柑橘青霉病防治的研究進(jìn)展

徐明玉，杜春梅

（1黑龍江大學(xué)，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500 2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

0 引言

柑橘(Citrus reticulateBlanco)在在全世界的種植面積高達(dá)670萬hm2，是世界產(chǎn)量最高的水果。2015年，世界柑桔產(chǎn)量約為1.21億t，占水果總產(chǎn)量的20.0%[1]。中國柑橘的種植面積居世界第一，產(chǎn)量居世界第三，是中國南方主要的經(jīng)濟(jì)來源之一。中國的柑橘主要以鮮銷為主，但在柑橘采后的儲(chǔ)藏與運(yùn)輸過程中，容易發(fā)生霉變、腐爛，造成不可估計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失。柑橘青霉病是造成柑橘損失的主要采后病害之一，意大利青霉(Penicillium italicum)主要引起柑橘的藍(lán)霉病，指狀青霉(P.digitatum)主要引起柑橘的綠霉病，統(tǒng)稱為柑橘青霉病。目前，對(duì)柑橘青霉病的防治主要采用物理、化學(xué)和生物防治的方法，各種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。本文回顧了柑橘青霉病防治方法的研究進(jìn)展，以期能為制定高效、安全、方便、成本低的綜合治理策略提供參考依據(jù)。

1 物理防治

物理防治柑橘青霉病的主要優(yōu)點(diǎn)是在果實(shí)表面幾乎無殘留、對(duì)人體傷害小、對(duì)環(huán)境無污染等。主要采用熱、光、臭氧、冷藏、離子流處理等方法來抑制柑橘青霉病的發(fā)生和發(fā)展。但是往往效果有限、作用持久性不佳，有些處理還需要采用特殊裝置，成本過高。

1.1 熱處理

柑橘類水果的熱處理主要采用熱水浸泡和微波熱處理，Williams等首次發(fā)現(xiàn)柑橘在45℃熱水中浸泡42 min可以抑制意大利青霉與指狀青霉孢子萌發(fā)。近幾年，熱水浸泡方法得到進(jìn)一步改良。2016年Sui等[2]研究表明，在高于40℃低于60℃的條件下將柑橘進(jìn)行幾秒鐘的熱水浸泡處理，可以達(dá)到抑制病原體的效果。2020年Diana等[3]報(bào)道，微波熱處理可以有效地防止青霉病的發(fā)生，對(duì)果實(shí)的pH、顏色、總可溶性固形物(TSS)沒有影響，但是對(duì)柑橘的口感影響較大；而熱水浸泡處理對(duì)水果的pH、檸檬酸含量等沒有影響，能有效的抑制霉菌生長，但對(duì)柑橘的外觀造成了一定影響。因此，在采用熱處理時(shí)工藝時(shí)，需要充分的考慮對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響，以達(dá)到最佳的處理效果。

1.2 光處理

紫外光(UV)和藍(lán)光對(duì)柑橘青霉病菌具有抑制作用。2013年Cote等[4]發(fā)現(xiàn)用一定強(qiáng)度的UV-C照射，既可以抑制霉菌的生長，還能最大限度的保證果實(shí)的品質(zhì)。UV-C主要是通過誘導(dǎo)水果中過氧化氫酶和幾丁質(zhì)酶的積累來提高水果的抗病性。2015年Gündüz等[5]使用劑量為0.26 kJ/m2的UV-C處理柑橘，發(fā)現(xiàn)指狀青霉和意大利青霉的孢子數(shù)量顯著減少。2016年Yamaga等[6]和Ruiz等發(fā)現(xiàn)UV-B對(duì)柑橘表面青霉菌具有抗菌活性，Ruiz等在2019年證明利用UV-B輻射檸檬可以增加果實(shí)中黃酮總酚類化合物和類黃酮的含量，防止檸檬發(fā)生青霉病。Cerioni等[7]證明檸檬黃酮提取物對(duì)指狀青霉具有體外抗菌活性，而UV-B輻射處理的水果提取物的抗菌活性顯著增強(qiáng)。María等[8]證實(shí)LED藍(lán)光能控制采后柑桔果實(shí)青霉菌的生長，并且效力隨著照射時(shí)間的延長和光量子通量的增加而提高，老的菌絲體對(duì)藍(lán)光更敏感，高藍(lán)光量子通量[700 μmol/(m2·s)]照射可以完全抑制各種青霉菌孢子的萌發(fā)，且藍(lán)光對(duì)人體無害，更具有可行性。

