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    體外HBV感染的人肝癌Huh7細(xì)胞系中葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶活性的變化

    2021-04-19 03:45:48雷程程楊亞婷閆力婷田愛(ài)平毛小榮王莉莉李俊峰
    臨床肝膽病雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系分析儀病毒

    甘 建, 楊 睿, 雷程程, 楊亞婷, 閆力婷, 田愛(ài)平, 毛小榮, 王莉莉, 李俊峰

    1 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 蘭州 730000; 2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 感染科, 蘭州 730000;3 首都醫(yī)科大學(xué) 第十二臨床醫(yī)學(xué)院, 北京 100000

    HBV是一種小包膜DNA病毒,屬于噬肝病毒科。盡管目前有乙型肝炎疫苗,但慢性乙型肝炎仍然是一個(gè)全球面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。慢性HBV感染后可能導(dǎo)致肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌[3],嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。在研究HBV致病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型抗HBV藥物過(guò)程中均離不開(kāi)高質(zhì)量的HBV感染模型,但是,由于HBV感染條件需具備高度種屬特異性和組織特異性,使得建立合適的HBV感染模型成為制約乙型肝炎發(fā)病機(jī)制研究的瓶頸[4]。目前,已有體外感染鴨肝炎病毒和土撥鼠肝炎病毒動(dòng)物模型的相關(guān)研究[5-6],這為下一步深入研究HBV感染人類(lèi)的相關(guān)機(jī)制開(kāi)闊了思路。近年來(lái),HBV體外感染模型也有一定的進(jìn)展,并能構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)HBV的細(xì)胞系[7]。人源化的肝臟衍生細(xì)胞與人類(lèi)親緣關(guān)系近,克服了HBV感染的種屬特異性和組織特異性,是研究HBV感染、發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)藥物的有效方法。

    鞘脂是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分,是由鞘氨醇、脂肪酸和磷酸膽堿組成的兩性脂類(lèi),鞘氨醇是所有鞘脂共同的基本結(jié)構(gòu)骨架,其上連接脂肪酸衍生物則構(gòu)成神經(jīng)酰胺(ceramide,Cer),是鞘脂代謝的中心分子[8]。Cer進(jìn)一步在頭基位置上連接一個(gè)磷酸膽堿則構(gòu)成鞘磷脂類(lèi),如果其頭基位置連接的是聚糖分子則構(gòu)成糖鞘脂類(lèi),如連接葡萄糖則構(gòu)成葡萄糖神經(jīng)酰胺(glucosylceramide,GC)。Cer到GC的轉(zhuǎn)變由葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(glucosylceramide synthetase,GCS)催化,該酶是糖鞘脂代謝的關(guān)鍵酶[9]。GCS參與眾多病理生理過(guò)程,在細(xì)胞增殖、凋亡、耐藥等方面扮演重要角色[9-11]。同時(shí),在眾多癌癥中亦觀(guān)察到GCS過(guò)度表達(dá),GCS可促進(jìn)相關(guān)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展,這表明開(kāi)發(fā)出一些GCS的抑制類(lèi)藥物可能是好的治療靶點(diǎn)[12]。近來(lái),GCS與肝臟疾病的相關(guān)研究日益受到關(guān)注,并為肝病的診治提供了一種有效策略。然而,GCS與HBV所致病毒性肝炎的關(guān)系的研究極為少見(jiàn),以及GCS活性在HBV感染過(guò)程中的變化仍不明確。本研究在能較好的模擬HBV感染的體外模型基礎(chǔ)上進(jìn)行研究,并探索糖鞘脂代謝關(guān)鍵酶GCS在HBV感染體外細(xì)胞系過(guò)程中的活性變化。

    1 材料與方法

    1.1 材料收集 收集2019年6月—8月就診于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院感染科的9例初治急性乙型肝炎患者的血液標(biāo)本,所有患者HBV DNA滴度>9.9×107IU/ml;另選7例健康體檢者的血液標(biāo)本作為對(duì)照,其HBV定量均為陰性。

    1.2 試劑和儀器 碘海醇購(gòu)自Axis-shield公司(挪威),Huh7細(xì)胞系購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司(武漢),胎牛血清、DMEM和青-鏈霉素雙抗購(gòu)自Biological Industries公司(以色列),超速離心管和Himac超速離心機(jī)購(gòu)自日立公司(日本),礦物油購(gòu)自sigma公司(美國(guó)),熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自天隆生物科技有限公司(蘇州),引物合成(英濰捷基有限公司,上海),相差顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司(日本),人GCS-Elisa試劑盒購(gòu)自江萊生物有限公司(上海),熒光定量PCR儀、人HBsAg檢測(cè)試劑盒Elecsys HBsAg Ⅱ quant Ⅱ、Cobas e 601全自動(dòng)免疫分析儀-電化學(xué)發(fā)光法購(gòu)自Roche公司(瑞士)。

