糖鹽介質(zhì)中γ-射線輻照對英諾克李斯特菌的殺菌效果研究

徐毓謙 李淑榮 李文慧 王 麗 黃廣學 汪慧華 馬長路

(1北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，北京 102442；2寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021)

目前，近70%的食源性疾病是由食品中微生物污染造成的，其中主要是致病性微生物，所以控制食品中致病性微生物污染是減少食源性疾病和提高食品安全性的重要途徑[1-3]。常見的熱殺菌技術(shù)和防腐劑在保證食品安全上具有重要的作用，但熱殺菌對食品原有的口感和風味有較大影響，還會破壞部分營養(yǎng)物質(zhì)；且過量使用防腐劑也會對人體產(chǎn)生一定的危害[4-5]。冷殺菌技術(shù)能較好地保持食品原有的風味[6-9]，而輻照技術(shù)是最為安全有效和簡便的食品冷殺菌冷處理方法之一[8-10]，目前已經(jīng)成為一種成熟的食品殺菌技術(shù)[9-14]。

食品中的英諾克李斯特菌(Listeria Innocua)對人類有一定的潛在致病性[15-17]。劉超超等[18]利用γ-射線輻照鮮切苦瓜，發(fā)現(xiàn)0.52～1.86 kGy 劑量輻照處理對英諾克李斯特菌具有顯著的滅菌效果，D10值為0.29 kGy；張春紅等[19]研究發(fā)現(xiàn)γ-射線輻照對生濕面條中細菌和霉菌的殺菌效果顯著，D10值分別為1.37 和2.22 kGy。

輻照殺菌效果受多種因素影響[20]，如射線的類型、初始菌含量、微生物對輻照的耐受性、含氧量、含水量、溫度以及介質(zhì)中的營養(yǎng)成分等，尤其是介質(zhì)的營養(yǎng)成分對殺菌效果影響十分顯著。Kazi 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在磷酸緩沖液、肉湯、雞肉3 種不同基質(zhì)中，輻照處理殺滅鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的D10值分別為0.20、0.57 和0.53 kGy，K1-2B 株菌的D10值分別為0.21、0.40 和0.32 kGy；Thayer 等[22]利用蛋白胨和雞肉作為基質(zhì)，培養(yǎng)4 種金黃色葡萄球菌的混合菌株，D10值分別為0.10 和0.47 kGy。這可能是由于不同基質(zhì)對致病微生物提供的保護作用不同，使菌株D10值產(chǎn)生差異[23-24]。

鹽和糖是食品基質(zhì)中的主要配料，目前尚鮮見關(guān)于其對輻照殺菌效果影響的報道。本試驗探究不同糖濃度和鹽濃度對輻照殺菌效果的影響，以期為明確影響輻照殺菌效果的因素和殺菌的機制提供依據(jù)，為調(diào)整產(chǎn)品的加工工藝，有效降低產(chǎn)品的吸收劑量，節(jié)約成本，更好地保障產(chǎn)品的質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

英諾克李斯特菌，上海北諾生物科技有限公司。

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(tryptone soya yeast extract agar，TSAYE)、含6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(tryptic soy broth with yeast extract，TSBYE)，北京陸橋技術(shù)有限責任公司；氯化鈉(化學純)，北京化學試劑公司；白砂糖，當?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

MVS-83 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；T6 新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Sigma 3K15 超低溫臺式離心機，西安恒科商貿(mào)有限公司，LRH-150 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SCW-SP-650W/SCW-CZ-650V 潔凈工作臺，北京冠鵬凈化設(shè)備有限責任公司；JA1103 電子天平，余姚紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司；FA2204B 電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；THZ-C 培英恒溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 取一環(huán)甘油中保存的菌種用五步劃線法在TSAYE 上劃線，37℃培養(yǎng)18 ～24 h 后，挑取一個單獨菌落接于20 mL TSBYE 中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，然后以5%的接種量接于100 mL TSBYE 中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h[25]。備用。

1.3.2 菌種培養(yǎng) 取活化后的菌以5%的接種量接于TSBYE 中，37℃靜置培養(yǎng)8 h，備用。

1.3.3 樣品制備 取培養(yǎng)8 h 的菌種培養(yǎng)液1 000 mL，經(jīng)8 000 r·min-1、4℃離心10 min，無菌水洗2 次，分別將無菌水、3%、5%、8%的糖溶液以及0.85%、3%、5%的鹽溶液分別與菌體充分混勻，制成濃度為108個·mL-1的菌懸液，分裝于10 mL 離心管中，以備輻照。