1.3 臭氧處理

臭氧也可以控制柑橘青霉病。Harding等首次發(fā)現(xiàn)將柑橘類水果放置在敞開的箱子中暴露于2.14 mg/m3的臭氧下15天，柑橘青霉病得到了良好的控制。Palou等發(fā)現(xiàn)將感染指狀青霉和意大利青霉的柑橘暴露在0.3～1.0μL/L濃度的臭氧下，可以有效抑制兩種青霉的孢子萌發(fā)和菌絲生長。臭氧對(duì)青霉孢子萌發(fā)的抑制效果與臭氧和柑橘的接觸面積有關(guān)，在12.8℃，臭氧濃度為1.54 mg/m3的條件下，使用通氣的可回收塑料容器(returnable plastic containers，RPCs)可有效地抑制柑橘青霉病的孢子萌發(fā)[9-10]。2018年，García等[11]研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)使用60 mg/kg臭氧和間歇使用1.6 mg/kg臭氧可有效延遲腐爛和柑橘青霉病的發(fā)生，同時(shí)還降低了柑橘硬度和重量損失，此外還發(fā)現(xiàn)臭氧對(duì)水果品質(zhì)無害。

1.4 冷藏及離子流處理

有研究表明在10℃時(shí)意大利青霉的生長速率明顯高于指狀青霉，因此柑橘在3～5℃冷藏時(shí)，對(duì)意大利青霉和指狀青霉都有抑制作用。但冷藏只能延長或減緩病原體的發(fā)展，不能完全抑制病害的發(fā)生。2016年Liu等[12]設(shè)計(jì)了一種水-空氣微型空心陰極放電裝置用于滅活指狀青霉，抑制率為91%。但該方法操作成本過高，目前在經(jīng)濟(jì)上并不可行。

2 化學(xué)防治

化學(xué)防治是最常用的柑橘青霉病防治方法，具有防治效果快、目的性強(qiáng)、價(jià)格低廉、持久性長等優(yōu)點(diǎn)。通常采用單一藥劑防治或多種藥劑聯(lián)合防治。但是，有些藥劑容易造成殘留，危害人體和環(huán)境安全。

2.1 單一藥劑防治

2.1.1 苯類物質(zhì) 嘧霉胺(PYR)又稱甲基嘧啶胺、二甲嘧啶胺，是苯氨基嘧啶類殺菌劑，具有廣譜性。PYR殺菌機(jī)理獨(dú)特，通過抑制病菌纖維素酶、果膠酶等胞壁降解酶的分泌從而阻止病菌侵染，并殺死病菌，具有預(yù)防和治療作用。Smilanick等[13]發(fā)現(xiàn)0.2～0.4 mg/L的PYR可以抑制指狀青霉孢子萌發(fā)，在500 mg/L及以上濃度，柑橘青霉病的發(fā)生減少了90%以上，并且可用于控制對(duì)其他殺真菌劑已經(jīng)具有抗性的指狀青霉菌株。含有對(duì)羥基苯甲酸乙酯鈉(SEP)成分的可食用涂層可以降低柑橘類水果綠霉病的發(fā)生率。2013年P(guān)edro等[14]發(fā)現(xiàn)SEP對(duì)柑橘青霉病具有抑制作用并且在果實(shí)上殘留較少，還發(fā)現(xiàn)對(duì)羥苯甲酯鈉(SMP)對(duì)柑橘類水果的綠霉病和藍(lán)霉病均具有抗菌活性。2016年Montesinos等[15]分別用5種食品添加劑，脫氫乙酸、二碳酸二甲酯、乙二胺四乙酸、乙酸鈉和苯甲酸鈉(SB)，來控制人工接種意大利青霉和指狀青霉24h的柑橘霉變的發(fā)生，結(jié)果表明SB的控制效果最好。PYR、SEP、SMP、SB對(duì)環(huán)境低污染，低殘留，可用于替代傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑。

2.1.2 新型碳酸氫鉀制劑(Karma)近幾年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)有機(jī)和無機(jī)鹽對(duì)幾種水果的采后病害具有抑制作用[16-17]。Karma是一種新型的可溶性粉末碳酸鹽制劑，含有85%(w/w)的碳酸氫鉀和≤15%的十二烷基硫酸鈉和多庫酯鈉。從2008年起，Karma在瑞士銷售，主要應(yīng)用于治療水果和蔬菜的采后病害。Youssef等[18]證明0.35和0.25(w/v)濃度的Karma可以完全抑制青霉菌的生長，而且浸涂是最佳施用方式，病害發(fā)生抑制率可達(dá)79%。

2.1.3 霧化消毒劑 在柑橘包裝廠中通常采用甲醛霧氣熏蒸來控制指狀青霉分生孢子的萌發(fā)，但甲醛會(huì)對(duì)環(huán)境和人體造成巨大的傷害。2014年Smilanick等[19]證明戊二醛(0.1 g/m3)、過氧化氫(4.4 g/m3)、檸檬三醇(1.0 g/m3)、乙酸(5.3 g/m3)、過氧乙酸(2.4 g/m3)熏蒸24 h后，均能抑制95%以上指狀青霉分生孢子的萌發(fā)，效果與甲醛相當(dāng)?？梢杂米龈涕侔b廠中甲醛的替代品。

