新型冠狀病毒重組疫苗早期研發(fā)藥學(xué)關(guān)注要點(diǎn)

程速遠(yuǎn)，劉志磊，郭舒楊，任慧梅，梁爭論，胡忠玉，何鵬，李敏

1.國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100038；2.中國食品藥品檢定研究院，北京102629

目前，新型冠狀病毒（SARS-Cov-2）仍在全球大規(guī)模流行，由于其傳播速度快，發(fā)病率高，已對全球超過3 211 萬人產(chǎn)生影響，成為一個嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題［1-3］。多個國家或地區(qū)的企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)正在積極進(jìn)行新型冠狀病毒疫苗（簡稱新冠疫苗）的研發(fā)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，目前全球在研新冠疫苗超過160 個，已有10 種疫苗進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗階段，分別有2 種和21 種進(jìn)入臨床Ⅱ期和Ⅰ期試驗階段。國內(nèi)現(xiàn)有5 條技術(shù)路線的多種新冠疫苗也在同步快速推進(jìn)。

新冠重組疫苗通常采用CHO 細(xì)胞等表達(dá)的新冠病毒的S 蛋白表面受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（rece-ptorbinding domain，RBD）抗原，經(jīng)純化后，加入佐劑制成。本文就新冠重組疫苗質(zhì)量控制和技術(shù)評價要點(diǎn)進(jìn)行歸納，強(qiáng)調(diào)生產(chǎn)過程的一致性，并參考目前達(dá)成的階段性共識，闡述審評的關(guān)注和考量，以期為5 條技術(shù)路線之一的新冠重組疫苗藥學(xué)研發(fā)提供參考。

1 一般考慮

臨床試驗用樣品應(yīng)在符合GMP 的條件下生產(chǎn)。其藥物研發(fā)原則上應(yīng)遵循新冠疫苗系列技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）、《中國藥典》以及 WHO、ICH 等國際組織有關(guān)技術(shù)要求，并根據(jù)其作用機(jī)制、遞呈方式和免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)等核心要點(diǎn)，開展相關(guān)研究工作。

動物試驗表明，雖然SARS 候選疫苗誘導(dǎo)的中和抗體具有一定的保護(hù)作用，但由于細(xì)胞免疫在病毒和感染細(xì)胞的清除中起至關(guān)重要的作用，為實現(xiàn)長效保護(hù)機(jī)制，新冠疫苗設(shè)計需同時考慮體液免疫和細(xì)胞免疫［4］。此外，由于呼吸道和接觸是新冠病毒主要的傳播途徑，黏膜免疫在防止病毒感染中的作用也不容忽視。新冠病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包括4 部分：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。S 蛋白通過RBD 與細(xì)胞表面受體ACE2特異性結(jié)合后感染細(xì)胞，與S 蛋白或RBD 結(jié)合的中和抗體可通過阻遏新冠病毒與細(xì)胞的結(jié)合從而防止病毒感染；同時，S 蛋白還能有效刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，因此，S 蛋白或RBD 通常作為疫苗研發(fā)中最關(guān)鍵的目標(biāo)抗原。此外，N 蛋白和M 蛋白也被證明可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫反應(yīng)［5］。

1.1 目的基因和分子設(shè)計 建議目的基因選擇新冠病毒保護(hù)性抗原的基因序列，按照重組蛋白的技術(shù)要求構(gòu)建重組蛋白疫苗的生產(chǎn)用工程菌毒株。應(yīng)充分考慮目的蛋白與野生新冠病毒結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾上的一致性。新冠病毒的S 蛋白RBD 的幾個關(guān)鍵氨基酸殘基與ACE2 之間存在重要的相互作用，因此，新冠重組蛋白疫苗通常采用RBD 作為免疫原。根據(jù)目前的研究進(jìn)展，ACE2 被認(rèn)為是阻斷新冠病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞治療冠狀病毒感染的關(guān)鍵宿主靶點(diǎn)。

建議重點(diǎn)關(guān)注新冠病毒基因序列的來源、流行株的代表性，考慮所選目的基因?qū)Π踩裕廴鐚σ呙缈贵w依賴性增強(qiáng)（antibody dependent enhancement，ADE）效應(yīng)、肺部免疫病理反應(yīng)等的潛在影響］、免疫原性（如抗原表位分析、不同毒株之間的交叉保護(hù)作用等）、抗原表達(dá)（如天然多聚體 ／ VLP 形成等）以及病毒抗原完整性等方面的影響，可結(jié)合必要、適用的細(xì)胞水平病毒中和試驗、抗原譜或表位分析試驗開展研究。