1.3.4 輻照方法 本試驗的γ-射線輻照處理在中國農(nóng)業(yè)科學院原子能利用研究所進行，輻射源源強為1.5×105Ci，劑量率約20 Gy·min-1。電子束輻照在中國原子能研究院進行，電子束功率10 kW，能量5 MeV，掃描寬度50 cm，掃描速度1.5 m·min-1。

先使用不同劑量的γ-射線和電子束輻照分別處理無菌水組的英諾克李斯特菌，根據(jù)結(jié)果選擇較優(yōu)輻照源類型。采用5 個輻照處理劑量，分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 kGy，未輻照樣作為對照，每個輻照劑量重復(fù)4 次，輻照處理后放入-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 菌落計數(shù)培養(yǎng)

將輻照后(包括對照組)的菌懸液進行梯度稀釋，取1 mL 合適的稀釋液加入培養(yǎng)皿中，再倒入45℃的TSBYE，混合均勻，37℃培養(yǎng)48 h，然后計菌落數(shù)[26]。分別選3 個合適的連續(xù)的稀釋梯度取稀釋液，每個梯度2 個平行。

1.3.6D10值的測定 通常微生物含量與吸收劑量之間遵循式(1)[25]:

式中，D為吸收劑量，kGy；N0為微生物的初始含量，CFU·mL-1； N 為輻照后微生物的存活數(shù)，CFU·mL-1；D10值是指殺滅90%微生物所需的吸收劑量，即為輻照劑量與存活菌數(shù)對數(shù)擬合的線性方程的斜率。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

利用軟件Excel 2013 進行數(shù)據(jù)處理和繪制圖表。采用SPSS 21 軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，采用Duncan法進行多重比較，P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照劑量及射線類型對英諾克李斯特菌輻照殺菌效果的影響

由表1 可知，隨著輻照劑量的增加，2 種輻照處理的菌懸液中菌的存活數(shù)降低，說明輻照可以有效地殺滅致病菌，這與劉超超等[18]和杜曉靜等[27]的研究結(jié)果相一致。利用lgN-D 線性回歸分析，對輻照劑量和菌落存活數(shù)進行擬合，得到輻照劑量-菌落存活數(shù)的擬合方程(圖1)。由此推算，在無菌水作為輻照殺菌的液體環(huán)境條件下，γ-射線和電子束輻照殺滅英諾克李斯特菌的D10值分別是0.788 和0.872 kGy(圖2)，γ-射線的D10值比電子束小，即殺滅同樣數(shù)量的菌體電子束需要的劑量更大，由此得出γ-射線的殺菌效果比電子束相對較好，這與徐遠芳等[28]和王晶晶等[29]的研究結(jié)果相吻合。因此后續(xù)試驗將使用γ-射線進行輻照處理。

2.2 不同鹽濃度對英諾克李斯特菌γ-射線輻照效應(yīng)的影響

致病菌在不同鹽濃度和不同輻照劑量樣品中的菌落存活數(shù)見圖3。對圖3 數(shù)據(jù)進行鹽濃度和輻照劑量兩者間的主效應(yīng)分析(表2)，結(jié)果表明輻照劑量對菌落存活數(shù)存在極顯著的影響(P＜0.01)。分析圖3 可以看出，在同等鹽濃度下，隨著輻照劑量的增大，英諾克李斯特菌的存活數(shù)逐步下降；鹽濃度對溶液中英諾克李斯特菌存活能力的影響規(guī)律受輻照劑量影響，即當輻照劑量低于1.0 kGy 時，對于輻照同一劑量的英諾克李斯特菌，各鹽濃度間及與無菌水組之間的輻照殺菌效果無明顯差異；當輻照劑量高于1.5 kGy 時，無菌水組菌的存活數(shù)與各鹽濃度之間的差異顯著，當輻照劑量為1.5 kGy 和2.5 kGy 時，隨著鹽濃度的增加溶液中的活菌數(shù)呈下降的趨勢；當輻照劑量為2.0 kGy 時，呈波動狀態(tài)，關(guān)于這一趨勢尚待進一步研究。

