3種水生植物組合對雙酚A脅迫的響應(yīng)

聶顯光 王 琳

(中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院/海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

雙酚A[2，2-雙(4-羥基苯基)丙烷，bisphenol A，BPA]，具有內(nèi)分泌干擾特性，主要用于生產(chǎn)環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯和聚砜樹脂等聚合物材料[1-2]。2013年至2019年，全球BPA 產(chǎn)量以每年4.6%的速度增長[3]。由于BPA 的大量生產(chǎn)和廣泛使用，導(dǎo)致其在自然環(huán)境中的釋放和積累也隨之增加，日本在垃圾填埋場滲濾液中檢測出的BPA 濃度高達17.2 mg·L-1，德國高達25 mg·L-1，遠超出飲用水安全濃度(1.5 mg·L-1)[4-6]。生物學(xué)和毒理學(xué)試驗證實BPA 對環(huán)境和暴露的生物體均有不利影響[7-10]。因此，有必要研究BPA 污染對生態(tài)系統(tǒng)功能的影響。

由于植物是生態(tài)系統(tǒng)的主要生產(chǎn)者，污染物對植物所引起的生長和代謝紊亂等影響，可以直接或間接影響生態(tài)系統(tǒng)功能的正常運轉(zhuǎn)，進而威脅整個生態(tài)系統(tǒng)的安全。已有較多研究證實BPA 對植物有毒性，高劑量BPA 可以抑制種子發(fā)芽、植物生長以及花粉管的形成和伸長[11-14]，BPA 還可以通過干擾光合系統(tǒng)、氮循環(huán)和激素合成來影響植物的生長發(fā)育[15-16]。另外，BPA 還會引起植物的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中包括馬齒莧[17]、番薯[18]、桉樹[19]、鳳眼蘭[20]、煙草[21]、鼠尾草[22]和巴西龍血樹[23]等。這些研究均集中于單一植物，然而單一物種的生態(tài)系統(tǒng)在現(xiàn)實中難以存在，多植物系統(tǒng)更貼近自然生態(tài)環(huán)境。多植物系統(tǒng)中存在不同的生態(tài)位需求和養(yǎng)分吸收途徑，可導(dǎo)致植物組合對資源利用的互補性或其他“互補性”機制的形成，同時也能提高水生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)[24]。大型水生植物物種之間的生長形式和季節(jié)變化給予了物種在調(diào)節(jié)植物總生物量和養(yǎng)分吸收等方面及時互補的能力[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物組合一般較單一植物有較強的凈化水體污染物的能力，植物多樣性越高，生態(tài)系統(tǒng)功能越穩(wěn)定，凈化效應(yīng)越強[27-28]。為了提高植物組合去除污染物效率，有必要研究多種植物組合內(nèi)各植物的生理生化狀態(tài)，進一步了解植物組合提高凈化效能的機制。

本研究通過外施BPA 分析蘆葦(Phragmites australis)、香蒲(Typha orientalis presl)和荻(Triarrhenasacchariflora)3 種濕地植物及其組合的生長情況及其光合色素含量、H2O2含量、MDA 含量、抗氧化酶活性、抗氧化物質(zhì)含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等生理指標(biāo)的變化，以揭示BPA 脅迫對植物組合內(nèi)各植物的影響，以及組合植物較單一植物在修復(fù)BPA 污染過程中潛在的生理優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為采摘自河道兩側(cè)的蘆葦、香蒲和荻幼芽，隨后在實驗室中培養(yǎng)1 個月。試驗所用BPA 購自美國Sigma 公司，BPA 標(biāo)準(zhǔn)品購自國家標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)。

1.2 試驗設(shè)計

按照全因素設(shè)計，設(shè)置蘆葦(A0)、香蒲(B0)、荻(C0)、蘆葦＋香蒲(A1＋B1)、蘆葦＋荻(A2＋C1)、香蒲＋荻(B2＋C2)、蘆葦＋香蒲＋荻(A3＋B3＋C3)7 種組合方式，并根據(jù)環(huán)境中的BPA 濃度0 ～25 mg·L-1，每組合設(shè)置0、15、30、45 μmol·L-14 個濃度梯度，如表1 所示。