由于天然的RBD 序列為糖基化修飾蛋白，建議盡量選擇哺乳動物細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞。翻譯后修飾通常影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，糖基化作為一種重要的翻譯后修飾形式，參與蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸、定位、受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種關(guān)鍵的生物學(xué)活性，且影響蛋白穩(wěn)定性、藥代動力學(xué)和免疫原性等。因此，糖蛋白功能的發(fā)揮，不僅依賴蛋白的正確表達(dá)及其高級結(jié)構(gòu)的形成，糖基化的正確修飾也具有同等重要的作用。因此，糖基化修飾既是完整的生物學(xué)活性所必須，也是生產(chǎn)工藝過程研究和質(zhì)控的重點(diǎn)［6］。由于大腸埃希菌是原核生物，表達(dá)的蛋白無糖基化修飾，生物學(xué)活性會受較大影響，應(yīng)慎重考慮采用大腸埃希菌作為宿主細(xì)胞。

2020 年3 月，美國佐治亞大學(xué)在Emerging Microbes & Infections 雜志上發(fā)表論文［7］：采用 293 細(xì)胞分別表達(dá)新冠病毒S 蛋白的S1 和S2 亞基，蛋白酶切后通過質(zhì)譜法進(jìn)行糖譜解析到22 個潛在N-糖基化位點(diǎn)，其中17 個有糖基化修飾，剩余5 個潛在N-糖基化位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)糖基化修飾。糖基化修飾主要為高甘露糖型和復(fù)合型，不存在雜合型。此外，還從S1 蛋白的 RBD 區(qū)域鑒定出 2 個 O-糖基化位點(diǎn)（O323 ／ O325）。另外，英國南安普頓大學(xué)和美國德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校在bioRxiv 發(fā)表論文［8］：采用293F 細(xì)胞重組蛋白表達(dá)新冠病毒S 蛋白，蛋白酶切后通過質(zhì)譜法鑒定出S 蛋白上22 個N-糖基化位點(diǎn)，其中18 個為保守位點(diǎn)，并采用冷凍電鏡在3D結(jié)構(gòu)繪制了S 蛋白三聚體糖蛋白圖譜，揭示了N-連接多糖是如何遮蔽S 蛋白表面不同區(qū)域的。考慮到受體結(jié)合位點(diǎn)的功能性限制和這些殘基的低突變率，作者猜測，可能病毒利用N-連接多糖來遮蔽最保守和易受攻擊的區(qū)域。中國四川大學(xué)華西醫(yī)院在bioRxiv 發(fā)表論文［9］：對市售新冠 S 蛋白（昆蟲細(xì)胞表達(dá)）和S1 蛋白（293 細(xì)胞表達(dá)）的位點(diǎn)特異性N-糖基化進(jìn)行特征分析，也是采用酶切后質(zhì)譜分析方法，昆蟲細(xì)胞表達(dá)的S 蛋白共鑒定出22 個N-糖基化位點(diǎn)，主要為高甘露糖型修飾，共含有38 種多糖；而293 細(xì)胞表達(dá)的S1 蛋白主要為復(fù)合型糖基化修飾，共含有140 種多糖。提示采用昆蟲細(xì)胞和293 細(xì)胞表達(dá)的S 蛋白，其糖鏈修飾類型和多糖組成差異較大。上述3 篇論文均通過質(zhì)譜法對體外重組表達(dá)的新冠病毒S 蛋白的糖基化位點(diǎn)和糖鏈類型進(jìn)行了全面分析，由于不同表達(dá)體系細(xì)胞的翻譯后修飾系統(tǒng)不同，導(dǎo)致表達(dá)的S 蛋白的糖基化水平和糖型種類有很大不同。而在上述3 篇論文中，同樣采用293 細(xì)胞表達(dá)的S 蛋白的糖基化修飾和多糖組成也存在明顯差異，表明重組S 蛋白的糖基化修飾具有多樣性和異質(zhì)性，應(yīng)引起新冠藥物及疫苗研發(fā)企業(yè)的重視。