表1 不同輻照劑量處理后菌落存活數(shù)的對數(shù)Table 1 Logarithm of survival number of bacteria treated with different irradiation doses

圖1 不同輻照劑量處理后平板培養(yǎng)存活數(shù)的擬合方程Fig.1 Fitting equation of survival number of plate culture with differentirradiation doses

圖2 無菌水作為輻照液體環(huán)境時2 種射線D10值的比較Fig.2 Comparison of D10 values of two kinds of radiation in water as irradiation liquid environment

圖3 不同輻照劑量處理后英諾克李斯特菌存活數(shù)隨鹽濃度的變化Fig.3 The varies of survival number of Listeria Innocua by irradiation with the concentration of salt

利用輻照劑量和液體中英諾克李斯特菌存活數(shù)的線性方程計算不同鹽濃度中致病菌英諾克李斯特菌的D10值(圖4、表3)，隨著鹽濃度的增加，D10值呈先增加后降低的趨勢，即殺滅生理鹽水(0.85% NaCl)中致病菌英諾克李斯特菌的D10值與無菌水組無明顯差別，而3%和5%鹽濃度樣品的D10值與無菌水組樣品差異顯著(P＜0.05)，表明高濃度鹽水中的英諾克李斯特菌對γ-射線輻照更為敏感，高濃度鹽的存在對致病微生物的輻射殺菌有協(xié)同作用。

表2 輻照劑量及鹽濃度對菌落存活數(shù)的主效應(yīng)分析Table 2 The main factor effect analysis of irradiation doses and salt on bacteria survival

表3 γ-射線輻照不同鹽濃度中致病菌D10值Table 3 D10 values of bacteria in different salt concentrations irradiated by γ-ray

圖4 鹽濃度對菌落數(shù)和線性擬合方程的影響Fig.4 Effect of salt concentration on the number of Listeria Innocua and the linear fitting equation

2.3 不同糖濃度對英諾克李斯特菌γ-射線輻照殺菌效應(yīng)

致病菌在不同糖濃度和不同輻照樣品中的菌落存活數(shù)見圖5。對圖5 數(shù)據(jù)進行糖濃度和輻照劑量兩者間的主效應(yīng)分析(表4)。結(jié)果表明，輻照劑量和糖濃度對于菌落存活數(shù)影響極顯著(P＜0.01)。由圖5 可知，隨著輻照劑量的增加，不同糖濃度中英諾克李斯特菌的存活數(shù)逐步降低；在不同輻照劑量下，糖濃度對γ-射線輻照后英諾克李斯特菌的存活數(shù)影響變化趨勢一致，呈先增加后降低的趨勢，且5%糖溶液中活菌數(shù)最多；當輻照劑量大于2.0 kGy 后，糖溶液中的活菌數(shù)高于無菌水組。

根據(jù)輻照劑量和溶液中英諾克李斯特菌存活數(shù)的線性擬合方程計算不同糖濃度中的致病菌英諾克李斯特菌的D10值(圖6、表5)。隨著糖濃度的增加，D10值呈先上升后略下降的趨勢，最大值出現(xiàn)在5%糖濃度時，且糖濃度中英諾克李斯特菌的D10值高于無菌水組。說明在輻照條件下，糖的存在可以保護致病菌英諾克李斯特菌，導(dǎo)致殺滅英諾克李斯特菌所需的劑量增加。

表4 不同輻照劑量及不同糖濃度對菌落存活數(shù)的主效應(yīng)分析Table 4 The main factor effect analysis of different irradiation doses and different sugar concentrationon bacteria survival

表5 γ-射線輻照不同糖濃度中致病菌D10值Table 5 D10values of bacteria in different sugar concentrations irradiated by γ-ray

圖5 不同輻照劑量后處理英諾克李斯特菌存活數(shù)隨糖濃度的變化Fig.5 The varies of survival number of Listeria Innocua by irradiation with the concentration of suger

圖6 糖濃度對菌落數(shù)和線性擬合方程的影響Fig.6 Effect of sugar concentration on the number of Listeria Innocua and the linear fitting equation