選取長勢均一的繁殖體栽入試驗裝置(試驗裝置為倒梯形圓柱形，高38 cm，底徑27 cm，口直徑30 cm，內(nèi)部填裝直徑為1～2 cm 火山巖顆粒基質(zhì)至裝置高33 cm 處，出水管距基質(zhì)底部2 cm)上層火山巖顆?；|(zhì)內(nèi)，深度約為8 cm。向每個試驗裝置中注入10 L 霍格蘭營養(yǎng)液(含945 mg·L-1四水硝酸鈣、506 mg·L-1硝酸鉀、80 mg·L-1硝酸銨、136 mg·L-1磷酸二氫鉀、493 mg·L-1硫酸鎂、2.5 mL·L-1鐵鹽溶液，其中鐵鹽溶液由2.78 g 七水硫酸亞鐵、3.73 g 乙二胺四乙酸二鈉，經(jīng)蒸餾水定容至500 mL 配制而成)，每2 d 排空裝置內(nèi)營養(yǎng)液，重新注入新鮮10 L 霍格蘭營養(yǎng)液，培養(yǎng)1個月后，按照表1，每2 d 更換添加BPA 的10 L 霍格蘭營養(yǎng)液進行處理，其中添加0 μmol·L-1BPA 處理的植物為對照組。每個處理3 次重復(fù)。于處理第10 天取材測定相關(guān)生理指標(biāo)；分別在第8 天和第10 天取水樣用于測定水中BPA 含量。

表1 BPA 脅迫多種植物及其組合Table 1 BPA stress in multiple plants and their combinations /株

1.3 測定項目與方法

1.3.1 水中BPA 含量的測定 BPA 濃度參考文獻[34]采用高效液相色譜法測定，并稍作改動。每次取0.3 mL 水樣，加入1.7 mL 70%乙腈溶解，過0.22 μm尼龍膜后注射進液相瓶中，并放入超低溫冷凍冰箱進行冷凍保存，重復(fù)以上操作，直至各處理組均完成。測定條件:流動相乙腈﹕超純水(60:40)，色譜柱為C18反相柱(5 μm×40 cm，美國Waters 公司)，檢測波長217 nm，流速0.6 mL·min-1，進樣量20 μL。每個樣品重復(fù)測定3 次，根據(jù)BPA 標(biāo)樣保留時間和峰面積，計算各處理組水中的BPA 含量。

1.3.2 植株質(zhì)量測定 將整個植株用去離子水清洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，將地上部和地下部分開，用萬分之一天平稱取鮮重，然后于105℃殺青30 min 后，80℃烘干至恒重，稱干重。

1.3.3 光合色素、過氧化氫(H2O2)、MDA 含量 光合色素含量的測定采用無水乙醇浸提法[29]，記錄665 nm、649 nm 波長處的吸光度值并計算葉綠素a、總?cè)~綠素含量。過氧化氫 ( H2O2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定，分別在405 nm(H2O2)、532 nm(MDA)波長處記錄吸光度值，按照說明書中的公式計算H2O2和MDA 含量，結(jié)果以mmol·g-1prot 和nmol·mg-1prot 表示。

1.3.4 抗氧化酶活性以及抗氧化物質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測定 抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍四唑法測定[30]，反應(yīng)液在熒光燈下反應(yīng)30 min 后記錄560 nm 波長處的吸光度值，以抑制氮藍四唑光化還原的50%為一個酶活性單位；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[31]，記錄470 nm 波長處的吸光度值并計算酶活；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用紫外分光光度法測定[32]，記錄240 nm 波長處的吸光度值并計算酶活； 抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)含量采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)游離脯氨酸(proline，Pro)含量采用酸性茚三酮法測定[33]，在520 nm 波長處記錄吸光度值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Pro 含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019 統(tǒng)計，并使用Origin 2019b 軟件繪圖。使用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差方法(ANOVA) 分析顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPA 在進水和出水中的含量

由圖1 可知，BPA 濃度為15 μmol·L-1時，出水中BPA 含量在12.95～13.97 μmol·L-1之間；BPA 濃度為30 μmol·L-1時，出水中BPA 含量在25.70 ～26.79 μmol·L-1之間；BPA 濃度為45 μmol·L-1時，出水中BPA 含量在38.65～41.00 μmol·L-1之間，且各處理出水中BPA 含量差異不顯著。因此保證了試驗植物在一個恒定的BPA 含量環(huán)境中，其可使3 種不同物種及其組合表現(xiàn)出最佳的生理生化狀態(tài)。