2.2 聯(lián)合防治

多種藥劑聯(lián)合使用可以明顯改善單一藥劑作用不全面的問題，使藥效持久性增加、殘留量降低、防治效果明顯提高。山梨酸鉀是一種具有廣譜殺菌性的食品防腐劑，但是單獨(dú)施用于柑橘水果時(shí)，防效不明顯且易殘留。D'Aquino等[20]選用山梨酸鉀與噻苯唑在53℃聯(lián)合施用于柑橘水果，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用對(duì)指狀青霉菌的治療效果顯著提高，且明顯減少了柑橘表面殘留物的量。由于在20世紀(jì)70年代后大量應(yīng)用苯并咪唑類內(nèi)吸性殺菌劑，如抑霉唑等，使綠霉病菌對(duì)此類藥劑產(chǎn)生了抗性。而以較低濃度的抑霉唑與茶皂素按比例施用于柑橘水果可以更好地控制青霉菌，延緩抗性菌株的產(chǎn)生[21]。

3 生物防治

生物防治具有較高的安全性，有可能逐漸替代傳統(tǒng)化學(xué)防治劑，但是目前的生物防治劑還有一些亟待解決的問題，如防效的穩(wěn)定性、高效性還不如化學(xué)農(nóng)藥。柑橘青霉病的生物防治劑主要來源于植物提取物和微生物。

3.1 植物提取物

3.1.1 植物精油 植物精油可有效地治理柑橘青霉病，由于具有易揮發(fā)、可生物降解、無害、甚至可食用等優(yōu)點(diǎn)，更易被消費(fèi)者接受[22]。近年來，環(huán)保型精油(Eos)大面積應(yīng)用為天然食品防腐劑。其中，香茅、月桂葉、檸檬草和肉桂的精油均表現(xiàn)出對(duì)水果采后真菌病原體的抑制活性。

來自于柑橘的精油對(duì)指狀青霉和意大利青霉具有較強(qiáng)的抑制作用[23]。2014年，Tao等[24]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了柑橘精油的化學(xué)成分，將對(duì)意大利青霉的抗菌活性歸因于香茅醇、辛醛等，而對(duì)指狀青霉的抗菌活性歸因于檸檬烯、檸檬醛等。辛醛能明顯改變指狀青霉和意大利青霉菌絲的形態(tài)，破壞膜通透性，引起細(xì)胞質(zhì)損失。能誘導(dǎo)柑橘中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性，提高其抗病性[25]。檸檬醛可以抑制意大利青霉和指狀青霉分生孢子的生長，可以有效控制柑橘青霉病的發(fā)生，利用檸檬醛熏蒸可以延緩柑橘變質(zhì)，延長儲(chǔ)存時(shí)間[26]。

將精油微乳化或與蠟混用可有效防治柑橘青霉病。丁香精油(CEO)能抑制意大利青霉和指狀青霉的生長和分生孢子的產(chǎn)生[27]，2016年He等[28]發(fā)現(xiàn)微乳化能使CEO的抑真菌活性增強(qiáng)，施用微乳化的CEO能使柑橘的腐爛發(fā)生率比純精油處理的降低了34.51%。反式肉桂醛(CA)是肉桂油的主要成分，抗真菌活性強(qiáng)，但高揮發(fā)性限制了其應(yīng)用，段等將CA與蠟結(jié)合對(duì)柑橘水果進(jìn)行處理，可以顯著降低由指狀青霉引起的柑橘果實(shí)采后腐爛的發(fā)生率，提高了柑橘果實(shí)抗氧化酶和防御酶的活性，以及總酚和類胡蘿卜素的含量[29]。Fan等[30]發(fā)現(xiàn)在25±2℃條件下，用蠟+檸檬醛處理可顯著降低貯藏6天后指狀青霉的發(fā)生率，維生素C的含量和抗氧化酶的活性顯著增加。

3.1.2 大蒜和龍葵提取物 早在1988年Garcia等就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大蒜蒜瓣提取物具有一定的抗真菌活性。最近，Obagwu等[31]研究表明大蒜蒜瓣的乙醇提取物和水提物對(duì)指狀青霉和意大利青霉有控制作用，處理過的水果在10±1℃和90%～95%的相對(duì)濕度下可存儲(chǔ)30天，且乙醇提取物效果優(yōu)于水提物，大蒜提取物與植物食用油混合后的抗菌活性顯著增加，與化學(xué)殺菌劑（抑霉唑）效果相當(dāng)。除此之外，Musto等[32]研究發(fā)現(xiàn)龍葵葉片粗提物具有預(yù)防性抗青霉菌作用，且在4℃下保存60天，體外抗真菌活性不變。