基于目前的研究對新冠病毒的認(rèn)識尚不全面，建議研發(fā)者密切跟蹤新冠病毒結(jié)構(gòu)和活性方面的基礎(chǔ)研究，選擇合適的分子結(jié)構(gòu)作為抗原，關(guān)注糖基化修飾和高級結(jié)構(gòu)，以獲得較好的疫苗免疫效果。

1.2 臨床前及臨床期間工藝變更 藥學(xué)變更貫穿于藥品研發(fā)的各階段，特別是研發(fā)早期。開展臨床前藥理毒理研究及臨床試驗研究的樣品建議采用工藝代表性（生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)場地、生產(chǎn)規(guī)模、制劑處方、包材等）批次。建議在早期臨床階段，即建立與產(chǎn)品安全性相關(guān)的包括工藝參數(shù)和可接受標(biāo)準(zhǔn)的過程控制；為了積累產(chǎn)品及工藝知識，在早期應(yīng)建立盡可能多的過程控制指標(biāo)，為變更前后質(zhì)量可比性研究及可能出現(xiàn)問題的評價積累數(shù)據(jù)，待積累足夠數(shù)據(jù)并充分驗證后再考慮適度減少控制指標(biāo)。建議在關(guān)鍵臨床試驗階段采用與擬上市生產(chǎn)規(guī)模相當(dāng)?shù)纳a(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

臨床試驗期間常見的變更包括生產(chǎn)規(guī)模放大和工藝優(yōu)化等，為評估變更對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，應(yīng)開展充分的質(zhì)量可比性研究，包括但不限于結(jié)構(gòu)表征、批分析、穩(wěn)定性、可比性研究等。可比性研究應(yīng)進(jìn)行合理設(shè)計，包括納入可比性研究的批次、比對研究項目、可比性驗收標(biāo)準(zhǔn)等，還應(yīng)關(guān)注研發(fā)各階段代表性批次的留樣問題。如質(zhì)量可比性研究結(jié)果不能充分說明變更未產(chǎn)生不利影響，可能需要提供額外的非臨床研究、甚至臨床研究資料進(jìn)行橋接，如免疫原性比較和必要的安全性比較等。鑒于新冠疫苗的復(fù)雜性及目前認(rèn)知的有限性，對于臨床期間的重大變更，建議開展變更前后細(xì)胞免疫、體液免疫等全面的效力研究的比較分析。

2 藥學(xué)關(guān)注要點(diǎn)

2.1 生產(chǎn)用原材料 由于生物制品生產(chǎn)用原材料來源較復(fù)雜，存在引入外源因子的風(fēng)險，應(yīng)對生產(chǎn)用原材料進(jìn)行嚴(yán)格的來源分析和質(zhì)量控制。重組疫苗生產(chǎn)用原材料在此基礎(chǔ)上，尤其需關(guān)注生產(chǎn)過程中所用的動物源性材料，并評估其安全性風(fēng)險，包括引入外源因子的風(fēng)險。鼓勵采用符合各國藥典要求或已用于上市產(chǎn)品的原材料。

生產(chǎn)用原材料應(yīng)符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定或與國際通行要求一致。對于生產(chǎn)中所用的關(guān)鍵原材料，包括蛋白水解酶、親和抗體、化學(xué)修飾物等，若為外購產(chǎn)品，應(yīng)明確質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行嚴(yán)格的供應(yīng)商審計；若為自行生產(chǎn)，則應(yīng)在申報資料中提供生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性等研究內(nèi)容，并關(guān)注批間一致性。若使用一次性發(fā)酵袋／ 儲液袋、濾膜／濾器、層析柱填料等，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性評估，其質(zhì)量應(yīng)符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定，或與國際通行要求一致。

2.2 上游構(gòu)建和毒種庫建立 宿主細(xì)胞應(yīng)來源清晰、可溯源，應(yīng)提供生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的來源、可用于生產(chǎn)的研究資料或證明文件、歷史（包括建立細(xì)胞系、鑒定和傳代等）。應(yīng)進(jìn)行全面檢定，特別是生物學(xué)特性、核型分析、外源因子檢查、成瘤性和 ／ 或致瘤性檢查等，并提供相應(yīng)檢定結(jié)果。如使用已用于其他上市疫苗的細(xì)胞基質(zhì)，可簡化提供相應(yīng)的證明性材料或只提供承諾說明。