圖1 BPA 在進水和出水中的含量Fig.1 The amount of BPA in and out of the water

2.2 BPA 對3 種不同物種及其組合的生物量的影響

由圖2 可知，同一BPA 處理濃度下，A 組的各對照組(CK-A0、CK-A1、CK-A2、CK-A3)之間干重均無顯著性差異(P＜0.05)，同樣，B、C 組各對照組間也無顯著性差異(P＜0.05)。與CK-A0 相比，添加低劑量(15 μmol·L-1)BPA 的A 組干重均顯著增加(P＜0.05)，B、C 兩組的趨勢一致，其中各組又以A1、B1、C1 增加最多，另外，A1、B1、C1 干重分別為相同處理濃度的A0、B0、C0 的1.08、1.20、1.06 倍，且除C 組外均達到顯著差異(P＜0.05)。添加高劑量(30和45 μmol·L-1) BPA 的A(除30 μmol·L-1BPA 處理的A1 外)、B、C 三組的干重均較各自對照組顯著降低；但處理組中A1、B1、C1(除45 μmol·L-1BPA 處理)干重分別較相同處理濃度的A0、B0、C0 顯著增加，分別最高達到1.08、1.23、1.18 倍。鮮重趨勢相同，數(shù)據(jù)未列。

2.3 BPA 對3 種不同物種組合葉片葉綠素含量的影響

由圖3 可知，正常生長條件下，植物組合有提高葉綠素含量的能力。隨著添加BPA 濃度的增加，A、B、C 三組內(nèi)各處理組的葉綠素a 和總?cè)~綠素含量總體均呈降低趨勢。其中，低劑量BPA 處理時，A0、B0、C0 的葉綠素a 含量和總?cè)~綠素含量分別較其對照組(CK-A0、CK-C0、CK-B0)顯著增加1.08 和1.10倍、1.08 和1.08 倍、1.07 和1.09 倍(P＜0.05)，而高劑量BPA 處理時，葉綠素a 和總?cè)~綠素含量則顯著降低(P＜0.05)。但是，全濃度(0 ～45 μmol·L-1)BPA 處理組合內(nèi)存在處理組葉綠素a 和總?cè)~綠素含量高于較A0、B0、C0 的現(xiàn)象，其中A1、B1、C1 較A0、B0、C0 的葉綠素a 和總?cè)~綠素含量顯著增加，最高達到1.13 和1.15 倍、1.04 和1.13 倍、1.10 和1.16倍。

2.4 BPA 對3 種不同物種組合葉片H2O2 和MDA含量的影響

圖2 BPA 對3 種不同物種及其組合地上干重的影響Fig.2 Effects of BPA on the dry weight of three different species and their combinations

由圖4 可知，隨著BPA 濃度的增加，3 種植物及其組合葉片中H2O2和MDA 含量也隨之增加。低劑量BPA 處理時，A0、B0、C0 葉片的H2O2含量與其各自對照(CK-A0、CK-B0、CK-C0)均無顯著差異(P＞0.05)；高劑量BPA 處理時，A0、B0(除30 μmol·L-1BPA 處理)、C0 均較其各自對照(CK-A0、CK-B0、CK-C0)顯著增加(P＜0.05)。全濃度(0 ～45 μmol·L-1)BPA 處理植物組合內(nèi)存在處理組葉片H2O2和MDA 含量顯著低于A0、B0、C0 的現(xiàn)象，組合植物處理的H2O2和MDA 含量較單一植物處理具有緩解趨勢，其中A1、B1、C1 葉片的H2O2和MDA 含量較A0、B0、C0 緩解最高，分別為0.82 和0.87 倍、0.91 和0.88 倍、0.93 和0.88 倍。

2.5 BPA 對3 種不同物種組合葉片抗氧化酶活性的影響

由圖5 可知，隨著BPA 濃度的增加，A、B、C 三組處理組葉片的SOD、POD、CAT 活性均呈增加趨勢，其中各BPA 濃度處理組中A0、B0、C0 葉片的SOD、POD、CAT 活性分別較CK-A0、CK-B0、CK-C0 顯著增加(P＜0.05)。但是植物組合A1、B1、C1 進一步顯著增加了葉片的SOD、POD、CAT 活性，其中同一BPA 處理濃度下，A1、B1、C1 的SOD 最多增加為A0、B0、C0的1.07、1.09、1.19 倍，POD 活性最多增加為1.13、1.08、1.23 倍，CAT 活性最多增加為1.30、1.17、1.10倍。

2.6 BPA 對3 種不同物種組合葉片抗氧化物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖6 可知，隨著BPA 濃度的增加，A、B、C 三組處理組的GSH 和Pro 含量也均呈增加趨勢，其中各BPA 濃度處理組A0、B0、C0 的GSH 和Pro 含量分別較CK-A0、CK-B0、CK-C0 顯著增加(P＜0.05)，而植物組合后的處理組中A1、B1、C1 的GSH 和Pro 含量分別較同一BPA 處理濃度的A0、B0、C0 進一步顯著增加(除45 μmol·L-1處理A 組的Pro 含量)，最高分別為相應(yīng)A0、B0、C0 的1.19 和1.09 倍、1.25 和1.16 倍、1.36 和1.12 倍。

