武夷菌素產(chǎn)品的創(chuàng)制與應(yīng)用

葛蓓孛，施李鳴，張 維，楊淼泠，呂朝陽(yáng)，張克誠(chéng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

關(guān) 鍵 字：武夷菌素；生物農(nóng)藥；高產(chǎn)菌株選育；田間應(yīng)用效果

化學(xué)農(nóng)藥在防治農(nóng)作物病蟲(chóng)害及保障糧食豐收方面發(fā)揮著重要的作用。但是，長(zhǎng)期及過(guò)量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且會(huì)造成農(nóng)產(chǎn)品殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等問(wèn)題。因此，加速推進(jìn)安全、高效且選擇性強(qiáng)的生物農(nóng)藥的研制和開(kāi)發(fā)勢(shì)在必行[1,2]。

武夷菌素是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所研制的一種具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型生物農(nóng)藥，具有低毒、高效、廣譜、環(huán)保等特點(diǎn)，主要用于防治農(nóng)作物真菌病害，對(duì)白粉病、灰霉病和黑星病等效果顯著。武夷菌素先后獲得“國(guó)家重點(diǎn)新產(chǎn)品”證書（2000G041B326001）和有機(jī)產(chǎn)品認(rèn)證（COFCC-R-0903-0070），被列入國(guó)家蔬菜病蟲(chóng)害安全防治技術(shù)規(guī)范國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（NY/T5006-2001）和農(nóng)業(yè)行業(yè)無(wú)公害蔬菜生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T5074-2002），成為我國(guó)無(wú)公害蔬菜和有機(jī)蔬菜生產(chǎn)中防治病害的重要生物殺菌劑產(chǎn)品之一，為綠色植保及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出了一定的貢獻(xiàn)[3]。

1 產(chǎn)品創(chuàng)制

1.1 產(chǎn)生菌及分類鑒定

武夷菌素（又稱BO-10），是1979年在福建省武夷山上采集的土壤樣品中依據(jù)微生物菌株代謝產(chǎn)物的抑菌活性、內(nèi)吸性等標(biāo)準(zhǔn)篩選到的武夷菌素原始菌種，根據(jù)菌株的形態(tài)特征和生理生化特點(diǎn)，進(jìn)行分類鑒定并命名為不吸水鏈霉菌武夷變種Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis[4]。后期經(jīng)過(guò)分子鑒定和全基因組測(cè)序比對(duì)將其更名為小白鏈霉菌武夷變種S.albulus var.wuyiensis[5]。

1.2 理化性質(zhì)及有效成分結(jié)構(gòu)鑒定

武夷菌素粗制品經(jīng)Sephadex-G-25柱層析、水洗脫等方法可制備成精制品，其中有兩種不同有效成分武夷菌素a和b，其中a成分的含量占86%左右，b成分的含量為13%左右[6]。武夷菌素精制品經(jīng)冷凍干燥后為微黃色的粉末，熔點(diǎn)為239 ℃，易吸濕、極易溶于水、微溶于甲醇、不溶于丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑。主效成分a通過(guò)紅外光譜、碳譜、氫譜分析，確定該組分的分子式C13H21N3O14，是一種含有胞苷骨架和過(guò)氧鍵的核苷類抗生素，經(jīng)專利局查新證明，該化合物是一種結(jié)構(gòu)全新、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型農(nóng)用抗生素[7]。此外，研究表明武夷菌素具有較強(qiáng)的抑菌活性，原因是其產(chǎn)生菌含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，已分離鑒定出的活性組分還包含納他霉素、豐加霉素、谷氏菌素、制霉菌素、ε-聚賴氨酸、苯甲酸、間苯二甲酸和黃酮類化合物等[8,9]。

1.3 作用機(jī)理

武夷菌素防治植物病原真菌的作用機(jī)制包括兩個(gè)方面，一方面武夷菌素直接抑制病原菌生長(zhǎng)以及分生孢子萌發(fā)。武夷菌素可使病原真菌分生孢子的萌發(fā)速度和產(chǎn)孢量顯著下降，且菌絲生長(zhǎng)變慢，分支增多、末端膨大、液泡數(shù)目增多；菌絲頂端出現(xiàn)原生質(zhì)滲漏的現(xiàn)象，而芽管膨大、縊縮，影響真菌的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的滲透性；干擾菌絲體蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的正常合成，從而起到抑菌的作用。另一方面，武夷菌素通過(guò)啟動(dòng)防御反應(yīng)的相關(guān)信號(hào)途徑，提高植物體內(nèi)防御相關(guān)酶（如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶）的活性，進(jìn)而提高植物自身的抗病性[9-11]。