工程細(xì)胞株構(gòu)建過程應(yīng)清晰，需說明傳代、基因操作方式，克隆篩選及鑒定、檢定情況，構(gòu)建過程中應(yīng)篩選目的基因完全正確的細(xì)胞株，重組蛋白疫苗應(yīng)與主要流行毒株和 ／ 或假毒株在誘導(dǎo)中和抗體方面具有可比性。通常采用蛋白表達(dá)量高且穩(wěn)定性好的克隆作為疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞，建立三級細(xì)胞庫。應(yīng)說明各級細(xì)胞庫傳代方法、制備過程、建庫規(guī)模、限傳代次和儲存條件。應(yīng)明確主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫的代次，按照《中國藥典》規(guī)定進(jìn)行鑒別試驗、無菌檢查、遺傳穩(wěn)定性、抗原表達(dá)水平和免疫原性等檢定。提供各級細(xì)胞庫（包括生產(chǎn)終末細(xì)胞）的檢定報告，檢定項目包括外源因子檢測、鑒別試驗、特性和型別、感染性滴度、抗原性、免疫原性及保護(hù)性抗原的完整性等；主細(xì)胞庫還須進(jìn)行基因序列測定。細(xì)胞庫系統(tǒng)的建立、檢定等需滿足《中國藥典》要求。在應(yīng)急狀態(tài)下，至少建立一級生產(chǎn)用細(xì)胞并完成全面檢定；對于細(xì)胞庫免疫原性檢測項目可結(jié)合藥效學(xué)研究開展，建立初步的標(biāo)準(zhǔn)，在臨床期間逐步完善。

確定限定代次的研究資料；檢定項目除參考細(xì)胞庫檢定項目外，還需進(jìn)行基因測序考察，鼓勵采用先進(jìn)的技術(shù)方法對傳代過程中目標(biāo)成分基因序列及目的產(chǎn)物質(zhì)量特性進(jìn)行考察。在應(yīng)急狀態(tài)下，為鼓勵疫苗研發(fā)，該部分可采用模擬傳代方式開展相關(guān)研究，在適當(dāng)傳代代次進(jìn)行有代表性的試驗，應(yīng)能支持臨床樣品的生產(chǎn)。

2.3 生產(chǎn)工藝 臨床樣品制備工藝應(yīng)具備一定規(guī)模，具有一定的生產(chǎn)連續(xù)性和放大可行性。需提供初步的工藝確認(rèn)資料；提供工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)去除效果等初步研究資料。

應(yīng)提供生產(chǎn)工藝相關(guān)資料，包括工藝流程、關(guān)鍵步驟的工藝參數(shù)及控制范圍。為保證產(chǎn)品安全性，應(yīng)關(guān)注發(fā)酵培養(yǎng)中的污染控制情況及相關(guān)檢測結(jié)果，需提供初步的未處理收獲液或生產(chǎn)終末細(xì)胞外源因子檢定報告。申請人應(yīng)關(guān)注實際的病毒去除／滅活工藝，通常每個步驟的病毒清除能力應(yīng)至少由兩次獨(dú)立的研究加以重復(fù)驗證。應(yīng)明確病毒去除 ／滅活驗證過程中驗證樣品的具體參數(shù)，包括蛋白含量、pH、過濾壓力差、過濾量等，病毒去除 ／ 滅活驗證結(jié)果應(yīng)支持臨床使用批次的病毒安全性。

工藝研究可在平臺先驗工藝經(jīng)驗基礎(chǔ)上進(jìn)行，但需有本品的研究和驗證數(shù)據(jù)。如有研究簡化，需提供充分理由。

應(yīng)明確制劑處方中每種組分的作用及含量，提供佐劑、緩沖液、鹽濃度、pH 以及其他輔料的選擇依據(jù)；如使用特殊的抗原遞呈系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、聚合物微粒等，應(yīng)至少提供遞呈系統(tǒng)所用組分的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、遞呈系統(tǒng)組分含量的選擇依據(jù)等。應(yīng)通過不同制劑處方對抗原-佐劑 ／ 遞呈系統(tǒng)相互作用（如吸附率、包封率、包封粒徑等）、動物藥效學(xué)研究（免疫原性、保護(hù)力研究）、毒理研究、生產(chǎn)工藝可控性等方面的影響進(jìn)行篩選并確定初步的處方。

對于國內(nèi)外已上市產(chǎn)品中從未使用過的全新輔料，應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)申報。