圖4 BPA 對3 種植物及其組合葉片H2O2 和MDA 含量的影響Fig.4 Effects of BPA on H2O2 and MDA content in leaves of three plants and their combinations

圖5 BPA 處理對3 種植物及其組合葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig.5 Effects of BPA treatment on SOD，POD and CAT activity in leaves of three plants and their combinations

3 討論

3.1 BPA 在進出水中的含量和對3 種不同物種及其組合的生長影響

經(jīng)過連續(xù)更換BPA 處理液，7 種植物組合經(jīng)BPA處理后的出水BPA 含量雖然有波動，但無顯著差異，所以這種波動可忽略不計[35]。因此，添加BPA 培養(yǎng)10 d 進行測定時，結(jié)果顯示BPA 對植物的影響達到了穩(wěn)定狀態(tài)。

研究表明，BPA 脅迫可以影響植物的株高、莖和葉的生物量、葉面積等[36-38]。本研究結(jié)果顯示，A、B、C 三組內(nèi)處理組中單一物種的鮮重和干重，在0 ～45 μmol·L-1BPA 脅迫下表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象與Qiu 等[38]和Kim 等[39]的研究結(jié)果類似。這可能是因為低劑量(15 μmol·L-1)的BPA 具有類似細胞分裂素的作用，可以誘導(dǎo)細胞的伸長和增殖，從而促進植物地上部器官生物量的積累，而高劑量的BPA 可使根中吲哚-3-乙酸和玉米蛋白減少、脫落酸(abscisic acid，ABA)含量升高；并導(dǎo)致葉片中IAA 含量降低，ABA 和乙烯(ethylene，ETH)水平升高，從而抑制根和葉的生長[37，40]。

圖6 BPA 處理對3 種植物及其組合葉片還原型谷胱甘肽(GSH)、脯氨酸(Pro)含量的影響Fig.6 Effects of BPA treatment on reduced glutathione (GSH) and proline (Pro) contents in leaves of three plants and their combinations

植物的多樣性不僅與生產(chǎn)力存在正相關(guān)關(guān)系，且能增加地上部生物量，并增強對干旱、銨態(tài)氮等脅迫的抵抗力[27，41]。本研究中，隨著BPA 濃度的增加，蘆葦＋香蒲組合中的蘆葦、香蒲以及蘆葦＋荻組合中的荻較同種單一物種的地上生物量(鮮重/干重)增加最為顯著?？梢?，植物組合可以減輕BPA 對植物的毒害作用。這可能是因為植物組合后，植物的多樣性使植物物種之間產(chǎn)生了生態(tài)位分化，或物種間產(chǎn)生了互相促進的作用[33，42-43]。

3.2 BPA 對3 種不同物種組合葉片葉綠素含量的影響

植物光合作用對植物體的有機物積累和生長有促進作用，因此，當(dāng)光合系統(tǒng)受到環(huán)境污染物的破壞或改變時，會影響植物的正常生長[44]。本研究中，隨著BPA 脅迫濃度的增加，A、B、C 三組內(nèi)單一植物處理組植物的光合色素含量呈現(xiàn)低促高抑現(xiàn)象。這可能是因為低濃度BPA 增加了葉綠素合成過程中關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致其合成速率加快，進而提高了葉綠素的含量[13，32]；而高濃度BPA 可誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，進一步破壞葉綠體膜，同時使參與光合作用的mRNA 下調(diào)，抑制葉綠體蛋白的表達，從而導(dǎo)致葉綠素含量降低[45-46]。有研究表明，增加植物物種的豐富度可以提高生物生產(chǎn)力，同時增強對復(fù)雜養(yǎng)分和污染物的吸收[47-48]。本研究中，BPA 脅迫下A、B、C 三組內(nèi)存在植物組合較單一植物顯著提高植物光合色素含量的現(xiàn)象，可能是因為植物組合較單一植物提升了植物物種的豐富度，從而加快了植物對BPA 的吸收和降解，同時減緩了光合色素的降解，促進了光合色素的合成。因此，植物組合具有緩解BPA 脅迫所導(dǎo)致的植物光合色素降解現(xiàn)象的潛能，從而減緩BPA 對植物光合色素的破壞，降低BPA 對植物生長的影響。