1.4 毒性及安全性評(píng)價(jià)

武夷菌素的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果為L(zhǎng)D50＞10 g/kg體質(zhì)量，屬于相對(duì)無(wú)毒。蓄積毒性系數(shù)＞5，故無(wú)明顯蓄積性。武夷菌素對(duì)大鼠最大無(wú)作用劑量為5000 mg/kg，無(wú)致畸、致突變效應(yīng)。武夷菌素各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

武夷菌素對(duì)環(huán)境生物的毒性和安全性評(píng)估結(jié)果為，蜜蜂LD50（48 h）＞5000 mg/mL；家蠶LD50（2齡）＞3226 mg/kg；斑馬魚(yú)LD50（96 h）＞89.92 mg/mL；鵪鶉LD50（7 d）＞100 mg/kg根據(jù)國(guó)家農(nóng)藥對(duì)環(huán)境生物的毒性及風(fēng)險(xiǎn)性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，武夷菌素對(duì)蜂、蠶、鳥(niǎo)、魚(yú)均為低毒[6]。

1.5 產(chǎn)品登記

通過(guò)極性溶劑與穩(wěn)定劑篩選、多孔性載體吸附能力比較和助劑增效配伍等一系列技術(shù)措施，創(chuàng)制出1%水劑、2%水劑和3%可溶性粉劑武夷菌素系列產(chǎn)品（農(nóng)藥登記證號(hào)：LS981038、LS20083112。其中1%水劑獲得農(nóng)藥生產(chǎn)批準(zhǔn)證書，在中國(guó) 20多個(gè)省市（自治區(qū)）蔬菜、果樹(shù)等作物上應(yīng)用，推廣應(yīng)用超過(guò) 200萬(wàn)hm2。

2 高產(chǎn)菌株選育

2.1 傳統(tǒng)育種技術(shù)

開(kāi)展選育遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)優(yōu)良菌株是提高菌株單位效價(jià)，降低生產(chǎn)成本，提升武夷菌素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平和提高產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。前期，采用傳統(tǒng)的物理和化學(xué)誘變技術(shù)、原生質(zhì)體融合等育種方法，獲得了一系列在武夷菌素產(chǎn)量上比原始菌株有大幅提升的高產(chǎn)菌株。利用60Co-γ-射線和中子照射的M35和M46突變體作為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合，選擇營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記互補(bǔ)的穩(wěn)定的原養(yǎng)型重組子，獲得高產(chǎn)菌株F31-24，效價(jià)比出發(fā)菌株提高了約80%[6]。以L7為出發(fā)菌株，采用不同劑量（500 Gy、1000 Gy和1500 Gy）的60Coγ-射線進(jìn)行輻照誘變，成功選育遺傳穩(wěn)定性良好的菌株C-75，其效價(jià)較出發(fā)菌株提高34.4%。采用低能碳離子注入的方法，獲得高產(chǎn)菌株F64（菌種保藏號(hào)CGMCC No.1967），效價(jià)可提高到6643 μg/mL，是出發(fā)菌株的2.5～3倍，發(fā)酵時(shí)間可縮短5～10 h[3]。傳統(tǒng)育種雖能有效選育武夷菌素高產(chǎn)菌株，但存在隨機(jī)性大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、易回復(fù)突變甚至還可能引入不利突變，無(wú)法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定向選育。

2.2 分子育種技術(shù)

基因工程育種相比傳統(tǒng)育種具有專一性強(qiáng)、育種周期短、不易產(chǎn)生回復(fù)突變等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種的不足。近年來(lái)，已完成武夷菌素產(chǎn)生菌的全基因組測(cè)序，克隆武夷菌素生物合成基因簇，成功建立了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，解析武夷菌素生物合成途徑及其關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制[12]。研究表明，武夷菌素生物合成基因簇，包括22個(gè)結(jié)構(gòu)基因和6個(gè)調(diào)控基因。其中，通過(guò)增加正調(diào)控基因wysR基因的表達(dá)量，可顯著提高武夷菌素產(chǎn)量，發(fā)酵效價(jià)達(dá)到7215 μg/mL，較出發(fā)菌株提高26.5%[13]。由于微生物在次級(jí)代謝過(guò)程中往往受多個(gè)基因協(xié)調(diào)控制，單個(gè)基因的缺失可能會(huì)由其他基因在功能上進(jìn)行互補(bǔ)，因此單基因的遺傳操作具有一定的局限性。通常菌株體內(nèi)含有復(fù)雜的代謝系統(tǒng)，很多同類型基因簇對(duì)前體的利用是相同的，因此他們之間存在相互作用[3]。武夷菌素產(chǎn)生菌中含有谷氏菌素、豐加霉素、制霉菌素、納他霉素等其他活性成分。通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子kasO*p強(qiáng)啟動(dòng)cluster5谷氏菌素生物合成基因簇的轉(zhuǎn)運(yùn)基因gouM，獲得的菌株發(fā)酵液中武夷菌素產(chǎn)量較原始菌株提高了34.1%[14]。此外，通過(guò)敲除豐加霉素生物合成基因中影響武夷菌素產(chǎn)量的toyG和toyF基因，構(gòu)建的toyF基因缺失突變株和toyG基因缺失突變株武夷菌素產(chǎn)量較野生菌株分別提高了23.06%和18.28%[15]。