    1.3 HBV顆粒純化 使用DMEM培養(yǎng)基溶解碘海醇,定容到10 ml,4 ℃,旋轉(zhuǎn)過(guò)夜溶解,用孔徑為0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。用無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)量體積比為42%、33%、25%、16%和8%的碘海醇溶液,在超速離心管內(nèi)從高濃度到低濃度組份分別依次加入1.42 ml碘海醇溶液,然后在上部載入1.5 ml含有HBV的患者血清,最后在最上部蓋上預(yù)冷礦物油。在超速離心機(jī)上以35 000 r/min,4 ℃的條件離心5.2 h,設(shè)置加減速為升4降5。離心完畢后取出離心管,棄掉表面礦物油,從上到下先取1 ml組份4個(gè),然后取400 μl的組份分離離心以收集病毒。以上病毒實(shí)驗(yàn)的操作在二級(jí)安全實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定操作。

    1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系(Huh7)在含有10%胎牛血清、2 mmol/L的L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖、2%DMSO、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)瓶中接種約106個(gè)細(xì)胞,每1~2 d更換培養(yǎng)基1次。將從HBV陽(yáng)性血清超速離心純化所得病毒通過(guò)real-time qPCR的方法進(jìn)行檢測(cè),選擇病毒含量最高的4個(gè)組分進(jìn)行混合,用于感染細(xì)胞。

    1.5 HBV感染細(xì)胞 在接種后2~6 d,感染組用患者血清的1 ml HBV感染顆粒感染Huh7細(xì)胞系,對(duì)照組用來(lái)自健康體檢者的血清共培養(yǎng)。在37 ℃溫育3 h后,除去接種物后用PBS徹底洗滌細(xì)胞,并向細(xì)胞中加入補(bǔ)充有10-4mol/L地塞米松和10-5mol/L胰島素的完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物溫育1 d,洗滌3次,并再次用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng),孵育1 d。然后將細(xì)胞保持在補(bǔ)充有10-6mol/L地塞米松和10-6mol/L胰島素的完全培養(yǎng)基中,每2 d更換培養(yǎng)基1次。待培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞,采用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞,收獲細(xì)胞胞漿,分別在4 h、8 h、2 d和5 d檢測(cè)HBV抗原和HBV DNA。

    1.6 細(xì)胞胞漿DNA測(cè)定 通過(guò)使用熒光定量PCR儀進(jìn)行HBV DNA定量。用于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的引物和探針序列為:正向引物,5′-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTG-3′;反向引物,5′-AGTCCAAGAGTYCTCTTATGYAAGACCTT-3′;探針,5′-FAM-CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGC-TAMRA-3′。擴(kuò)增設(shè)置為0.8 μmol/L引物和0.2 μmol/L探針,總體系為20 μl。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min,然后以94 ℃、15 s,60 ℃、30 s擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。

    1.7 HBsAg檢測(cè) 將上述分離出的HBV感染的Huh7細(xì)胞胞漿和培養(yǎng)液上清采用電化學(xué)發(fā)光法全自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè),具體操作步驟嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)實(shí)行,簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō):(1)將冷藏的人HBsAg平衡至室溫(20 ℃~25 ℃),放置于分析儀的試劑盤(pán)內(nèi),并將試劑盒附帶的定標(biāo)液放置于分析儀的樣本區(qū),隨后分析儀自動(dòng)完成定標(biāo)過(guò)程;(2)定標(biāo)完成后,棄去定標(biāo)液,在分析儀各對(duì)應(yīng)樣本區(qū)放置待測(cè)樣本,分析儀會(huì)對(duì)樣品進(jìn)行1∶400稀釋并讀取結(jié)果。以上過(guò)程由分析儀自動(dòng)進(jìn)行。

    1.8 GCS活性檢測(cè) 將上述分離出的HBV感染的Huh7細(xì)胞胞漿和培養(yǎng)液上清采用ELISA法檢測(cè)GCS活性,具體操作步驟嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)實(shí)行。

    1.9 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),批號(hào): LDYYLL2018-100,患者均簽署知情同意書(shū)。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞感染前后變化 正常培養(yǎng)的細(xì)胞呈多邊形或類(lèi)圓形、有立體感,邊界清晰,細(xì)胞核位于正中。對(duì)照組細(xì)胞符合上述特點(diǎn),培養(yǎng)2d后細(xì)胞明顯增多。干預(yù)前的感染組細(xì)胞同樣符合正常培養(yǎng)的細(xì)胞特點(diǎn),感染HBV并培養(yǎng)2 d后細(xì)胞數(shù)量較感染前和對(duì)照組明顯減少,其細(xì)胞體積腫脹,細(xì)胞膜破碎,表面出現(xiàn)胞膜皰,胞質(zhì)顆粒粗糙,部分細(xì)胞脫壁,由于大部分細(xì)胞破碎脫落后可見(jiàn)核已消失的細(xì)胞胞漿或殘屑(圖1)。