應(yīng)提供輔料、佐劑來源及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)資料。應(yīng)急條件下，建議采用符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的輔料。研究資料（包括研究方法、研究結(jié)果和研究結(jié)論）應(yīng)說明制劑工藝關(guān)鍵步驟確定的合理性以及工藝參數(shù)控制范圍的合理性，包括主要工藝參數(shù)研究資料，生產(chǎn)工藝參數(shù)對產(chǎn)品質(zhì)量屬性的影響等研究資料。

如產(chǎn)品使用佐劑，應(yīng)按照原液申報格式提供原材料、生產(chǎn)、特性鑒定、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性的研究資料。

由于應(yīng)急狀態(tài)下對病原體知識積累有限，且研發(fā)早期批次和數(shù)據(jù)少，鼓勵盡量積累過程控制指標(biāo)相關(guān)的產(chǎn)品知識和工藝知識，為工藝放大或工藝優(yōu)化后的可比性研究及可能存在的問題奠定基礎(chǔ)。研發(fā)初期，應(yīng)至少提供可支持開展臨床試驗用疫苗的制備工藝控制要求，關(guān)注生產(chǎn)工藝的批間一致性。

2.4 質(zhì)量研究

應(yīng)對藥理毒理批次和 ／ 或臨床樣品批次等代表性批次樣品進(jìn)行全面的、與研究階段相適應(yīng)的特性分析和質(zhì)量研究。提供常規(guī)放行檢驗分析及采用先進(jìn)、靈敏的分析技術(shù)進(jìn)行的質(zhì)量研究和特性研究數(shù)據(jù)。

特性研究通常包括結(jié)構(gòu)確證、生物學(xué)活性（結(jié)合及中和活性）、免疫學(xué)特性、純度（分子大小及電荷異構(gòu)體）和雜質(zhì)（工藝及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)）、體內(nèi)外效力、免疫學(xué)特性等研究。研發(fā)早期階段，建議提交初步的結(jié)構(gòu)確證研究數(shù)據(jù)，可在上市申報時提交完整的結(jié)構(gòu)確證資料。疫苗的生物效價研究是反應(yīng)工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量的綜合指標(biāo)，建議盡早開展相關(guān)研究。

2.4.1 結(jié)構(gòu)表征分析 提供常規(guī)放行檢驗分析及采用先進(jìn)的分析技術(shù)進(jìn)行的質(zhì)量研究和特性分析研究數(shù)據(jù)。特性分析通常包括結(jié)構(gòu)特征、純度、雜質(zhì)分析（工藝相關(guān)雜質(zhì)及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)）、體內(nèi)外效力、免疫學(xué)特性等研究。除常規(guī)放行檢驗項目外，鼓勵對影響疫苗效力或安全性的其他結(jié)構(gòu)特征開展研究。糖基化可能影響免疫原性，鼓勵進(jìn)行相關(guān)研究，若不能排除糖基化對疫苗效力的影響，需在方法學(xué)研究到一定程度并積累數(shù)據(jù)后，將糖基化相關(guān)檢查納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

重組疫苗除參照重組治療用生物制品要求提供適用的相應(yīng)資料外，對于形成病毒樣顆粒的疫苗，還應(yīng)提供病毒樣顆粒關(guān)鍵結(jié)構(gòu)研究的相關(guān)資料。如是純化的抗原肽或具有保護(hù)性特點(diǎn)的表位肽，應(yīng)提供必要的正確性鑒定研究結(jié)果。

如涉及佐劑或新型抗原呈遞系統(tǒng)，應(yīng)結(jié)合其與抗原相互作用的結(jié)構(gòu)或特性開展必要的質(zhì)量研究，理化結(jié)構(gòu)特性如佐劑等電點(diǎn)、粒徑及其分布、與抗原的吸附鋁等；脂質(zhì)體包封率、粒徑等；生物學(xué)活性如佐劑或新的抗原遞呈系統(tǒng)對抗原的呈遞效果、降低佐劑或抗原毒性和／ 或增強(qiáng)抗原免疫反應(yīng)的相關(guān)研究等。

2.4.2 純度和雜質(zhì) 應(yīng)采用多種檢測方法（檢測原理不同）聯(lián)合檢測分析供試品純度，檢定結(jié)果應(yīng)不低于同類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。

