不同球孢白僵菌菌株對家蠶的致病力分析

吳靈芝，宋 璐，余天成，李保珍，樊金華

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西太谷030801；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原030000）

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）屬于子囊菌門（Ascomycota）肉座菌目（Hypocreales）蟲草菌科（Cordycipitaceae）白僵菌屬（Beauveria），能寄生于700 多種昆蟲[1]，是一種廣譜性的昆蟲病原真菌[2]。雖然球孢白僵菌能引起家蠶白僵病，但使用得當(dāng)，也將是最有前景的生防菌種之一[3-5]，能夠廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲防治[6-7]?，F(xiàn)階段，白僵菌制劑已經(jīng)應(yīng)用于防治亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）[8]、油松毛蟲（Dendrolimus tabulaeformis）[9]、煙粉虱（Bemisia tabaci）[10]、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）[11]、蚜蟲（Aphidoidea）[12]、蝗蟲[13]等眾多農(nóng)林害蟲[14]。但白僵菌菌株種類眾多，篩選出具有更高致病力的菌株，并且在最佳用藥時期以最佳濃度應(yīng)用于生防，仍然是需要探索的問題[15]。

球孢白僵菌的分生孢子在接觸昆蟲后，容易在高溫高濕的環(huán)境下萌發(fā)，萌發(fā)的菌絲通過表皮侵入寄主昆蟲的體內(nèi)并生長、繁殖，產(chǎn)生大量的菌絲和有毒代謝產(chǎn)物[1，16]。白僵菌以體壁侵染的方式感染家蠶時，發(fā)現(xiàn)其分生孢子接觸家蠶表皮后10 h 內(nèi)萌發(fā)，菌絲能在家蠶體內(nèi)快速生長繁殖致使養(yǎng)分和水分被迅速消耗，表皮開始出現(xiàn)黑色斑點，最終僵硬死亡[17]。白僵菌侵染寄主昆蟲，除了體表侵染外，還采用口服和背部注射等方法，背部注射法可使白僵菌更快地進入家蠶體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)。

昆蟲病原菌侵染昆蟲后，能夠引起其食量下降、排便異常、嘔吐等行為變化[18-19]，最終影響其生長發(fā)育。白耀宇等[20]研究表明，大腸桿菌對草地貪夜蛾幼蟲體質(zhì)量具有抑制作用。TEFERA 等[21]研究了白僵菌感染二化螟（Chilo partellus）幼蟲，證明菌株在處理后1～4 d 顯著影響其取食。MOORE 等[22]研究表明，沙漠蝗（Schistocerca gregaria）取食量的減少與綠僵菌的濃度和劑量密切相關(guān)。

家蠶（Bombyx mori）是國內(nèi)外公認的并且研究廣泛的鱗翅目模式昆蟲，是易于實驗室飼養(yǎng)的重要經(jīng)濟昆蟲。本研究將球孢白僵菌以背部平行注射的方法侵染家蠶，探討球孢白僵菌菌株TST、FDB 和BF 對家蠶卵和幼蟲的致病力及對家蠶幼蟲生長發(fā)育的影響，為揭示球孢白僵菌對家蠶的致病機理及更多高效生防真菌制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)[23]。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲 試驗所用家蠶為Nistari 品系，西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院贈送。

1.1.2 供試菌株 球孢白僵菌菌株TST，分離自桃小食心蟲（Carposina sasakii）越冬蟲尸上[24]；球孢白僵菌菌株BF，分離自光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）蟲尸上[25]；球孢白僵菌菌株FDB，分離自帕克阿扁松葉蜂（Acantholyda）蟲尸上[26]，均保存在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林生物顯微技術(shù)實驗室。

