多管發(fā)酵法測定水體中糞大腸菌群的方法驗證及質(zhì)量控制

鄧澤 魯朝旭 袁姁 王馥云 余世東

摘 要：糞大腸菌群作為指示水體糞便污染的菌群，在環(huán)境監(jiān)測中是很重要的項目。本文通過對空白實驗、陰陽性對照、精密度、準確度等試驗，對新方法進行了實驗室驗證，并對不確定度、注意事項和優(yōu)缺點等方面進行了探討，為多管發(fā)酵法測糞大腸菌群的準確性提供一定參考和技術保障，希望能夠更好地服務于環(huán)境監(jiān)測工作。

關鍵詞：糞大腸菌群;多管發(fā)酵法;不確定度;方法驗證

中圖分類號：X832

糞大腸菌群在微生物項目中是總大腸菌群中的一部分，主要用來表明水質(zhì)受糞便污染的程度。糞大腸菌群是一類能使乳糖發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在44.5℃培養(yǎng)24～48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。水體糞大腸菌群含量的高低與周邊經(jīng)濟發(fā)展、企業(yè)影響、人口等因素密切相關，水體超標會影響整個流域生態(tài)環(huán)境，對人體健康極為不利。通過對糞大腸菌群的監(jiān)測，可了解水體受生活污水污染的狀況。目前，WHO、ISO以及世界上絕大多數(shù)國家都以糞大腸菌作為水質(zhì)糞便污染指標菌。糞大腸菌群適用于河流、湖泊等地表水、企業(yè)污水及醫(yī)院廢水的監(jiān)測，是綜合評價城鎮(zhèn)污水尤其是生活污水污染的一個必不可少的重要指標[1-3]。

國際上測糞大腸菌群的實驗方法主要有，多管發(fā)酵法、酶底物法、紙片法、濾膜法等，近幾年來，我國在糞大腸菌群的監(jiān)測方面取得了很大進步，糞大腸菌群的相關環(huán)境標準也在不斷的更新。我國剛剛也出臺和變更了多管發(fā)酵法的新標準，酶底物法、多管發(fā)酵法等[1-2]。我國多用多管發(fā)酵法進行檢測。

1 方法

1.1 監(jiān)測方法[2]

根據(jù)水樣的污染程度，選擇樣品的接種量。將樣品加入在含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中（根據(jù)樣品濃度采取不同的培養(yǎng)試管或者三角燒瓶），在37±0.5℃培養(yǎng)箱里進行初發(fā)酵實驗，培養(yǎng)24小時。對于產(chǎn)酸產(chǎn)氣的試管進行復發(fā)酵驗證實驗，輕微振蕩試管，用接種環(huán)接種到裝有EC培養(yǎng)基的試管中，在44.5±0.5℃下進行復發(fā)酵培養(yǎng)24小時，最后得出產(chǎn)氣的細菌為糞大腸菌群。

1.2 執(zhí)行標準[3]

1.3 儀器和設備

（1）恒溫培養(yǎng)箱：37±0.5℃、44.5℃±0.5℃。

（2）高壓蒸汽滅菌器：121℃、101.3kPa。

（3）采樣瓶：500mL、250mL。

（4）移液管：1±0.01mL、10±0.1mL。

（5）試管：20mL、10mL

（6）接種環(huán)：直徑3mm。

1.4 試劑

EC培養(yǎng)基、單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基。

2 采樣

通過對南充市順慶區(qū)3條河流進行采樣。用水樣采集器采集表層水，每件樣品量為500mL，裝入已經(jīng)滅菌處理的采樣瓶中，采集6個平行樣，并4℃以下冷藏保存。采樣瓶需用牛皮紙包扎滅菌[4]。

3 分析與討論

3.1 空白實驗

每次試驗均用無菌生理鹽水按照步驟進行空白測定，培養(yǎng)后無任何顏色變化，測定結果均符合實驗要求。

3.2 陰陽性對照

將糞大腸菌群的標準菌株制成一定濃度的菌懸液，分別取相應水量的菌懸液按接種的要求接種于試管中，然后按實驗要求培養(yǎng)，陽性菌株（大腸埃希氏菌）呈陽性反應，陰性菌株（產(chǎn)氣腸桿菌）呈陰性反應，該測定結果符合實驗要求。

3.3 精密度檢驗

對三種濃度的水樣進行了6次重復測定，并計算其相對偏差、相對標準偏差，檢驗該方法的精密度。從測定的結果得出，樣品1的測定均值為34.50MPN/L，樣品1取對數(shù)為154MPN/L，相對標準偏差為2.47%;樣品2的測定均值為7616.67MPN/L，樣品2取對數(shù)為3.88MPN/L，相對標準偏差為5.22%;樣品3的測定均值為12666.67MPN/L，樣品3取對數(shù)為4.1MPN/L，相對標準偏差為0.93%。以上樣品的精密度結果均符合驗證要求具體測定結果見表2。

