谷子LAC 基因家族的鑒定及分析

薛佳麗，任曉慶，郄倩茹，段 明，申慧芳，高建華

（1.山西農業(yè)大學基礎部，山西太谷030801；2.山西農業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801；3.山西農業(yè)大學實驗教學中心，山西太谷030801）

漆酶（LAC）是一種含銅離子的酚類氧化酶，屬于銅藍氧化酶蛋白家族，其最初是從漆樹（Rhus ver-nicifera）的漆液中發(fā)現(xiàn)，之后在一些真菌、細菌中也發(fā)現(xiàn)了漆酶的表達[1]。在植物中，漆酶主要參與木質素的合成，而在真菌中，其則與木質素降解有關[2]。木質素作為植物生長發(fā)育中的一種次生代謝物，在植物生長發(fā)育和抗性方面具有重要的生物學功能。在對植物木質化過程的研究中，植物漆酶備受關注[3]。

近年來，隨著植物基因組序列的發(fā)布和生物信息學技術對相應數(shù)據(jù)的挖掘，極大加速了植物基因家族的篩選和鑒定[4]。目前，已報道多種植物的漆酶家族，其中，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中含有17 個AtLAC基因[5]；水稻（Oryza sativa）基因組含有30 個OsLAC基因，且大部分在根中高表達[6]；亞麻（Linum usitatissimum）中鑒定出45 個LuLAC基因[7]；甜高粱（Sorghum bicolor）中鑒定出27 個SbLAC基因[8]；二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中鑒定出29 個BdLAC基因[9]；甘蔗（Saccharumspp.）中鑒定出12 個SpLAC基因[10]等。由此可見，不同植物中漆酶基因家族成員存在較大差異。研究發(fā)現(xiàn)，植物漆酶主要參與根、莖細胞壁的木質化過程[11]。在擬南芥中，lac4或lac17缺失突變導致莖稈中木質素含量降低約20%，而lac4和lac17雙突變體的木質素含量降低40%，且木質部表型不規(guī)則，lac17恢復表達能夠使木質部剖面結構恢復正常[12]。研究二穗短柄草中LAC5[9]和毛竹中克隆的2 個LAC基因[13]在莖的木質化中也發(fā)揮著重要作用。楊樹LAC3基因表達對其木質部纖維的正常細胞壁結構和完整性至關重要[14]。此外，漆酶的活性與酚酸類物質的抗性呈正相關，LAC基因的表達增強了植物抗性[15]。

谷子（Setaria italica）屬禾本科，由野生近親狗尾草（Setaria viridis）馴化而來，在我國北方地區(qū)已有超過8 700 a 的歷史[16]。其具有抗干旱、耐貧瘠、適應性廣等特性。另外，谷子為二倍體，基因組小，如最早發(fā)布的豫谷1 號基因組約500 Mb[17]，張雜谷基因組約420 Mb[18]，晉谷21 超早熟突變體xiaomi的基因組約430 Mb[19]。近緣物種狗尾草的漆酶基因已通過生物信息學方法進行篩選[20]，而谷子漆酶的研究相對較少。

本研究利用生物信息學方法篩選鑒定谷子LAC（SiLAC）基因家族，并對其染色體的分布、基因結構、啟動子順式作用元件及在不同組織的表達譜進行分析，旨在為谷子木質素合成途徑的研究和種質資源創(chuàng)新及利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 SiLAC 基因家族成員的鑒定

為了鑒定谷子LAC基因家族成員，本研究通過文獻獲取狗尾草的LAC（SvLAC）基因家族成員[20]，并利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫的Sequence Search 功能下載符合LAC基因家族的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）[21]。

從Phytozome V12 數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）[22]中分別獲取水稻（Osativa_323_v7.0.protein.fa）、谷子（Sitalica_312_v2.2.protein.fa）、擬南芥（Athaliana_447_Araport11.protein.fa）和狗尾草（Sviridis_500_v2.1.protein.fa）的蛋白質數(shù)據(jù)，通過HMMER 軟件中的hmmsearch 命令對4 個物種全基因組蛋白質數(shù)據(jù)進行檢索，篩選閾值E ＜1e-20的結果為候選基因。利用MEGA X 軟件對谷子、狗尾草、水稻和擬南芥的LAC家族蛋白進行多序列比對（Clustal W 法），采用鄰接法（Neighbour Joining Tree，NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 設置為1 000，其他參數(shù)默認[23]。為了防止遺漏，利用獲得的谷子LAC基因家族氨基酸序列，重構HMM模型，并使用該模型重新檢索谷子蛋白質數(shù)據(jù)庫，最終確定谷子LAC基因家族成員。

