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    口服肝靶向制劑介導(dǎo)受體ASBT和ASGPR在肝泡型包蟲病大鼠模型體內(nèi)的表達(dá)分析

    2021-04-19 03:45:54高瑞雪胡春暉張發(fā)斌甘雪輝張耀剛姜博璠
    臨床肝膽病雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:包蟲病口服靶向

    高瑞雪, 胡春暉, 張發(fā)斌, 高 攀, 甘雪輝, 張耀剛, 姜博璠

    1 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 西寧 810001; 2 青海省包蟲病研究重點實驗室, 西寧 810001

    肝泡型包蟲病(hepatic alveolar echinococcosis, HAE)是由多房棘球蚴寄生人體、感染肝臟所致的慢性寄生蟲病,在我國畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)流行[1-4]。治療手段以手術(shù)切除為主,但HAE的邊緣帶界限不清,術(shù)中難以完全切除,患者的復(fù)發(fā)率高達(dá)7.7%~30%[5-6]。且對于多器官轉(zhuǎn)移、晚期等無法進(jìn)行手術(shù)的患者,藥物治療尤為重要。目前現(xiàn)有的治療包蟲病的藥物如苯并咪唑類(Benzimidazoles)藥物[7-8]主要以口服給藥為主,但給藥后毒副作用較大,肝局部藥物濃度過低[9],療效欠佳。因此,基于HAE的生物學(xué)基礎(chǔ),研究新型肝靶向制劑是目前治療包蟲病的關(guān)鍵?,F(xiàn)有的肝靶向制劑的研究主要是基于粒徑效應(yīng)的注射用被動肝靶向,但注射給藥患者依從性低,因此考慮口服肝靶向制劑。

    研究[10-12]表明,頂端鈉依賴性膽鹽轉(zhuǎn)運體(apical sodium-dependent bile acid transporter, ASBT) 是存在于回腸末端上皮細(xì)胞的一種膜轉(zhuǎn)運蛋白,作為藥物吸收的潛在靶點受到了廣泛關(guān)注。去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是肝細(xì)胞特異性表達(dá)的一種內(nèi)吞型受體,利用該受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制可以實現(xiàn)藥物或基因的肝靶向遞送[13]。ASBT、ASGPR被證實為有效的口服肝靶向制劑介導(dǎo)受體,將其應(yīng)用于HAE口服肝靶向新劑型,需驗證二者在HAE的表達(dá)情況。因此本研究分別對HAE大鼠模型回腸組織中ASBT及肝組織中ASGPR的表達(dá)情況進(jìn)行檢測分析,為后期研發(fā)靶向新劑型提供基礎(chǔ)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 雄性6~8周齡SPF級SD大鼠,體質(zhì)量(200±20) g,購于江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場,實驗動物生產(chǎn)許可證號:3202781029,實驗動物使用許可證號:SYXK(青)2016-0001。飼養(yǎng)于青海省包蟲病研究重點實驗室,室溫(23±2) ℃,相對濕度55%左右,自由進(jìn)食、飲水。

    1.2 主要試劑 ASBT兔多克隆抗體ab203205、ASGPR兔多克隆抗體ab42488購于Abcam公司;HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體G23303、CY3山羊抗兔抗體GB21303購于Servicebio公司;β-actin兔多克隆抗體AC026購于ABclonal公司;Total RNA提取試劑盒、去基因組DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Takara嵌合法實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司;大鼠β-actin內(nèi)參引物購于上海生工生物工程公司。

    1.3 HAE大鼠模型的建立[14]10只SD大鼠制備HAE模型。制備方法如下:解剖感染多房棘球絳蟲的沙鼠臟器(由青海省包蟲病研究重點實驗室提供),分離包囊、洗滌、剪碎,通過臺盼藍(lán)染色法檢測原頭節(jié)活性、鏡下計數(shù)活性原頭節(jié)數(shù)量,制成含活性原頭節(jié)2000枚/μl的混懸液,備用。10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉SD大鼠,劍突右下處暴露肝臟,將制備好的原頭節(jié)混懸液用無菌注射器吸取0.2 ml注射入肝臟,縫合(圖1)。造模4個月后用mindray公司的Resona7彩色多普勒超聲系統(tǒng)檢查,確認(rèn)造模是否成功。根據(jù)超聲病灶橫切面的長、寬,縱切面的寬,確定病灶體積(長×寬×寬),造模成功的SD大鼠為HAE組,完成后續(xù)實驗。

    1.4 動物分組與組織取樣 8只SD大鼠為正常對照組,8只經(jīng)超聲檢查造模成功的SD大鼠為HAE組(造模10只,成功8只)。分別取正常大鼠回腸組織、肝組織,HAE大鼠回腸組織、其他非患病肝組織、HAE大鼠肝組織病灶邊緣帶(圖1),備用。