3 討論

研究表明不同基質(zhì)造成同一菌株D10值差異的主要原因是不同基質(zhì)對致病微生物提供的保護作用不同[21]，因為輻照對致病微生物的殺傷作用主要是通過水離子化產(chǎn)生的初級自由離子及由此產(chǎn)生的二級離子引起的。肉湯、肉類等有機物的系統(tǒng)中含有大量的巰基、氨基酸、磷脂類等保護致病微生物的物質(zhì)，輻照產(chǎn)生的一級、二級輻照產(chǎn)物首先會與這些有機物發(fā)生反應(yīng)，生成對致病微生物無抑制作用的終產(chǎn)物[22-23]，故減弱了輻照對致病微生物的殺滅作用。

本研究中，致病菌英諾克李斯特菌在鹽溶液和糖溶液中對輻照的敏感性不同，鹽溶液對輻照殺菌效果有一定的協(xié)同作用，這可能是NaCl 溶液在輻照過程中形成了次氯酸鈉(NaClO)，生成的NaClO 有較強的氧化性，具有漂白與殺菌的作用。在鹽溶液中，隨著鹽濃度的增加，D10值呈先增加后降低趨勢，即在0.85%濃度下對致病菌英諾克李斯特菌的D10值稍高于無菌水組，但無明顯差別，這可能是由于NaCl 含量低，溶液中的Cl-或生成Cl2量少，溶液中產(chǎn)生的NaOH 量也少，且二者反應(yīng)不充分，或者溶液中所生成的NaClO 含量較低；而在高濃度鹽溶液中(3%和5%)，對致病菌英諾克李斯特菌的D10值明顯低于無菌水組，這可能是由于在輻照射線的作用下，H2O 解離成H＋和OH-，水溶液中會有NaOH 產(chǎn)生，其與溶液中的Cl-或產(chǎn)生的Cl2發(fā)生反應(yīng)，形成具有強氧化性的NaClO，因此高濃度的NaCl 對致病微生物的輻射殺菌有協(xié)同作用。

糖作為碳源為微生物提供了足夠的營養(yǎng)成分，其中以葡萄糖為主，為致病微生物提供了良好的碳源和能量，使微生物能夠生長和繁殖[30-31]，如李斯特菌屬于嗜冷菌，即使在低溫條件下也能進行緩慢增長。因此，在糖濃度適宜的情況下，糖的存在促進了菌體的生長。本研究發(fā)現(xiàn)2.0 kGy 以上劑量輻照處理對菌體細胞的損傷較大，但有糖存在的條件下，有利于受損細胞的修復(fù)，因此，出現(xiàn)了含糖溶液中的菌落存活數(shù)明顯高于無菌水組的數(shù)量。

本研究發(fā)現(xiàn)糖溶液對輻照殺菌具有一定的保護作用，有葡萄糖存在時，對致病菌英諾克李斯特菌的D10值明顯高于無菌水組，并且隨著糖濃度的增加，D10值呈先增加后略降低的趨勢。這可能是由于適宜糖濃度條件提高了微生物的生長能力，及其對不良環(huán)境的抵抗能力；且本研究發(fā)現(xiàn)在5%糖溶液條件下，D10值最大，說明此濃度的糖溶液使致病菌英諾克李斯特菌處在較適宜的環(huán)境中，而在8%的糖濃度條件下，D10值出現(xiàn)略微下降的趨勢，這可能是由于培養(yǎng)液中葡萄糖濃度過高時，細胞會滲透失水，導(dǎo)致致病菌失水過多死亡，從而抑制微生物的生長。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，輻照處理能有效殺死致病菌英諾克李斯特菌，且隨著輻照劑量的增加，殺菌效應(yīng)越明顯；相比于電子束輻照殺菌效果，γ-射線輻照殺菌的D10值更低，即γ-射線輻照殺菌的效果更好；鹽溶液濃度在0～5%范圍內(nèi)，在γ-射線輻照下，隨著鹽濃度的增加，D10值呈先增加后降低的趨勢，且鹽濃度為3%和5%時的D10值低于無菌水，說明鹽溶液對殺菌有協(xié)同作用；糖濃度在0～8%范圍內(nèi)，在γ-射線輻照下，隨著糖濃度的增大，D10值先增加后降低，5%糖濃度時的D10值最大，為1.133，糖對英諾克李斯特菌的保護作用增加了輻照殺菌的難度。本研究結(jié)果進一步說明食品基質(zhì)對致病微生物的殺菌效果具有明顯的影響。