雜質(zhì)指生產(chǎn)工藝、貯存、和／ 或用于保存原液的密封容器中產(chǎn)生的、和 ／ 或穩(wěn)定性研究批次中發(fā)現(xiàn)的潛在雜質(zhì)，包括工藝相關(guān)雜質(zhì)和疫苗的降解雜質(zhì)。對于早期臨床試驗申請，可根據(jù)來源、風(fēng)險及殘留量的安全性水平等，列出潛在的雜質(zhì)及當(dāng)前擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（建議結(jié)合毒理試驗結(jié)果、文獻(xiàn)資料、既往積累的認(rèn)知信息等綜合考慮）。對于開發(fā)后期臨床試驗，除了早期臨床試驗申請?zhí)峁┑男畔⒅?，還需進(jìn)一步進(jìn)行雜質(zhì)的分離、鑒別、對生物活性影響的分析，并關(guān)注檢測方法的方法學(xué)驗證?？紤]其在生產(chǎn)和貯存期間是否顯著增加及其與疫苗有效性的相關(guān)性，確定是否納入過程控制或放行標(biāo)準(zhǔn)；對于需納入質(zhì)控體系的項目應(yīng)隨研究的逐步推進(jìn)加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)要求，如通過工藝驗證可有效清除，可結(jié)合工藝進(jìn)行控制。

2.4.3 生物效價 與常規(guī)疫苗研發(fā)相似，重組疫苗也需進(jìn)行體內(nèi)效力、體外效力及動物保護(hù)的研究。

體內(nèi)效力試驗首選的方法為中和抗體檢測方法。此外，還可采用測定小鼠ED50的方法。應(yīng)選擇適宜的實驗動物品系，建立檢測動物血清中和抗體或總抗體的方法，包括中和試驗毒株、包被抗原、參比品的研究等。如有必要和可能，鼓勵建立抗體性質(zhì)的評價方法，如亞型測定、針對抗原中和位點(diǎn)的分析等。

體外效價檢測一般是對疫苗抗原含量的檢測，需建立疫苗抗原含量的檢測方法，包括制備檢測用參比品等，并進(jìn)行方法學(xué)驗證。動物保護(hù)性試驗是最理想的臨床前有效性評價及質(zhì)量控制手段之一，可結(jié)合藥效學(xué)研究開展。由于對病原體認(rèn)知有限及不同種類疫苗免疫機(jī)制不盡相同，鼓勵對細(xì)胞免疫水平的生物學(xué)活性開展相關(guān)研究。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中需納入針對新冠病毒的體內(nèi)效力指標(biāo)。如能建立有效的佐劑解離方法，建議在此基礎(chǔ)上建立抗原含量檢測作為體外效力測定方法。

2.4.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括檢查項目、檢查方法及標(biāo)準(zhǔn)限度，通常以列表形式提供。建議明確質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的擬定依據(jù)，包括是否符合我國或國際通用的有關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則、各國現(xiàn)行版藥典的要求等，說明設(shè)定各檢查項目和各項檢查方法選擇的考慮，根據(jù)臨床前藥理毒理批檢驗結(jié)果、初步的工藝知識、穩(wěn)定性等研究結(jié)果，評估質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度范圍設(shè)置的合理性。

重組新冠疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括鑒別、純度（兩種機(jī)理的方法）、雜質(zhì)、體內(nèi)效力等。

申報臨床時提供的方法學(xué)驗證資料應(yīng)能初步證實檢測方法的適用性，對重要指標(biāo)或關(guān)鍵質(zhì)量屬性（如保護(hù)效力、抗原量、免疫原性、滅活試驗等）的檢測方法，應(yīng)提供與研發(fā)階段的控制及重要性相符或適用的驗證資料；上市階段應(yīng)按照相關(guān)指導(dǎo)原則提供全面的方法學(xué)驗證資料。

應(yīng)提供建立的參考品或?qū)φ掌穪碓?、制備、檢定結(jié)果、標(biāo)定過程及穩(wěn)定性研究（定期復(fù)檢）等方面的初步研究資料。

2.4.5 參比品研究 應(yīng)積累不同研究階段參比品的詳細(xì)信息，包括但不限于批次來源、制備工藝、檢驗結(jié)果、標(biāo)定方法和結(jié)果、儲存條件和復(fù)驗期等，應(yīng)關(guān)注參比品的代表性及可溯源性。此外，為確保產(chǎn)品質(zhì)量的可溯源性，建議對關(guān)鍵質(zhì)量屬性生物活性和純度等的參比品開展全面研究。