1.2 SiLAC 基因家族染色體定位分析及命名

利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫中下載的谷子基因組注釋gff3 文件，用TBtools[24]對篩選到的基因進行位置信息的提取。利用在線工具MapGene2Chromosome V2（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）[25]對基因定位的結果進行分析，繪制染色體定位圖，并命名。

1.3 SiLAC 蛋白理化性質及亞細胞定位分析

利用ProtParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）預測SiLAC基因家族成員編碼蛋白質的氨基酸數(shù)目、分子質量、理論等電點和親疏水性等理化性質。利用在線軟件PSORT（http://psort1.hgc.jp/form.html）對SiLAC基因編碼的蛋白質進行亞細胞定位預測。

1.4 SiLAC 啟動子順式作用元件分析

利用TBtools 中Gtf/gff3 Sequences Extractor 選項獲取SiLAC上游2 000 bp 的基因組序列，將所獲取的序列提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子順式作用元件分析，最后通過TBtools 對常見功能元件進行可視化展示。

1.5 SiLAC 基因家族基因結構及motif 分析

通過MEME 預測SiLAC基因家族的保守基序，保守位點寬度設置為≥10 和≤100，最大保守序列鑒定數(shù)目設置為10。利用TBtools 繪制SiLAC基因家族基因結構和保守基序圖。

1.6 SiLAC 基因家族特異性表達分析

為了進一步分析SiLAC基因家族成員在谷子不同組織中的表達情況，在Phytozome 數(shù)據(jù)庫下載公布的豫谷1 號轉錄組雙端測序數(shù)據(jù)，篩選SiLAC基因在光下生長10 d 的根、7 d的莖、14 d的旗葉、第一階段穗的表達量[17]?；诟骰蛟谥参锝M織各器官的表達差異構建表達熱圖，并利用可視化軟件TBtools 展示。

2 結果與分析

2.1 SiLAC 基因家族的鑒定與進化關系

親緣關系分析結果顯示（圖1），52 個SiLAC 蛋白可分為5 組（Ⅰ～Ⅴ），其中，Ⅴ亞家族包含33 個SiLAC 蛋白，Ⅳ亞家族包含6 個SiLAC 蛋白，Ⅰ和Ⅱ亞家族均包含5 個SiLAC 蛋白，Ⅲ亞家族數(shù)量最少，包含3 個SiLAC 蛋白，這與SvLAC 的分類相符[20]。與擬南芥相比，谷子與水稻的LAC 同源性較高，這可能是因為擬南芥為雙子葉植物，而谷子和水稻同屬禾本科單子葉植物。

對豫谷1 號中共鑒定的52 個SiLAC家族成員，按照其在染色體上的位置（圖2），命名為SiLAC1～SiLAC52，其中，SiLAC1～SiLAC51分布在谷子1、3、4、5、7、8、9 號染色體上，5 號和8 號染色體上該基因拷貝數(shù)較多，形成基因簇，5 號染色體有8 個緊密串聯(lián)（SiLAC13～SiLAC20），8 號染色體有25 個緊密串聯(lián)（SiLAC25～SiLAC49）；SiLAC52基因序列尚未定位，不在谷子的9 條染色體上。

對SiLAC 蛋白進行理化性質和亞細胞定位預測結果顯示（表1），除SiLAC38基因僅編碼271 個氨基酸外，其余SiLAC基因編碼氨基酸序列長度在472～651；等電點范圍在5.33～9.49，其中，等電點大于9 的基因有4 個，分別為SiLAC4、SiLAC8、SiLAC24、SiLAC29，小于6 的基因有19 個；52 個漆酶中酸性氨基酸有40 個，堿性氨基酸有12 個，表明不同漆酶工作環(huán)境pH 差異較大。SiLAC家族44 個成員的總平均親水性（GRAVY）為負值，為疏水性蛋白，且所有的成員脂肪系數(shù)均小于100，故均為脂溶性蛋白；52 個SiLAC 蛋白定位于細胞外，均屬于分泌型蛋白。

