè)化學(xué)成分作用于某個(gè)疾病相關(guān)蛋白可能經(jīng)過多條路徑。

S=S1∪S2∪S3，

S1={include(H，X)，com2tar(X，Y，R)，link(X，Y，R)}，

S2={dis_tar(X)}，

S3={draw(X，Y，R，1)}.

S1是用EGS用來研究推理的具體初始信息，包括中藥澤漆含有的化學(xué)成分、成分作用靶點(diǎn)及人類蛋白質(zhì)相互作用信息；S2代表推導(dǎo)的終點(diǎn)，即肺癌已知相關(guān)靶點(diǎn)；S3代表推導(dǎo)的起點(diǎn)，用數(shù)字1標(biāo)記作為推導(dǎo)的第一步。

1.3 分子對(duì)接

為保證EGS推理的可靠性，采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)利用相似性搜索獲得的成分靶點(diǎn)關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)從PDB(protein data bank)數(shù)據(jù)庫中搜索下載，優(yōu)先選擇含有相應(yīng)生物活性配體且分辨率高的蛋白晶體。將獲得的蛋白晶體進(jìn)行刪去配體分子和水分子、補(bǔ)全不完整氨基酸殘基、刪除多余蛋白質(zhì)構(gòu)象和加氫等預(yù)處理。利用LibDock工具，conformation method 參數(shù)設(shè)置為“BEST”，docking preferences參數(shù)設(shè)置為“High Quality”，其余參數(shù)為默認(rèn)，進(jìn)行分子對(duì)接。記錄分子對(duì)接打分值LibDock Score，選取最優(yōu)構(gòu)象分析小分子和蛋白晶體間的相互作用。

1.4 富集分析

利用富集分析進(jìn)一步研究由EGS推理獲得的澤漆治療肺癌的作用靶點(diǎn)。DAVID[21](the database for annotation and integrated discovery)是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫，為研究人員提供了一套全面的基因功能注釋工具，以了解大量基因背后的生物學(xué)意義。本研究將澤漆的直接和間接作用靶點(diǎn)以“Entrez Gene ID”的形式導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，在人源(homo sapiens)范圍內(nèi)，對(duì)澤漆的作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和KEGG通路富集分析。對(duì)所得結(jié)果(P<0.05)按照命中靶點(diǎn)的數(shù)目進(jìn)行降序排序，選取排名靠前的結(jié)果，從細(xì)胞組件、分子功能、生物過程和生物通路等多方面、多層次地解析澤漆治療肺癌的潛在作用機(jī)制。

2 結(jié)果與討論

2.1 澤漆化學(xué)成分篩選及靶點(diǎn)檢索

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得了澤漆的79個(gè)化學(xué)成分。使用類藥五原則和口服生物利用度(OB)值對(duì)成分進(jìn)行篩選，最終得到成藥性和生物利用度較好的成分14個(gè)，相關(guān)信息見表1。本研究中采取的具體規(guī)則為相對(duì)分子質(zhì)量(MW)≤ 500；脂溶性(AlgP)≤5；氫鍵供體數(shù)目(HD)≤5；氫鍵受體數(shù)目(HA)≤10；OB≥30.00%。

從TTD、DrugBank、BindingDB、PubChem等數(shù)據(jù)庫檢索了表1中14個(gè)澤漆化學(xué)成分的靶點(diǎn)及具體生物實(shí)驗(yàn)作用信息，以便于進(jìn)一步的EGS推導(dǎo)，其中異嗪皮啶、澤漆內(nèi)酯B、澤漆內(nèi)酯C、天芥菜堿性、嘌呤、4′，5-二羥基-7-甲氧基黃烷酮6個(gè)化學(xué)成分的靶點(diǎn)信息由結(jié)構(gòu)相似性搜索得到。為保證后續(xù)用于EGS進(jìn)行定性推理的可靠性和準(zhǔn)確性，本研究僅采用具有明確的促進(jìn)和抑制作用的“成分-靶點(diǎn)”作用關(guān)系，以保證網(wǎng)絡(luò)的有向性。成分酒石酸未在已有數(shù)據(jù)庫找到其確切作用的靶點(diǎn)信息，其余13個(gè)成分的靶點(diǎn)信息及作用方式見表2。