    圖1 HAE模型大鼠的建立與肝組織取樣

    1.5 免疫熒光檢測 取上述組織樣本用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,并將切片浸入EDTA抗原修復(fù)緩沖液,采用微波熱修復(fù)抗原。加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min,流水沖洗10 min,滴加BSA室溫封閉30 min。滴加0.1 mmol/L PBS稀釋好的一抗(ASBT 1∶100;ASGPR 1∶50),4 ℃過夜孵育。滴加CY3二抗室溫避光孵育50 min,DAPI復(fù)染細(xì)胞核室溫避光孵育10 min,用抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡觀察并采集圖像(DAPI紫外激發(fā)波長330~380 nm,發(fā)射波長420 nm,發(fā)藍(lán)光;CY3激發(fā)波長510~560 nm,發(fā)射波長590 nm,發(fā)紅光)。

    1.6 Western Blot檢測蛋白表達(dá)水平 組織樣本勻漿后,加RIPA裂解液提蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定,以每孔蛋白上樣量15 μg配制上樣體系,煮沸變性5 min,12%SDS-PAGE恒流60 mA電泳,恒流180 mA轉(zhuǎn)膜90 min,10%脫脂牛奶封閉1 h,將PVDF膜置于稀釋的ASBT(1∶1000)、ASGPR(1∶1000)、β-actin(1∶100 000)一抗中,4 ℃孵育過夜。次日,PVDF膜TBST漂洗3次(每次5 min)后,以HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶10 000)為二抗室溫孵育1 h,TBST漂洗3次(每次10 min), 將ECL顯影液均勻的覆蓋住PVDF膜表面,顯影,拍照。采用Image J進(jìn)行顯影結(jié)果的灰度值分析。

    1.7 實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平 組織樣本用Total RNA提取試劑盒提取總RNA。按去基因組DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,完成總RNA反轉(zhuǎn),得到cDNA。引物由上海生工生物工程公司合成(表1),內(nèi)參基因選用β-actin。用Takara嵌合法實時熒光定量PCR試劑盒配制PCR反應(yīng)液,LightCycler480 System進(jìn)行qPCR反應(yīng),得到目的基因與內(nèi)參基因Ct值,以2-ΔΔCt為統(tǒng)計量,計算得出目的基因的相對含量。

    表1 實時熒光定量PCR引物

    1.8 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會審批,動物實驗符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

    2 結(jié)果

    2.1 HAE大鼠模型造模情況超聲檢查 對模型大鼠肝臟超聲檢查,并通過對病灶橫、縱兩個切面的檢測確定腫塊大小。超聲檢查結(jié)果顯示,肝內(nèi)不均質(zhì)腫塊,腫塊體積范圍為0.3~3.3 cm3,內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)紊亂,邊緣不規(guī)則,周邊實性部分與肝實質(zhì)分界不清,部分伴有點狀強(qiáng)回聲鈣化沉積(圖2)。

    2.2 ASBT在HAE大鼠模型回腸組織中的表達(dá)與分布

    免疫熒光鏡檢ASBT在回腸組織的分布情況顯示,ASBT在游離面和基底面細(xì)胞膜存在高表達(dá)。在HAE大鼠中,ASBT在其回腸組織中熒光強(qiáng)度高,且較正常組呈上調(diào)趨勢(P<0.05)(圖3,表2);Western Blot結(jié)果分析蛋白表達(dá)水平,ASBT在HAE組表達(dá)量較正常組顯著,條帶趨勢遞增,呈現(xiàn)高表達(dá),與免疫熒光結(jié)果趨勢一致。通過分析灰度值,HAE組表達(dá)量較正常組高(P<0.05)(圖4,表2);分析實時熒光定量PCR mRNA相對表達(dá)量,結(jié)果顯示ASBT在HAE組較正常組表達(dá)上調(diào)(P<0.05)(表2)。

    注:虛線標(biāo)注為病灶腫塊;a,超聲檢查橫切面;b,超聲檢查縱切面;c,HAE大鼠模型肝臟感染模型圖。圖2 典型HAE模型大鼠超聲檢查及感染模型圖

    注:DAPI,藍(lán)色熒光(細(xì)胞核);CY3,紅色熒光(ASGPR陽性表達(dá));MERGE,疊加。圖3 ASBT在正常大鼠及HAE大鼠回腸組織的表達(dá)分布(免疫熒光染色,×200)

    圖4 ASBT在正常大鼠及HAE大鼠回腸組織蛋白的表達(dá)水平

    表2 ASBT在正常大鼠及HAE大鼠的表達(dá)比較

    2.3 ASGPR在HAE大鼠模型肝組織中的表達(dá)與分布 免疫熒光鏡檢結(jié)果顯示,ASGPR在肝組織高表達(dá),HAE組較正常組表達(dá)高,且接近病灶的部位熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(P<0.05)(圖5,表3);Western Blot結(jié)果顯示,其在HAE組表達(dá)量較正常組顯著,條帶趨勢遞增,靠近病灶的邊緣帶表達(dá)量較非患病肝組織表達(dá)量高(P<0.05)(圖6,表3);實時熒光定量PCR mRNA相對表達(dá)量分析顯示,HAE組較正常組表達(dá)上調(diào),趨勢與免疫熒光、Western Blot一致(P<0.05)(表3)。