    圖1 各組細(xì)胞干預(yù)前后生長(zhǎng)情況(×40)

    2.2 不同時(shí)間點(diǎn)感染組細(xì)胞中HBsAg和HBV DNA的表達(dá)量 感染4 h、8 h、2 d和5 d后胞漿中HBsAg表達(dá)量均高于感染前(P值均<0.05),表明HBV成功感染Huh7細(xì)胞系;與感染4 h相比,感染8 h、2 d和5 d后胞漿中HBV DNA表達(dá)量明顯升高(P值均<0.001),并在感染2 d后HBV DNA達(dá)到最高(表1)。

    表1 各時(shí)間點(diǎn)HBV感染細(xì)胞胞漿中HBsAg和HBV DNA的表達(dá)量

    2.3 GCS在HBV感染細(xì)胞中的活性變化及和病毒的相關(guān)性 在HBV感染期間,隨著病毒復(fù)制的增加,GCS活性呈現(xiàn)出增高的特點(diǎn),從HBV感染4 h開(kāi)始逐漸升高,并于感染2 d達(dá)到高峰,隨后表現(xiàn)出下降趨勢(shì)(表2)。感染2 d與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.956,P=0.016 7)。Pearson相關(guān)性分析顯示,GCS活性與HBV DNA存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.576 8,P=0.047 1)(圖2)。

    表2 GCS在HBV感染期間的活性變化

    圖2 GCS活性與HBV DNA相關(guān)性

    3 討論

    原代肝細(xì)胞是HBV感染的理想細(xì)胞,但由于其不能連續(xù)傳代限制了其在研究中的使用。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在將病毒接種到細(xì)胞之前去除細(xì)胞表面結(jié)合的脂蛋白有利于HBV感染肝細(xì)胞的入胞過(guò)程和后續(xù)HBV DNA的復(fù)制[13];也有研究[14]表明,Na+牛黃膽酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽為功能性HBV受體,通過(guò)對(duì)常用的肝細(xì)胞衍生細(xì)胞(即HepG2和Huh7)中重建表達(dá)Na+牛黃膽酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽后,細(xì)胞對(duì)HBV感染效率明顯增強(qiáng),促進(jìn)了HBV生命周期早期感染機(jī)制和治療的研究。本研究正是利用肝臟細(xì)胞衍生細(xì)胞Huh7,采用乙型肝炎患者HBV DNA高拷貝血清通過(guò)進(jìn)一步純化后進(jìn)行感染。結(jié)果顯示,在感染初期DNA復(fù)制低,這可能是HBV剛進(jìn)入細(xì)胞后,進(jìn)行復(fù)制、繁殖,生成成熟的病毒顆粒需要一段時(shí)間,也可能與外源DNA純度有關(guān)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后(即從8 h開(kāi)始)病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行持續(xù)復(fù)制并高表達(dá),以上初步確定HBV DNA可以進(jìn)入Huh7并進(jìn)行復(fù)制。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中添加了適量的胰島素,其可以通過(guò)激活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)HBV X蛋白的表達(dá),將HBV基因組整合到細(xì)胞DNA中,以促進(jìn)HBV進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制[15];同時(shí)還通過(guò)梯度離心對(duì)HBV顆粒進(jìn)行提純,也增加了HBV感染細(xì)胞的概率。