3 發(fā)酵及提取工藝

采用響應(yīng)面法優(yōu)化了菌株F64的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，利用菌株F64和優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，將有機(jī)碳源、有機(jī)氮源、速效碳源、無(wú)機(jī)氮源、無(wú)機(jī)鹽以及水和菌株F64加入到發(fā)酵罐中，在28 ℃條件下進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵。培養(yǎng)條件為：一級(jí)發(fā)酵時(shí)間30～36 h，二級(jí)發(fā)酵時(shí)間48～56 h，接種量5%，罐壓0.10 MPa，通氣量1:0.9，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min。采用高產(chǎn)菌株F64和優(yōu)化的培養(yǎng)基配方發(fā)酵生產(chǎn)武夷菌素，節(jié)約發(fā)酵成本20%～30%[16]。

武夷菌素濃縮提取通常采用傳統(tǒng)的薄膜蒸發(fā)法，但該方法會(huì)導(dǎo)致武夷菌素分解，收率僅為70%～80%。根據(jù)武夷菌素的結(jié)構(gòu)特征（分子量443），設(shè)計(jì)發(fā)明了一種以人工生物膜為材料的“三膜組合”的濃縮提取方法，其原理是精濾膜和超濾膜分別去除分子量大于1500和800的大分子化合物，納濾膜可截留分子量為 150～800的化合物，去除水分、無(wú)機(jī)鹽等小分子物質(zhì)?！叭そM合”法可在常溫下濃縮提取武夷菌素，收率高達(dá)95%，不破壞武夷菌素的活性，且降低能耗、工藝簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)低碳生產(chǎn)[17]。

4 田間推廣應(yīng)用效果

武夷菌素對(duì)蔬菜、果樹(shù)、糧食和經(jīng)濟(jì)作物真菌病害有很好的防效，如對(duì)白粉病、灰霉病、霜霉病、黑星病、枯萎病、流膠病、腐爛病等均有很高的防效，同時(shí)還具有一定的增產(chǎn)作用。

4.1 蔬菜病害的防治

武夷菌素對(duì)各種作物白粉病特別是黃瓜白粉病防效可達(dá)90%以上，防效與化學(xué)農(nóng)藥粉銹寧和百菌清相當(dāng)。利用武夷菌素防治番茄葉霉病的防效穩(wěn)定，能達(dá)到85%左右，防效超過(guò)化學(xué)農(nóng)藥速克靈和撲海因以及生物農(nóng)藥春雷霉素和多抗霉素。此外，武夷菌素對(duì)番茄灰霉病也具有較好的防治效果，其防效在 80%以上，好于化學(xué)農(nóng)藥速克靈，且武夷菌素和多抗霉素配合使用防效更佳[18,19]。

4.2 糧食作物病害的防治

利用武夷菌素防治大豆灰斑病防效可達(dá)到97.12%，同時(shí)，武夷菌素對(duì)大豆炭疽病、菌核病也具有良好的防效[20,21]。在四川蒲江進(jìn)行的田間試驗(yàn)表明，武夷菌素對(duì)小麥白粉病的防效達(dá)到84.7%，略低于25%粉銹寧90.7%的防效，且武夷菌素對(duì)小麥葉銹病也有一定防效。此外，武夷菌素在控制玉米紋枯病中具有重要的應(yīng)用潛力，其對(duì)玉米紋枯病生長(zhǎng)具有顯著的影響，菌落直徑減少 75%以上，菌絲致病力下降99%[22]。