表1 澤漆化學(xué)成分詳細(xì)信息

表2 澤漆化學(xué)成分靶點(diǎn)及具體作用信息

2.2 肺癌靶點(diǎn)檢索及EGS推理背景網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用數(shù)據(jù)庫檢索的形式，以“l(fā)ung cancer”為關(guān)鍵詞，限定物種為人源(homo sapiens)，在OMIM、GENE、DrugBank和KEGG數(shù)據(jù)庫中檢索，取4個(gè)數(shù)據(jù)庫結(jié)果的并集，獲得肺癌相關(guān)靶點(diǎn)445個(gè)。

選取STRING數(shù)據(jù)庫中人源(homo sapiens)PPI信息(文件名9606.protein. actions.v11.0.txt.gz)，篩選其中具有明確抑制或激活作用的PPI關(guān)系，選取打分值(score)≥0.700的有向PPI關(guān)系作為后續(xù)EGS推導(dǎo)的背景網(wǎng)絡(luò)，其中包含節(jié)點(diǎn)(蛋白)3560個(gè)，邊19 466條，其中激活關(guān)系16 186條，抑制關(guān)系3280條。

2.3 EGS推理結(jié)果

2.3.1澤漆化學(xué)成分分析 通過EGS的定性推理，澤漆有7個(gè)潛在化學(xué)成分直接或間接地作用于55個(gè)肺癌相關(guān)靶點(diǎn),進(jìn)而對(duì)肺癌起到了治療作用(圖1)。7個(gè)潛在化學(xué)成分分別是木犀草素、槲皮素、山柰酚、沒食子酸甲酯、沒食子酸、澤漆內(nèi)酯B、澤漆內(nèi)酯C；澤漆的55個(gè)肺癌相關(guān)靶點(diǎn)中有11個(gè)直接作用靶點(diǎn)和44個(gè)通過PPI調(diào)控到的間接靶點(diǎn)。木犀草素是四羥基黃酮類化合物，具有消炎、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)木犀草素既可以抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[22]，又可以抑制小細(xì)胞肺癌H1688、H446細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[23]。槲皮素為黃酮類化合物，具有抗腫瘤作用，可以抑制A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[24]，并且可以顯著抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力[25]。山柰酚是黃酮醇類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化及組織保護(hù)等多種作用。研究表明，山柰酚可誘導(dǎo)肺癌H446細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯，上調(diào)H446細(xì)胞中的p53和Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。沒食子酸是天然植物多酚類化合物，可以通過抑制信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路，產(chǎn)生對(duì)A549細(xì)胞的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用[27]。

此外，由于初始數(shù)據(jù)中的澤漆內(nèi)酯作用靶點(diǎn)信息來源于化學(xué)相似性搜索，故采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)澤漆內(nèi)酯B和澤漆內(nèi)酯C與其靶點(diǎn)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(ABCG2)間的作用關(guān)系進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)接采用的ABCG2蛋白晶體的PDB編號(hào)為6ETI[28]，解析度為0.31 nm，該蛋白晶體共有A～F 6條鏈，作用位點(diǎn)在A鏈和B鏈之間。采用LibDock工具，將蛋白晶體和配體小分子以柔性的方式進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果見表3。澤漆內(nèi)酯B和澤漆內(nèi)酯C具有較高的分子對(duì)接打分值(表3)，同時(shí)，分析澤漆內(nèi)酯B和澤漆內(nèi)酯C與ABCG2之間的相互作用也具有相似性(圖2)?？梢宰鳛锳BCG2的潛在抑制劑。值得一提的是，ABCG2參與多種腫瘤的多藥耐藥過程。有研究表明，澤漆提取物可以逆轉(zhuǎn)胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞的多藥耐藥性，這既能佐證澤漆內(nèi)酯B、澤漆內(nèi)酯C和ABCG2的潛在作用關(guān)系，也表明澤漆中的成分不僅可以抗腫瘤，同時(shí)也有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。