1.1.3 儀器 GDN-300E-4 型光照培養(yǎng)箱（寧波樂電儀器制造有限公司）、DL-CJ-IND 型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限責(zé)任公司）、78-2 型磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）、LS-35HD 型立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、SB-20002 型電子天平（海寧市盛博衡器有限公司）、ZEISS 型光學(xué)顯微鏡（上海永匯實業(yè)發(fā)展有限公司）、徠卡M205C 型超景深體視顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶飼養(yǎng) 家蠶用食品級塑料盒（1 500 mL）飼養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中，溫度為（25±1）℃，5 齡家蠶的相對濕度控制在70%，光照周期12L∶12D。越年蠶卵在4 ℃冰箱保存，最長不超過60 d。家蠶飼養(yǎng)所用桑葉采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)站，用自封袋密閉保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 球孢白僵菌分生孢子懸液制備 在無菌條件下，用接種環(huán)刮取少量球孢白僵菌孢子，以平板劃線法接種到新的PDA 培養(yǎng)基上[27]，然后用封口膜密封，在（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中，光周期12L∶12D，倒置培養(yǎng)10 d 采收。將培養(yǎng)好的球孢白僵菌在無菌條件下刮取適量孢子，置于盛有0.05%吐溫-80 的三角瓶中，磁力攪拌器上攪拌10 min，使孢子均勻分散，后用2 層紗布過濾除去菌絲，即為待測孢子懸液。采用血球計數(shù)法計數(shù)懸液孢子數(shù)備用。

1.2.3 球孢白僵菌對家蠶卵的致病力測定 家蠶產(chǎn)卵當(dāng)天，分別取10 μL 濃度為1×107個/mL 的TST、FDB、BF 菌株的孢子懸浮液滴到產(chǎn)卵紙上有卵的地方，并將其周圍浸濕，每組處理30 粒卵，設(shè)3 個重復(fù)。將處理后的卵放置在培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，統(tǒng)計卵的孵化數(shù)，直至全部孵化。對照組用等量的0.05%吐溫-80 處理。

1.2.4 球孢白僵菌對家蠶幼蟲的致病力測定 挑取健康的5 齡第3 天家蠶幼蟲，先用75%酒精將注射處體壁消毒，然后置于鋪有保鮮膜的冰盒中10 min后利用微量注射器將5 μL 不同菌株孢子懸液從背部注射家蠶體內(nèi)。新鮮桑葉飼養(yǎng)，每隔24 h 觀察并記錄蟲體死亡情況，計算累計死亡率和半數(shù)致死時間（LT50）。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，每組10 頭試蟲。將死亡的家蠶轉(zhuǎn)移到無菌的培養(yǎng)皿中，當(dāng)球孢白僵菌菌絲長滿體表時，記錄時間、并用體視顯微鏡拍照。

1.2.5 家蠶生長指標的測定 選取發(fā)育正常、體質(zhì)量相近的5 齡第2 天的家蠶，饑餓處理2 h 后進行體質(zhì)量和體長測量，記錄初始值。用微量注射器將5 μL 不同孢子懸液（濃度1×107個/mL）從背部注射家蠶。設(shè)置TST 菌株孢子懸液、BF 菌株孢子懸液、FDB 菌株孢子懸液和吐溫-80 無菌水（對照組）共4 組處理。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，每組10 頭試蟲。在直徑為9 cm 的無菌培養(yǎng)皿里正常飼養(yǎng)，每隔24 h 逐條進行體質(zhì)量和體長測量，計算每24 h 平均相對增長量和72 h 的平均相對增長量[28]。

1.2.6 TST 菌株對家蠶的毒力測定 將球孢白僵菌TST 菌株參照1.2.2 的方法配制成孢子懸液，最終濃度梯度為1×105、1×106、1×107個/mL，對照組（CK）為加有0.05%吐溫-80 的無菌水，注射劑量為5 μL。每處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 頭試蟲。采用新鮮桑葉飼養(yǎng)，每隔24 h 進行1 次觀察，記錄死亡蟲數(shù)，計算致死中濃度（LC50）和致死中時（LT50）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS13.0 軟件進行方差齊性檢驗，滿足P＞0.05 再進行方差分析和多重比較，并用GraphPad Prism 7 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌菌株對家蠶卵的致病力