    圖6 ASGPR在正常大鼠及HAE大鼠肝組織蛋白的表達(dá)水平

    表3 ASGPR在正常大鼠及HAE大鼠的表達(dá)比較

    注:DAPI,藍(lán)色熒光(細(xì)胞核);CY3,紅色熒光(ASGPR陽性表達(dá));MERGE,疊加。圖5 ASGPR在正常大鼠及HAE大鼠肝組織的表達(dá)分布(免疫熒光染色,×200)

    3 討論

    根據(jù)世界衛(wèi)生組織治療意見,目前HAE的治療方式以手術(shù)切除病灶為主,并長期給予苯并咪唑類藥物[15]。由于HAE的治療時間較長(1~2年),患者大多來自農(nóng)牧區(qū),順應(yīng)性較好的口服制劑給藥為首選給藥方式。然而,目前史可腸蟲清(阿苯達(dá)唑片)為口服普通制劑,口服給藥后局部病灶部位藥物濃度過低是其達(dá)不到理想藥效學(xué)的主要原因[16-20]。因此,為了克服上述缺點,制備患者順應(yīng)性強(qiáng)、療效顯著的口服肝靶向制劑成為本課題組研究的重點。

    研究顯示,腸轉(zhuǎn)運蛋白在提高某些大分子藥物,如胰島素[11]或微粒給藥系統(tǒng)[21-22]的藥物吸收速率和程度上起到了重要作用。ASBT是在回腸末端上皮細(xì)胞的頂端刷狀緣膜中高度表達(dá)的一種膜轉(zhuǎn)運蛋白,屬于轉(zhuǎn)運蛋白的溶質(zhì)載體家族,可與膽酸結(jié)合,是表達(dá)于小腸的重要載體蛋白。范未偉[11]利用ASBT設(shè)計胰島素新型口服納米載體可高效遞送胰島素,與皮下注射重組胰島素相比,胰島素的細(xì)胞攝取量較高[21]。Lozano等[22]研究證實可通過ASBT增強(qiáng)抗腫瘤藥物向膽管癌的遞送。由此可見,ASBT可作為轉(zhuǎn)運受體,用于提高口服藥物的生物利用度。

    ASGPR大量存在于肝細(xì)胞上且在肝外少表達(dá),且它與包含半乳糖和N-乙酰基-半乳糖胺殘基的多個分子具有先天結(jié)合親和力[23-24],因此ASGPR可能成為肝靶向給藥的物質(zhì)基礎(chǔ)。Wang等[25]利用ASGPR與半乳糖分子的高親和性,制成負(fù)載有姜黃素的球形納米載體,明顯增強(qiáng)了姜黃素的肝臟分布。Wu等[26]基于ASGPR-半乳糖的受體-配體相互作用構(gòu)建了糖聚合物,從而實現(xiàn)針對肝細(xì)胞癌治療藥物的特異性轉(zhuǎn)運和釋放。

    基于ASBT為理想的前藥轉(zhuǎn)運體、ASGPR為肝靶向給藥系統(tǒng)的理想受體,本課題組擬通過ASBT介導(dǎo)轉(zhuǎn)運口服藥物吸收入血,藥物經(jīng)血液送達(dá)肝臟,再由肝臟高表達(dá)的ASGPR內(nèi)吞,使藥物在肝臟內(nèi)部充分釋放,進(jìn)而有效改善當(dāng)前治療藥物存在的弊端,為HAE的藥物治療提供新的可能。本研究顯示,ASBT、ASGPR在HAE組呈現(xiàn)高表達(dá),且越接近病灶的組織,其肝細(xì)胞ASGPR表達(dá)量越高。換言之,若以ASGPR為受體的新劑型研發(fā)成功,當(dāng)其進(jìn)入HAE患者體內(nèi),越接近病灶的組織與新劑型的結(jié)合度越高,進(jìn)而有效解決了當(dāng)前藥物肝臟局部血藥濃度較低的問題。因此,將ASBT作為治療HAE藥物的前藥轉(zhuǎn)運體,ASGPR作為治療藥物的肝靶向給藥系統(tǒng)的受體,二者結(jié)合,可能有效解決當(dāng)前治療藥物血藥濃度低及肝臟局部血藥濃度低等問題。本研究為后續(xù)研發(fā)治療HAE的口服靶向新劑型提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:高瑞雪、胡春暉、張發(fā)斌負(fù)責(zé)課題設(shè)計,撰寫論文,修改論文;高瑞雪、高攀、甘雪輝、張耀剛、姜博璠參與收集數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析;高瑞雪、胡春暉、張發(fā)斌負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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