表1 SiLAC 基因家族成員及理化性質

續(xù)表1

2.2 SiLAC 基因家族啟動子順式作用元件分析

為了探究SiLAC基因家族啟動子在轉錄水平的調控功能，對其基因上游2 000 bp 的序列進行順式作用元件預測，結果共鑒定了11 類順式作用元件（圖3），包括參與茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素響應、低溫響應、分生組織表達調控、胚乳表達調控、參與干旱脅迫、防御應激反應的順式作用元件以及光響應和黃酮類化合物合成調控的3 個MYB 結合位點。其中，SiLAC50包含的響應元件種類最多（8 種），而SiLAC47包含的順式響應元件最少（1 種）。從組成類型特異性來看，除了SiLAC6、SiLAC8、SiLAC20、SiLAC40、SiLAC41、SiLAC47以外，其余都含有茉莉酸甲酯響應元件；除SiLAC7、SiLA20、SiLAC31、SiLAC47以外，其余均包含脫落酸響應元件；SiLAC47包含的啟動子區(qū)順式元件最少，僅參與低溫響應；約1/2 基因的啟動子序列中包含干旱脅迫下MYB 轉錄因子結合位點，還有部分參與光響應脅迫下MYB 轉錄因子結合位點，可見，SiLAC家族可能受MYB 轉錄因子調控，通過改變細胞壁木質化程度，提高抵抗逆境脅迫的能力。這些結果表明，SiLAC基因不僅在植物生長發(fā)育過程中起作用，而且在干旱、低溫等逆境響應中也發(fā)揮著重要作用。

2.3 SiLAC 家族的基因結構分析

SiLAC基因家族成員的基因結構分析結果顯示（圖4），52 個SiLAC基因均為斷裂基因，包含2～6 個外顯子，以6 個外顯子為主，但是不同基因的基因結構存在一定的差異。其中，SiLAC2、SiLAC3、SiLAC4、SiLAC5、SiLAC10、SiLAC20、SiLAC21、SiLAC31、SiLAC52不含非翻譯區(qū)（UTR），其余都具有5′端和3′端非翻譯區(qū)。保守結構域分析顯示（圖4），GroupⅤ亞區(qū)中，SiLAC5不包含motif 1、motif 3 和motif 9；SiLAC38不包含motif 4、motif 5、motif 8 和motif 10；其余該區(qū)基因均包含motif 1～motif 10，且排列順序基本一致。Group I～IV 中，Group Ⅰ的SiLAC10、SiLAC22、SiLAC23和SiLAC50包含motif 10；Group Ⅱ的SiLAC2不包含motif 3，其余Ⅰ～Ⅳ區(qū)中SiLAC基因均含有motif 1～motif 9，且排位基本一致。說明LAC 蛋白家族成員基本結構相對比較保守。

2.4 SiLAC 基因家族特異表達分析

為了進一步分析SiLAC基因在谷子不同組織中的表達情況，對豫谷1 號不同組織轉錄組數(shù)據(jù)的FPKM值進行了分析，結果表明（圖5），SiLAC13、SiLAC25、SiLAC28在生長10 d 的根中表達量極高（FPKM＞30），具有組織表達特異性；SiLAC51在第一階段穗子中表達量最高，達到27.149；在莖中，SiLAC37、SiLAC18表達量高于其他基因，F(xiàn)PKM 值分別為20.803 和16.408。此外，SiLAC基因家族在生長14 d 的旗葉中不表達或低表達（FPKM＜5），可能是因為葉的木質化程度較低。