從表1 可以看出，與對照組相比，各處理組孵化天數(shù)無顯著差異（P＞0.05），孵化天數(shù)基本保持在7 d 左右，這與正常家蠶無差別[29]。

表1 球孢白僵菌菌株侵染后卵的孵化天數(shù)

2.2 球孢白僵菌菌株對家蠶幼蟲的致病力

從表2 可以看出，TST 和BF 菌株具有較高的致病力，對家蠶幼蟲的累計死亡率均超過50%，TST菌株的累計死亡率最高，達到了96.67%±5.77%。TST 菌株的LT50最短，為3.08 d，表明其對家蠶幼蟲的毒力最強；FDB 菌株的LT50最長，為6.41 d，表明其對家蠶幼蟲的毒力最弱。綜上所述，TST 菌株對家蠶的致病力最強。

表2 球孢白僵菌菌株對家蠶幼蟲的致病力

由表3 可知，TST 菌株的菌絲覆蓋家蠶表皮的時間為5.29 d，比FDB 和BF 菌株的時間更短，但這3 個菌株間沒有顯著差異。

表3 球孢白僵菌菌絲覆蓋家蠶表皮的時間

由圖1 可知，對照組家蠶體表形態(tài)正常，而TST、BF、FDB 菌株侵染后的家蠶體表與對照組相比，明顯被大量菌絲覆蓋、呈白色，家蠶體長變短且僵直。

2.3 球孢白僵菌菌株對家蠶幼蟲體質(zhì)量變化的影響

由圖2 可知，對照組的增長量比其他3 個處理組都快，且體質(zhì)量增加比較平穩(wěn)，沒有較大起伏；FDB 菌株處理的家蠶體質(zhì)量增長量較對照稍慢，與對照組無顯著差異（P＞0.05）；BF 菌株處理的家蠶體質(zhì)量在后期（72 h）的增長量與對照相比顯著減少（P＜0.001）；TST 菌株處理后家蠶的體質(zhì)量增量與對照相比差異極顯著，它的增長量最少。所以，相比其他處理，TST 菌株對家蠶體質(zhì)量的影響最顯著，它能明顯抑制家蠶的生長發(fā)育。

從圖2 可以看出，4 個處理間72 h 平均相對增長量有極顯著差異（P＜0.001）。BF 和TST 菌株處理家蠶后72 h，家蠶幼蟲的體質(zhì)量增長量顯著低于對照組和FDB 菌株處理組（P＜0.05），而FDB 菌株處理組與對照組間并沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.4 球孢白僵菌菌株對家蠶幼蟲體長變化的影響

球孢白僵菌侵染家蠶在一定程度上也會對家蠶幼蟲的體長造成影響，從圖3 可以看出，所有處理的家蠶幼蟲體長增長量隨著感染時間的增加都有所減少。處理24 h 后，所有處理的家蠶體長增長量沒有明顯的規(guī)律，但是在48、72 h 對照組體長增長量比其他3 個處理組多，并且與TST 菌株處理間差異極顯著，說明在3 種球孢白僵菌中TST 菌株的毒力最強，對家蠶幼蟲體長增長的抑制作用最大。

由圖3 可知，4 個處理間72 h 平均相對增長量有顯著差異（P＜0.01）。在BF 和TST菌株處理后72 h內(nèi)，家蠶幼蟲的體長增長量顯著低于對照組（P＜0.05），而FDB 菌株處理與對照組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 TST 菌株對家蠶的毒力測定

從表4 可以看出，TST 菌株的LC50為2.25×106個/mL[30]。孢子懸液的濃度越高，LT50越短，濃度為1×105、1×106、1×107個/mL 的球孢白僵菌侵染家蠶的LT50分別為6.20、5.12、3.36 d，表明孢子懸液的濃度越高，對家蠶的毒力越強。