3.3 BPA 對3 種不同物種組合葉片H2O2 和MDA含量的影響

植物在正常生長環(huán)境下，體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除保持著動態(tài)平衡。但環(huán)境脅迫可導(dǎo)致ROS 代謝紊亂，當(dāng)ROS 積累到超過植物抗氧化清除能力的程度，會在葉綠體、質(zhì)膜、線粒體和過氧化物酶體中產(chǎn)生氧化應(yīng)激[49-50]，引起植物細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷[51]。其中，H2O2是ROS 的重要代表物質(zhì)，MDA 是膜脂質(zhì)過氧化損傷的重要代表產(chǎn)物[49-51]。本研究中，低劑量的BPA使A、B、C 三組內(nèi)單一物種處理組的H2O2含量較其相應(yīng)對照組無明顯變化，B 組內(nèi)單一物種處理組的MDA含量較其對照組也無明顯變化。這可能是因為低劑量BPA 誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS 具有降解少量BPA 的能力[52]。但高劑量BPA 處理的A、B(除30 μmol·L-1BPA 處理的H2O2含量)、C 三組內(nèi)，單一物種處理組的H2O2和MDA 含量較其對照組卻顯著增加，這是因為BPA 脅迫可以誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而使H2O2和MDA 含量增加，加劇植物氧化損傷[53-54]。植物組合后，隨著BPA 濃度的升高，蘆葦＋香蒲組合中的蘆葦、香蒲及蘆葦＋荻組合中的荻較同種單一物種處理組的H2O2和MDA 含量相比，表現(xiàn)為無明顯變化或顯著降低?？赡苁侵参镞M行組合后，加強了BPA 的降解轉(zhuǎn)化，減少了BPA 對細胞的毒性[21，55-56]，從而減緩H2O2、MDA 的積累，進而減輕植物本身的氧化損傷，增強植物本身耐BPA 脅迫能力。

3.4 BPA 對3 種不同物種組合葉片抗氧化酶的影響

在進化過程中，植物形成一種保護性抗氧化系統(tǒng)(包括抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì))來處理這種外部脅迫產(chǎn)生的ROS，即植物通過維持較高的抗氧化酶活性以及非酶抗氧化劑的濃度來響應(yīng)氧化應(yīng)激[57]。SOD 是一種主要的超氧化物自由基清除劑，可催化超氧化物轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，而H2O2可通過CAT 和POD 的作用進一步降解[40，58]。本研究中，A、B、C 三組內(nèi)單一植物在處理組的SOD、POD、CAT 活性較其對照組顯著增加，表明植物為了清除BPA 脅迫條件下產(chǎn)生的過量ROS，啟動了抗氧化系統(tǒng)，提高了抗氧化酶活性。然而進行植物組合后，A、B、C 三組內(nèi)存在植物組合處理組的SOD、POD、CAT 活性較單一植物處理組進一步增強的現(xiàn)象。這是因為，植物進行組合有可能通過提高抗氧化酶的表達，增強清除ROS 的能力，進一步將殘留的BPA 降解為醌[20]，增加了植物對BPA的耐受力。

3.5 BPA 對3 種不同物種組合葉片抗氧化物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

GSH 作為植物體主要的抗氧化物質(zhì)，通過自身氧化為氧化型谷胱甘肽去除ROS，是自由基清除系統(tǒng)的重要組成部分[33]。游離Pro 能夠調(diào)控和維持植物細胞的滲透勢，協(xié)調(diào)細胞內(nèi)代謝過程，提高植株耐BPA脅迫能力[59]。本研究中，A、B、C 三組內(nèi)單一植物在處理組的GSH 和Pro 含量較其對照組顯著增加，表明植物本身抗氧化系統(tǒng)已被激活。然而進行植物組合后，存在植物組合處理組的GSH 和Pro 含量較單一植物處理組顯著提高的現(xiàn)象，表明植物進行組合可以增強植物葉片的ROS 清除能力和滲透調(diào)節(jié)能力，從而減輕氧化應(yīng)激損傷，提高植物耐BPA 脅迫能力。

4 結(jié)論

低劑量(15 μmol·L-1)的BPA 可以促進3 種植物及其組合的鮮重、干重、光合色素含量、抗氧化酶活性、抗氧化物質(zhì)含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量。高劑量(30 和45 μmol·L-1)BPA 脅迫下，蘆葦、香蒲、荻單一植物處理組會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低光合色素含量，提高H2O2活性氧積累量、SOD、POD、CAT 活性、MDA 含量、GSH 含量和Pro 含量。進行植物組合可以有效地增加組合內(nèi)同種植物的光合色素含量，降低H2O2和MDA 含量，并通過進一步提高抗氧化酶活性、抗氧化物質(zhì)含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來增強組內(nèi)植物抗BPA 脅迫的能力，緩解BPA 脅迫帶來的氧化損傷，從而促進植物的生長，其中最優(yōu)植物組合為蘆葦和香蒲，其次為蘆葦和荻。