2.5 初步穩(wěn)定性研究 通常穩(wěn)定性研究方案設(shè)計應(yīng)遵循生物制品穩(wěn)定性指導(dǎo)原則［10］。臨床申報階段應(yīng)提供能夠支持臨床試驗開展的穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)。應(yīng)關(guān)注關(guān)鍵項目的代表性圖譜、降解途徑和變化趨勢等。

應(yīng)急情況下，若考慮減少批次，需提供充分的支持依據(jù)。實驗條件及持續(xù)時間需能夠支持臨床試驗的開展，后續(xù)繼續(xù)完成本批次以及其他批次的穩(wěn)定性研究，進(jìn)行滾動提交穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)，若有異常，需及時上報。

建議將新冠疫苗的體內(nèi)效力指標(biāo)作為關(guān)鍵指標(biāo)納入穩(wěn)定性研究的考察指標(biāo)，待積累產(chǎn)品開發(fā)各階段的多批次數(shù)據(jù)后，再結(jié)合體內(nèi)效力的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)綜合考慮完善后續(xù)穩(wěn)定性研究。

2.6 包裝系統(tǒng)及包材相容性 應(yīng)明確包材來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等信息，鼓勵采用已批準(zhǔn)或已用于上市產(chǎn)品生產(chǎn)的包材、容器。

若涉及特殊給藥裝置，如無針注射器、霧化器、鼻噴裝置等，需提交相關(guān)研究資料。如有可替代或支持性的其他研究資料，應(yīng)提交說明。

對于使用霧化給藥或鼻噴給藥的品種，應(yīng)結(jié)合擬使用的給藥裝置，參照《中國藥典》吸入劑或鼻用制劑和噴霧劑各項規(guī)定開展研究，并提供相關(guān)研究資料，并進(jìn)行臨床使用中穩(wěn)定性等研究。

包裝容器的選擇，應(yīng)關(guān)注與藥品接觸的內(nèi)包材對藥品的保護(hù)性和相容性，如容器內(nèi)表面可吸附蛋白、膠塞可能產(chǎn)生微粒、玻璃包材會發(fā)生玻璃脫片等問題，可在臨床試驗期間按照相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)原則的要求規(guī)范開展完善的包材相容性研究。

2.7 制造和檢定記錄 應(yīng)提供確定用于臨床試驗的工藝、規(guī)模及生產(chǎn)線生產(chǎn)的樣品制造和檢定記錄。盡可能包括詳細(xì)的制備控制技術(shù)條件和參數(shù)，便于溯源、事后分析改進(jìn)、充實、完善相應(yīng)的控制要求。

原則上，申報臨床試驗應(yīng)提供能代表臨床樣品工藝的3 批產(chǎn)品的制造和檢定記錄，且批量需滿足臨床試驗需求。應(yīng)急情況下若考慮減少批次，需提供充分的支持依據(jù)，如已有早期數(shù)據(jù)或平臺先驗工藝經(jīng)驗支持的、關(guān)鍵參數(shù)控制基本明確、過程監(jiān)測數(shù)據(jù)較為充分、藥學(xué)可控度高等；并在開展早期臨床研究的同時，繼續(xù)按照常規(guī)注冊要求進(jìn)行多批次生產(chǎn)，以確認(rèn)工藝的穩(wěn)健性和可控程度。

2.8 采用非建庫或非單克隆細(xì)胞庫模式的考量 為加快臨床樣品研究，部分申報單位提出，采用瞬轉(zhuǎn)或非單克隆細(xì)胞池技術(shù)進(jìn)行藥理毒理和／ 或早期臨床樣品工藝開發(fā)研究。盡管采用瞬轉(zhuǎn)或非單克隆細(xì)胞池生產(chǎn)可適當(dāng)縮短工藝開發(fā)周期，但其帶來的不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的不確定性和變異性也需格外關(guān)注。建議根據(jù)疫情發(fā)展的急迫程度以及對產(chǎn)品工藝變化導(dǎo)致的影響產(chǎn)品質(zhì)量的控制能力，慎重考慮并制定早期工藝開發(fā)路線圖。原則上，建議采用經(jīng)篩選的單克隆細(xì)胞建庫生產(chǎn)臨床試驗樣品。