4.3 經(jīng)濟(jì)作物病害的防治

武夷菌素防治花卉病害，特別是月季花白粉病，效果理想，在黑龍江省大慶市和深圳的田間試驗(yàn)中，防效在85%左右；防治蘆筍莖枯病效果明顯，防效在80%以上；對(duì)茶樹(shù)上的炭疽病、白星病、油菜菌核病、根腐病、白粉病等均有良好防效。利用武夷菌素防治西瓜枯萎病防效達(dá) 69.0%～85.7%，同時(shí)對(duì)西瓜炭疽病防效也較好。利用1%武夷菌素水劑200倍浸種24 h＋500倍噴根2次處理，能夠有效地控制棉花黃萎病的發(fā)生，防治效果達(dá)到83.33%，顯著好于多菌靈[3,23,24]。

4.4 果樹(shù)病害的防治

武夷菌素對(duì)柑橘流膠病、瘡痂病、潰瘍病防效可達(dá) 90%～100%，同時(shí)對(duì)柑橘炭疽病、腳腐病、煤污病、樹(shù)脂病也有很好的防效[3]。在老果園連續(xù)5年應(yīng)用生物農(nóng)藥武夷菌素防治蘋果腐爛病，其平均防效達(dá)86.2%，高出腐必治的防效 34%。它還是很好的防腐保鮮劑，對(duì)蘋果、桃、梨、枇杷、葡萄、獼猴桃、龍眼、荔枝等水果上的真菌性病害均有很好的防效。利用 2%武夷菌素水劑對(duì)新疆厚皮甜瓜白粉病進(jìn)行田間防效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其防效達(dá)到60.17%。此外，武夷菌素對(duì)草莓白粉病、灰霉病、葡萄白粉病、霜霉病、白腐病等也有良好防效[3,25-27]。

5 展望

經(jīng)過(guò)多年的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，武夷菌素已成為我國(guó)無(wú)公害蔬菜生產(chǎn)中防治真菌病害的重要生物農(nóng)藥產(chǎn)品之一。隨著全社會(huì)食品安全和環(huán)境安全意識(shí)的增強(qiáng)，武夷菌素作為一種高效、廣譜的生物農(nóng)藥，具有廣闊的發(fā)展前景。但在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中也存在許多問(wèn)題，如需要重新辦理正式登記、不斷提高菌株效價(jià)、優(yōu)化發(fā)酵工藝、研發(fā)更高效的提取工藝、創(chuàng)新武夷菌素產(chǎn)品新劑型及完善田間應(yīng)用技術(shù)等。

今后研究工作將主要集中在以下幾個(gè)方面：（1）加快推進(jìn)正式登記辦理。依據(jù)2017年修訂后的《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》相關(guān)要求，完善登記所需的毒理、殘留、代謝等技術(shù)報(bào)告，盡快完成正式登記，繼續(xù)為農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)做貢獻(xiàn)。（2）提高菌株效價(jià)及優(yōu)化發(fā)酵工藝?；趥鹘y(tǒng)育種，綜合利用基因工程和代謝工程技術(shù)，選育高產(chǎn)菌株，同時(shí)改進(jìn)發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)各種發(fā)酵技術(shù)參數(shù)優(yōu)化組合，從根本上降低武夷菌素的生產(chǎn)成本，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。（3）研發(fā)高效活性成分的提取技術(shù)?；诨钚猿煞值睦砘匦裕ㄟ^(guò)選擇合適的柱材，組合高效分離制備、濃縮凍干技術(shù)等，并結(jié)合高效液相色譜，不斷提高有效成分的含量，為研制武夷菌素產(chǎn)品新劑型奠定基礎(chǔ)。（4）創(chuàng)新武夷菌素產(chǎn)品的新劑型。武夷菌素產(chǎn)品多為水劑形式，存在運(yùn)輸及儲(chǔ)藏不便的缺點(diǎn)；武夷菌素粉劑產(chǎn)品中含有一定的糖分，儲(chǔ)存過(guò)程中容易潮解結(jié)塊。因此，需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)可濕性粉劑、顆粒劑、生物種衣劑、微膠囊劑等，提高儲(chǔ)存時(shí)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性，降低加工和儲(chǔ)運(yùn)成本，提高藥劑與作物黏附性，節(jié)約藥劑施用的人力成本等。（5）建立武夷菌素的配套應(yīng)用技術(shù)。針對(duì)不同作物和防治對(duì)象，開(kāi)展包括最佳施藥時(shí)期、施藥濃度、施藥間隔期及與其他生物防治產(chǎn)品配套使用的綜合防控技術(shù)，解決單一生物農(nóng)藥難以在作物生長(zhǎng)栽培周期防控多種病蟲(chóng)害的問(wèn)題。