注：不同的圖形代表不同的實(shí)體；V形節(jié)點(diǎn)代表澤漆的化學(xué)成分；長方形節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，深紅色為實(shí)體語法系統(tǒng)推理得到的澤漆治療肺癌的直接作用靶點(diǎn)，紫色為間接作用靶點(diǎn)；箭頭的指向代表作用的方向，紅線三角形箭頭代表正向(activation)調(diào)節(jié)作用，T形箭頭代表負(fù)向(inhibition)調(diào)節(jié)作用；實(shí)線代表直接相互作用；虛線代表間接相互作用。

表3 漆內(nèi)酯B、澤漆內(nèi)酯C和6ETI的分子對(duì)接結(jié)果

2.3.2澤漆潛在靶點(diǎn)GO富集分析 將EGS推理得到的55個(gè)潛在肺癌治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析(限定P<0.05)。結(jié)果表明，澤漆55個(gè)潛在肺癌治療靶點(diǎn)參與了28個(gè)分子功能(molecular function，MF)相關(guān)術(shù)語、15個(gè)細(xì)胞組件(cellular component，CC)相關(guān)術(shù)語以及74個(gè)生物過程(biological progress，BP)相關(guān)術(shù)語(圖3)。MF主要與蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)以及蛋白激酶活性(protein kinase activity)等術(shù)語有關(guān)，尤其是蛋白質(zhì)結(jié)合，有45個(gè)潛在靶點(diǎn)與之相關(guān)，表明這些蛋白通過選擇性的非共價(jià)作用與其他蛋白或者蛋白復(fù)合物結(jié)合而發(fā)揮作用。CC主要與胞質(zhì)溶膠(cytosol)、質(zhì)膜(plasma membrane)、核(nucleus)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)等術(shù)語相關(guān)，提示這55個(gè)潛在靶點(diǎn)在細(xì)胞中較為分散，有利于對(duì)癌細(xì)胞發(fā)揮綜合的調(diào)控作用。BP主要涉及凋亡過程(apoptotic process)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of cell proliferation)、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路(cell surface receptor signaling pathway)等術(shù)語。

值得關(guān)注的是，在治療癌癥時(shí)，會(huì)采用抑制癌細(xì)胞增殖或者促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的手段，然而生物過程卻富集到了細(xì)胞增殖的正調(diào)控、凋亡的負(fù)調(diào)控。結(jié)合澤漆成分與靶點(diǎn)間的關(guān)系(圖1)可知，澤漆的相關(guān)成分主要對(duì)增殖的正調(diào)控靶點(diǎn)以及凋亡的負(fù)調(diào)控靶點(diǎn)產(chǎn)生抑制作用，也就是實(shí)際上產(chǎn)生了抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASP3)是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是殺傷性T細(xì)胞(CTL)殺傷機(jī)制的重要組成部分。沒食子酸和木犀草素可以直接正向激活CASP3(圖1)，起到促進(jìn)凋亡的作用。由此可見，通過有向網(wǎng)絡(luò)圖可以有效獲取正確的生物調(diào)控信息。

2.4 通路富集分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)澤漆治療肺癌的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的具體作用機(jī)制，本研究將EGS得到的55個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG通路富集分析，以探究更深層次的作用機(jī)制。結(jié)果表明，澤漆55個(gè)潛在靶點(diǎn)中有44個(gè)被富集到了29個(gè)KEGG通路(P<0.05)中，按照命中靶點(diǎn)數(shù)進(jìn)行降序排序，取前10個(gè)信號(hào)通路(圖4)。通路分析結(jié)果表明，澤漆潛在靶點(diǎn)發(fā)揮效應(yīng)主要和癌癥涉及通路(pathways in cancer)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、Rap1信號(hào)通路(Rap1 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、黏附連接(adherens junction)等通路有關(guān)。