如擬采用瞬轉(zhuǎn)或非單克隆細(xì)胞池進(jìn)行IND 申報，需充分證明其建立的瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)、非單克隆細(xì)胞池能支持后續(xù)研發(fā)，并提供細(xì)胞庫的檢驗報告，確?？煞€(wěn)定轉(zhuǎn)染，且無內(nèi)、外源因子污染的風(fēng)險。

若采用瞬轉(zhuǎn)技術(shù)產(chǎn)品用于早期臨床，需提供足夠的工藝信息（至少覆蓋3 批樣品），以證明瞬轉(zhuǎn)技術(shù)的穩(wěn)健性及一致性；需提供至少3 批樣品的全面特性分析（如翻譯后修飾等）、質(zhì)量研究及穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)，并提供3 批樣品制造和檢定記錄，以證明瞬轉(zhuǎn)技術(shù)的產(chǎn)品質(zhì)量及穩(wěn)定性批間一致。應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注安全性相關(guān)的藥學(xué)研究，包括工藝相關(guān)物質(zhì)、產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)及遺傳毒性雜質(zhì)分析和控制，關(guān)注檢測方法的特異性、靈敏度等方法學(xué)驗證研究。

若采用非單克隆細(xì)胞池生產(chǎn)，需提供非單克隆細(xì)胞池支持臨床樣品生產(chǎn)的傳代穩(wěn)定性信息，代表性批次（藥理毒理批次、臨床樣品批次）的工藝信息、特性分析（如翻譯后修飾等）、質(zhì)量研究及穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)，以證明非單克隆細(xì)胞池傳代及生產(chǎn)的穩(wěn)健性及質(zhì)量一致性。

若采用瞬轉(zhuǎn)或非單克隆細(xì)胞池生產(chǎn)，后續(xù)研究還需評估瞬轉(zhuǎn)技術(shù)、非單克隆細(xì)胞池造成的產(chǎn)品質(zhì)量差異對藥學(xué)、非臨床研究以及臨床試驗的影響；應(yīng)證明非臨床研究用藥物與擬進(jìn)行臨床試驗用藥物的相關(guān)性，為后續(xù)臨床試驗提供安全性支持。如研究資料證明不足以支持產(chǎn)品安全性和批間一致性，將導(dǎo)致臨床研究的停滯［11］。

3 討 論

3.1 平臺知識 既往有關(guān)應(yīng)急疫苗研發(fā)或生產(chǎn)的平臺知識、工藝知識、產(chǎn)品知識等將有利于本次應(yīng)急產(chǎn)品研發(fā)的評價，鼓勵產(chǎn)品知識、工藝知識積累較多的平臺化產(chǎn)品與創(chuàng)新結(jié)合快速開發(fā)。根據(jù)研發(fā)疫苗的作用機(jī)制、遞呈方式和免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)等核心要點(diǎn)，對研發(fā)制備工藝中的關(guān)鍵步驟進(jìn)行研究，建立合理的過程控制、技術(shù)參數(shù)范圍及初步適用的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 臨床期間需進(jìn)一步完善的藥學(xué)研究 新冠疫苗的藥學(xué)研究針對重大公共衛(wèi)生緊急需求研發(fā)，其階段性、漸進(jìn)性的特點(diǎn)需提前統(tǒng)籌設(shè)計考慮，在符合基本的安全性、有效性及質(zhì)量可控性的前提下，新冠重組疫苗可有條件批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗。臨床試驗期間，可進(jìn)一步完善相關(guān)藥學(xué)研究，包括且不限于更全面的結(jié)構(gòu)確證、完善的方法學(xué)驗證、糖基化修飾及有關(guān)物質(zhì)對疫苗效力的影響、包材相容性、完善的穩(wěn)定性研究等。

4 小 結(jié)

新冠重組疫苗的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制可部分參照重組生物技術(shù)產(chǎn)品的技術(shù)指導(dǎo)原則，但由于新冠病毒屬新型病毒，高級結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾又較為復(fù)雜，建議研發(fā)機(jī)構(gòu)遵循質(zhì)量源于設(shè)計的原則，在分子及工藝設(shè)計科學(xué)合理的前提下，循序漸進(jìn)完成藥學(xué)部分的研發(fā)。在新冠疫苗的早期研發(fā)中，藥學(xué)研究作為非臨床研究及臨床研究的基礎(chǔ)，可為非臨床研究及臨床試驗的實施提供支持，早期藥學(xué)研究的科學(xué)規(guī)范可為臨床研究的順利開展奠定良好的基礎(chǔ)。