    研究[16-17]表明鞘脂家族成員在病毒性肝炎中扮演重要角色,如機(jī)體對(duì)抗病毒治療的反應(yīng)會(huì)伴隨血清鞘脂水平變化,鞘脂在慢性病毒性肝炎感染中被認(rèn)為是有希望的新生物標(biāo)志物。但目前關(guān)于糖鞘脂代謝的關(guān)鍵酶GCS與病毒性肝炎的直接研究鮮有報(bào)道。由于HBV等哺乳動(dòng)物病毒并沒(méi)有獨(dú)立編碼自己的碳水化合物修飾的酶系統(tǒng),只能利用宿主細(xì)胞糖基化機(jī)制來(lái)修改其病毒糖蛋白,如病毒糖蛋白的折疊[18],以達(dá)到侵入細(xì)胞并進(jìn)行感染的目的,因此糖基化酶可能是病毒進(jìn)行侵入和感染的重要物質(zhì)。如果給予相應(yīng)的糖基化酶抑制劑則可能干擾病毒糖蛋白的折疊,發(fā)揮抗病毒感染的作用。雖然目前并無(wú)GCS抑制劑直接用于抗病毒的證據(jù),但GCS抑制劑用于其他疾病特別是癌癥相關(guān)研究已得到充分證明[12,19],并且其在抑制細(xì)菌生長(zhǎng)方面也有顯著成效[20]。糖鞘脂存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上,細(xì)胞膜是外界微生物入侵細(xì)胞的門(mén)戶(hù),因此糖鞘脂常被細(xì)菌和病毒用作受體并不稀奇。在糖鞘脂結(jié)構(gòu)中,其脂性部分常常鑲嵌入質(zhì)膜中,而糖鏈部分則留在細(xì)胞外。糖基化會(huì)極大程度的改變?cè)局|(zhì)的功能特性,如Cer可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡發(fā)揮強(qiáng)大的抗癌作用,而其糖基化后的產(chǎn)物則產(chǎn)生截然相反的作用[9]。GCS作為糖鞘脂代謝的首部關(guān)鍵酶,其活性決定著細(xì)胞內(nèi)Cer/GC的平衡,并影響細(xì)胞功能狀態(tài),進(jìn)而影響HBV感染細(xì)胞成功與否。本研究發(fā)現(xiàn)在HBV感染Huh7期間,隨著病毒復(fù)制的增加,GCS活性逐漸升高,這與上述觀(guān)點(diǎn)相符合,因?yàn)椴《境掷m(xù)復(fù)制并感染越來(lái)越多的細(xì)胞,可能需要借助宿主細(xì)胞GCS修飾其病毒糖蛋白,協(xié)助病毒入侵細(xì)胞膜和轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程,當(dāng)然這一過(guò)程也不能排除其糖基化產(chǎn)物在其中所起的作用。在之后,GCS的活性隨著HBV DNA復(fù)制的減少而降低,以上初步表明GCS活性可能與HBV的感染有關(guān),糖鞘脂代謝與乙型肝炎有密切的聯(lián)系。

    理想的HBV感染模型應(yīng)該具備HBV感染率高、感染維持的時(shí)間長(zhǎng),且感染后能發(fā)生相應(yīng)病理改變的優(yōu)點(diǎn),最好同時(shí)具有正常免疫系統(tǒng),以便于評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)。雖然HBV感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究與應(yīng)用已取得了較大進(jìn)展,但除靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物外的其他動(dòng)物與人類(lèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn),在模擬HBV感染人的致病機(jī)制和相應(yīng)的病理生理改變方面存在較大限制。由于人體肝組織樣本和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型來(lái)源十分有限,難以滿(mǎn)足龐大的實(shí)驗(yàn)需求,所以人源化的衍生細(xì)胞系則具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。該細(xì)胞與人類(lèi)親緣關(guān)系近,易于被HBV感染,能極好的再現(xiàn)HBV感染人體的變化過(guò)程,但其也存在明顯的缺點(diǎn),由于體外細(xì)胞不具備體內(nèi)完整的免疫系統(tǒng),并且該細(xì)胞仍未達(dá)到理想的感染效率,因此不能觀(guān)察到相應(yīng)的免疫反應(yīng)。

    另外,本研究只是對(duì)GCS活性與HBV感染關(guān)系的初步研究,未能深入到具體機(jī)制。糖鞘脂家族成員眾多,涉及的化學(xué)反應(yīng)非常復(fù)雜,彼此間聯(lián)系緊密。GCS作為糖鞘脂代謝的關(guān)鍵控制點(diǎn),其活性直接決定著Cer/GC的平衡,從而對(duì)細(xì)胞命運(yùn)起決定性作用,并能在一定程度上影響相關(guān)肝臟疾病的結(jié)局,如病毒性肝炎和肝細(xì)胞癌等。因此,有必要進(jìn)一步研究GCS,在將來(lái),GCS可能成為相關(guān)肝臟疾病的治療靶點(diǎn)。

    總之,本研究通過(guò)嘗試在體外模擬HBV感染的特點(diǎn),在此基礎(chǔ)上探討了糖鞘脂合成關(guān)鍵酶和HBV復(fù)制的可能關(guān)系,研究提示糖鞘脂的合成可能與HBV的復(fù)制有關(guān),兩者之間的密切關(guān)系有可能是HBV感染的新的關(guān)注點(diǎn)。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:甘建、楊睿負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),資料分析,撰寫(xiě)論文;雷程程、楊亞婷、閆力婷、王莉莉參與臨床資料收集,數(shù)據(jù)分析;田愛(ài)平、毛小榮、李俊峰負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路,指導(dǎo)撰寫(xiě)文章,修改論文并最后定稿。

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