3.4 準確度分析

根據(jù)多管發(fā)酵法有證標準物質(zhì)/標準樣品測試數(shù)據(jù)，有證標準物質(zhì)所測標樣平均值為23MPN100m/L，有證標準物質(zhì)真值為21±7MPN/100mL，可接受范圍為6-121MPN/100mL，相對誤差REi為1.0%。根據(jù)《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法》（HJ347.2-2018）方法要求，準確度實驗驗證符合方法要求。

綜上所述，采用多管發(fā)酵法檢測水中的糞大腸菌群，對樣品進行空白對照、陰陽性對照、以及對精密度和準確度進行驗證，結果都在質(zhì)控范圍內(nèi)。實驗室按照以上要求可獲得準確的數(shù)據(jù)，滿足其方法要求。

4 不確定度分析

影響糞大腸菌群MPN值計算結果不確定度的因素有很多，例如：培養(yǎng)基稱量配制過程的誤差、取樣稀釋過程引起的誤差、樣品保存條件、購買培養(yǎng)基質(zhì)量的好壞、培養(yǎng)時間長短、培養(yǎng)溫度的控制等[5-7]。

5 注意事項

（1）樣品采集時，可加入適量硫代硫酸鈉消除活性氯的干擾;如果確定水樣重金屬離子含量高的，可加入乙二胺四乙酸二鈉溶液消除干擾;采集樣品時，堅持細菌樣優(yōu)先原則，盡可能直接采樣，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。

（2）樣品保存時，需要在10℃以下冷藏，6h內(nèi)完成測定。建議在采集細菌樣時，車上安裝車載冰箱或者其他冷藏設備，實時監(jiān)測樣品溫度。

（3）樣品測試時，在樣品濃度比較低，易出現(xiàn)陽性結果不明顯的發(fā)酵管，實驗員應將所有有可能的試管都進行復發(fā)酵;初發(fā)酵24小時后未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣，可以適當?shù)匮娱L培養(yǎng)時間[6];培養(yǎng)基分裝滅菌時，排盡發(fā)酵管內(nèi)倒管中的氣泡，否則會出現(xiàn)假陽性結果;吸取不同濃度的稀釋液時，必須規(guī)范操作，及時更換移液管。

（4）定期使用有證標準樣品進行質(zhì)量控制，使用有證標準菌株進行陰陽性對照試驗，用無菌水做全程序空白和實驗室空白測定。

（5）培養(yǎng)箱溫度的均勻性和穩(wěn)定性對多管發(fā)酵法的影響比較大，有條件最好放置精確的自動記錄溫度儀實時監(jiān)控培養(yǎng)箱溫度[8]。

6 優(yōu)缺點

目前出臺的糞大腸菌群的標準很多，各有優(yōu)缺點。多管發(fā)酵法有著原理簡單、技術難度容易、實驗準確度高、價格便宜、利于推廣的優(yōu)點，但操作步驟比較煩瑣、需要確認實驗、實驗周期相對比較長，檢測時間需要48～72小時，消耗大量人力、物力，不適于大批量樣品的分析[9]。

參考文獻：

[1]國家環(huán)境保護總局水和廢水監(jiān)測分析方法編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].第四版.北京：中國環(huán)境科學出版社，2003.

[2]國家生態(tài)環(huán)境部.水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法（HJ347.2-2018）[S].北京：中國標準出版社，2018.

[3]國家環(huán)境保護總局.地表水環(huán)境質(zhì)量標準（GB3838-2002）[M].中華人民共和國環(huán)境保護標準GB3838-2002.

[4]陳巧，李晉，李曉曼，袁姁.地表水采樣的質(zhì)量控制措施探討[J].科技創(chuàng)新與應用，2020，（25）：119-123.

[5]何敏，張亞娟，周艷紅，等.水中糞大腸菌群檢測方法的對比[J].凈水技術，2018（09）：27-30.

[6]魯朝旭，袁姁，陳巧，李曉曼，梁時軍.糞大腸菌群監(jiān)測分析中存在的問題探討[J].綠色科技，2019，（14）：178-181.

[7]張貴剛，黃博珠.糞大腸菌群多管發(fā)酵法不確定度的評定[J].資源節(jié)約與環(huán)保，2018（8）：37，48.

[8]黎堯，張紹斌.多管發(fā)酵法測定水質(zhì)糞大腸菌群的探討[J].環(huán)境與發(fā)展，2019（5）：116.

[9]趙長征.淺談水中糞大腸菌群檢測方法及其研究進展[J].華東科技（綜合），2019（8）：0479-0480.

作者簡介：鄧澤（1988— ），男，漢族，四川南充人，助理工程師，主要從事環(huán)境監(jiān)測分析與評價工作。

*通訊作者：袁姁（1995— ），女，漢族，重慶開州人，助理工程師，主要從事環(huán)境監(jiān)測分析與評價工作。