3 結論與討論

本研究通過對豫谷1 號中的52 個LAC基因進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，SiLAC基因家族可分為5 個亞家族，其中，Ⅴ亞家族包含33 個基因成員，占63.46%。家族成員多分布于5 號和8 號染色體上，這與狗尾草中鑒定的52 個LAC基因家族的聚類和分布情況相似[20]。Ⅴ亞家族成員的高占比主要是由第V 分支內的多個基因串聯(lián)重復引起的。與擬南芥相比，谷子SiLAC與水稻OsLAC親緣關系更近，可能與同屬禾本科單子葉植物有關。木質素是細胞壁的主要組成成分，在擬南芥生長發(fā)育過程中，AtLAC17、AtLAC4和AtLAC11等漆酶基因都被證明參與木質素合成[5，12，26]。亞細胞定位預測表明，SiLAC蛋白均為分泌型蛋白，符合谷子漆酶參與木質素的合成預期。趙晶等[27]在陸地棉（Gossypium hirsutum）漆酶的分析中也發(fā)現(xiàn)，其83 個GhirLAC 蛋白都屬于分泌蛋白。

本研究表明，豫谷1 號SiLAC基因家族在葉中幾乎不表達，而少量基因在根、莖等木質化程度較高的部位中表達活躍。在多種植物中也觀察到類似的現(xiàn)象，比如擬南芥[28]、亞麻[9]等。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，SiLAC25、SiLAC13和SiLAC28基因的表達主要集中在根部，而SiLAC37和SiLAC18基因主要在莖部表達，這些基因可能是參與谷子木質化的關鍵基因。在水稻中，OsLAC主要在胚乳、根、莖和花中表達，多數(shù)基因在根中（包括營養(yǎng)和生殖生長階段）表達量較高[29]。在擬南芥中，AtLAC1、AtLAC3、AtLAC7、AtLAC8和AtLAC15在根和生殖器官中表達[5]。有研究表明，microRNA857 可以通過靶向AtLAC7來調節(jié)擬南芥莖中次生木質部的形態(tài)發(fā)生和木質素積累，而不會影響木質素生物合成基因的表達[28]。這些結果表明，AtLAC7在擬南芥莖木質部細胞木質素聚合中起關鍵作用。

本研究進一步分析根中的3 個高表達基因可發(fā)現(xiàn)，SiLAC13在5 號染色體的基因簇中，SiLAC25和SiLAC28在8 號染色體的基因簇中，基因串聯(lián)重復可使在同一染色體上的基因具有相似的功能。對SiLAC啟動子順式作用元件預測分析，發(fā)現(xiàn)谷子SiLAC啟動子區(qū)含有茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素反應等激素應激響應元件，而這3 個高表達基因啟動子中均含有茉莉酸甲酯、脫落酸反應等激素響應元件，推測SiLAC的表達可能受激素影響。這與劉彥英等[30]在香蕉（Musa paradisiaca）漆酶基因（MaLAC）中的發(fā)現(xiàn)相似，在香蕉MaLAC啟動子區(qū)也含有茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素、水楊酸等激素應激響應元件。其次，谷子是耐旱作物[31]，結果表明，SiLAC28、SiLAC25、SiLAC13分別包含了4、2、2 個參與干旱誘導的MYB 轉錄因子結合位點相關的作用元件，因此，認為這3 個基因可能參與谷子抗旱調控，通過MYB 轉錄因子調控，改變細胞壁木質化程度，從而提高抵抗逆境脅迫的能力。再者，有60%左右的基因還包含1～2 個與MYB轉錄因子結合位點相關的作用元件，這些MYB結合位點參與光反應、干旱誘導、黃酮合成基因調控，因此，這些基因可能參與了谷子生長發(fā)育過程中種子成熟和色素合成，這與龍眼（Dimocarpus longanLour.）中漆酶基因的部分啟動子元件功能一致，預測谷子漆酶可能高度參與了谷子生長發(fā)育調控或相關防御應激反應[32]。

本研究基于谷子基因組和轉錄組數(shù)據(jù)，鑒定了52 個SiLAC基因。通過染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，5 號和8 號染色體出現(xiàn)SiLAC基因串聯(lián)重復，其中，位于5 號染色體的SiLAC13、位于8 號染色體的SiLAC25和SiLAC28在根部組織中特異表達，這3 個基因均含有與激素響應相關的啟動子順式作用元件，預測SiLAC的表達可能會受激素影響。此外，SiLAC啟動子序列還包含與植物生長發(fā)育調控、逆境響應相關的順式作用元件，表明在谷子生長發(fā)育過程中漆酶基因家族發(fā)揮重要作用。本研究結果可為進一步分析谷子LAC基因家族的功能、解析其在谷子生長過程中表達調控機制提供參考。