表4 TST 菌株對家蠶的毒力測定

3 結(jié)論與討論

有研究表明，綠僵菌菌株對草地貪夜蛾的卵有高達80%的致病力，而球孢白僵菌對其卵沒有顯著影響[31]。本研究中，3 株球孢白僵菌同樣對家蠶卵的孵化都無顯著影響，這可能是因為家蠶的卵殼厚而堅硬，白僵菌的分生孢子難以入侵；當(dāng)卵孵化后，卵殼表面黏附的分生孢子可能會再次侵染幼蟲，甚至造成多代傳播。球孢白僵菌對蟲卵的致病力小，因此，在利用白僵菌生物防治時要選擇適當(dāng)?shù)臅r期。

致死中時（LT50）是目前高毒力菌株篩選的主要指標[32-33]。目標昆蟲的累計死亡率越高，LT50越短，表明其有更強的致病力[34]。本研究中，球孢白僵菌對家蠶幼蟲有明顯的致病力，TST 菌株毒力最強，對家蠶的累計死亡率可達96.67%，致死中時為3.08 d，其菌絲覆蓋表皮的時間為5.29 d，表明其具有開發(fā)成生物防治劑的潛力。

本研究表明，對照組形態(tài)正常，而其他3 組球孢白僵菌侵染的家蠶體表都長滿了白色的菌絲，但菌絲的顏色、生長密度稍有差異，可能是因為這3 種白僵菌的特性和致病力強弱不同。并且白僵菌侵染的家蠶死亡后蟲體大小比對照組要小很多，這也與前人的研究結(jié)果一致[19]。在本研究中，白僵菌侵染的初期，家蠶背部注射菌液的部位就開始出現(xiàn)黑色斑點，幼蟲活動能力減弱，待家蠶死亡后，侵染部位的黑色斑點變大，體表其他部分也出現(xiàn)了大小不一的黑斑，稱為入侵斑[35]，之后菌絲首先從侵染部位長出，在培養(yǎng)皿中潮濕培養(yǎng)后口器、節(jié)間膜被菌絲覆蓋，最后長滿全身。

球孢白僵菌注射家蠶，家蠶幼蟲的體質(zhì)量增長量明顯低于對照組，并且TST 菌株在72 h 內(nèi)顯著抑制其體質(zhì)量的增長。在處理后24 h 體長增長量沒有明顯的規(guī)律，這可能是由于球孢白僵菌處理的家蠶幼蟲在前期取食桑葉的量較多，可提供更多的營養(yǎng)和能量去應(yīng)對球孢白僵菌的攻擊；后期TST 菌株感染的家蠶體長增長量顯著減少，可能是由于球孢白僵菌在寄主體內(nèi)大量繁殖，致使營養(yǎng)大量消耗，機體抵抗力降低。通過研究球孢白僵菌對家蠶體質(zhì)量體長的影響，印證了球孢白僵菌侵染能引起昆蟲取食量減少[36]，在一定程度上能夠?qū)η蜴甙捉┚诹謽I(yè)病蟲害防治中具有指導(dǎo)意義。

GARCíA 等[37]報道了濃度為1.0×109個/mL 的球孢白僵菌菌株Bb42 侵染鱗翅目昆蟲草地貪夜蛾2 齡幼蟲的LT50為3.6 d，死亡率為96.6%。而本研究1×107個/mL 的球孢白僵菌菌株TST 對家蠶的LT50僅需3.36 d，相比之下，較前者的致死速度快，其對家蠶的累計死亡率高達96.67%。因此，TST 菌株致病力更強，未來在農(nóng)林害蟲的生物防治方面具有更高的研究和應(yīng)用價值。本研究通過背部注射的方式初步探索了3 種球孢白僵菌菌株對家蠶的致病力，但球孢白僵菌感染家蠶的方式還包括體表侵染和口服等，對于不同侵染方式對家蠶的毒理數(shù)據(jù)仍需進一步研究。此外，對球孢白僵菌致病機理的研究還需深入到細胞免疫和體液免疫[38]，這樣才能更加準確地解釋球孢白僵菌與昆蟲的互作機制。