注：紅色字體表示A鏈中的氨基酸殘基；黑色字體表示B鏈中的氨基酸殘基。

圖3 澤漆潛在作用靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果

圖4 澤漆潛在作用靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果

MAPK級(jí)聯(lián)是一個(gè)高度保守的模塊，參與細(xì)胞增殖、分化和遷移等多種細(xì)胞功能。哺乳動(dòng)物至少表達(dá)4組明顯受調(diào)控的MAPKs，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、p38蛋白α/β/γ/δ(p38α/β/γ/δ)和ERK5，分別由絲分裂原活化蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)、MKK4/7、MKK3/6、MEK5特異性激活。然而，每個(gè)MAPKK可以由多于1個(gè)的MAPKKK激活，增加了MAPK信號(hào)通路的復(fù)雜性和多樣性。經(jīng)過實(shí)體語法系統(tǒng)推理，澤漆成分中的木犀草素可以抑制生長因子(GF)，槲皮素和沒食子酸甲酯可以抑制生長因子受體(EGFR)酪氨酸蛋白激酶(RTK)，經(jīng)過MAPK信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)起到抑制細(xì)胞增殖的作用(圖5)。細(xì)胞凋亡即程序性細(xì)胞死亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡下游的執(zhí)行者。澤漆成分中的沒食子酸和木犀草素可直接激活Caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖5)。

PI3K-Akt信號(hào)通路被多種細(xì)胞刺激或毒性刺激激活，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、生長和存活等基本功能。PI3K催化細(xì)胞膜產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)。PIP3反過來作為第二信使幫助激活A(yù)kt。一旦被激活，Akt可以通過磷酸化參與細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成、新陳代謝和細(xì)胞周期的底物來控制關(guān)鍵的細(xì)胞過程。周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)調(diào)控細(xì)胞從G2期到M期，使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期進(jìn)行增殖。槲皮素可抑制CDK1從而抑制細(xì)胞有絲分裂，使細(xì)胞無法增殖。澤漆中的木犀草素和沒食子酸甲酯通過抑制PI3K-Akt通路上游(GF和RTK，圖5)進(jìn)而間接抑制Akt的活性起到促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。

圖5 澤漆治療肺癌潛在作用機(jī)制

經(jīng)EGS推理，澤漆可能主要通過2個(gè)方面治療肺癌：1)抑制肺癌細(xì)胞增殖。澤漆可能通過木犀草素對(duì)GF的抑制、沒食子酸甲酯和槲皮素對(duì)EGFR的抑制及槲皮素對(duì)CDK1的抑制，起到了抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用。2)促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。澤漆成分中的沒食子酸和木犀草素可直接激活Caspase-3促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，也可能間接抑制Akt的活性(抑制上游GF和RTK)起到促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。此外，澤漆中的澤漆內(nèi)酯B和澤漆內(nèi)酯C具有潛在的ABCG2抑制活性，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)肺癌腫瘤多藥耐藥的功效。

3 總結(jié)與展望

本研究綜合利用中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)、化學(xué)成分活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及人類PPI數(shù)據(jù)，通過EGS對(duì)有向網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行推理，獲得了木犀草素、槲皮素、山柰酚、沒食子酸甲酯、沒食子酸、澤漆內(nèi)酯B、澤漆內(nèi)酯C共7個(gè)澤漆治療肺癌的潛在活性成分，并得到了11個(gè)治療肺癌的直接作用靶點(diǎn)和44個(gè)間接作用靶點(diǎn)。EGS具有強(qiáng)大的融合和推理能力，在中藥研究中有待發(fā)揮更大的作用。本研究利用由EGS獲得的更豐富、更全面的信息，結(jié)合成分靶點(diǎn)關(guān)系、GO富集分析、KEGG通路富集分析等多層次的分析手段，系統(tǒng)地解析了澤漆治療肺癌的潛在分子作用機(jī)制，為澤漆治療肺癌的應(yīng)用和肺癌的治療提供了參考。澤漆在肺癌治療中能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)還具有潛在的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的功效，有待進(jìn)一步研究與應(yīng)用。