3.2 微生物

3.2.1 細(xì)菌 用于柑橘青霉病防治的細(xì)菌種類較多，主要分布在芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳桿菌屬(Lactobacillus)以及沙雷氏菌屬(Serratia)。

早在1992年就已經(jīng)有報(bào)道表明芽孢桿菌屬可用于防治柑橘青霉病。黃勇等人證明短小芽孢桿菌(B.pumilus)可以顯著抑制柑橘表面指狀青霉的生長，且防治效果與抑霉唑效果相當(dāng)，明顯優(yōu)于苯菌靈，并且較低濃度也可顯著抑制指狀青霉的生長。2008年Leelasuphakul等[33]發(fā)現(xiàn)9個(gè)芽孢桿菌土壤分離株的培養(yǎng)上清液對(duì)指狀青霉生長均顯示出80%的抑制作用，其中枯草芽孢桿菌155抑制效果最好。2011年劉等采用研磨液培養(yǎng)法從橘皮中分離到26株內(nèi)生細(xì)菌，從中發(fā)現(xiàn)1株枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的拮抗作用最明顯，抑菌圈達(dá)到了15.3 mm。2013年Tu等[34]從金桔果實(shí)表面分離出類芽孢桿菌(Paenibacillus brasilensis)YS-1，用YS-1的無細(xì)胞濾液和細(xì)胞懸液處理能使柑橘青霉病發(fā)生率均低于45%，病灶直徑均在10mm以下。采前處理與采后處理相結(jié)合，YS-1發(fā)酵液可顯著降低南豐柑的腐爛率[35]。

2011年，Demirci等[36]從柑橘表面分離到176株熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，其中有40株熒光假單胞菌分離物能阻止柑橘表面青霉病斑的發(fā)展。2017年Tremonte等[37]報(bào)道了乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)對(duì)不同真菌菌株的抑制能力。Gerez等[38]從33株LAB菌株中分離出8株對(duì)指狀青霉具有抗真菌活性的菌株。Kamensky等[39]從甜瓜根周圍的土壤中分離得到抗真菌病害的沙雷氏菌S.plymuthicaIC14，可顯著抑制指狀青霉的分生孢子萌發(fā)。不同的沙雷氏菌菌株抑菌作用機(jī)理不完全相同，S.plymuthicaIC14的抑制作用似乎取決于直接的相互作用，而爭奪養(yǎng)分則似乎是S.plymuthicaIC1270菌株的主要作用方式。

3.2.2 真菌 應(yīng)用于柑橘青霉生物防治的真菌主要是酵母。酵母能夠在受傷的組織中定殖并快速生長，對(duì)營養(yǎng)要求簡單，還能夠在干燥的表面上長期生存，這些特點(diǎn)賦予了酵母作為生物防治劑的特殊優(yōu)勢[40]。

早在1989年Wilson等就已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證明漢森酵母(Debaryomyces hansenii)對(duì)植物無致病性，并且可以在不產(chǎn)生抗生素的情況下控制柑橘指狀青霉的生長，由此發(fā)現(xiàn)了酵母菌對(duì)柑橘青霉病生物防治所具有的商業(yè)價(jià)值。

某些酵母能在柑橘表面形成酵母拮抗劑，大部分酵母拮抗劑都可以抑制柑橘青霉的生長。2005年Long等[41]發(fā)現(xiàn)，檸檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)34-9菌株濃度為3×108cfu/mL時(shí)可以完全控制3×105個(gè)孢子/mL的意大利青霉的生長，柑橘果實(shí)創(chuàng)傷部位的酵母菌數(shù)量可以增加40倍，并對(duì)柑橘果實(shí)無致病性。2010年Abraham等[42]從番木瓜和柑橘果實(shí)表面分離到60株酵母菌，其中2個(gè)酵母分離物（B13和Grape）可以有效預(yù)防65%柑橘水果的腐爛。2012年P(guān)latania等[43]發(fā)現(xiàn)在酸化培養(yǎng)基上生長的殺滅性釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和柳條孢酵母(Wickerhamomyces anomalus)對(duì)指狀青霉均有抑制作用，并且柳條孢菌菌株BS 91和BS 92可使病害程度分別降低至1%和4%，果實(shí)存放時(shí)間可延長至10天。漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)可有效控制柑橘果實(shí)中的真菌病原體[44]，D.hansenii菌株DhhBCS03、DhhBCS05、DhhBCS06、LL1和LL2在室溫下，中劑量(1×106cell/mL)和高劑量(1×108cell/mL)均可以有效降低果實(shí)中指狀青霉感染的嚴(yán)重程度，防治效果與抑霉唑相當(dāng)，高劑量可以更好地延長水果冷藏時(shí)間。紅冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)可以誘導(dǎo)柑橘類水果對(duì)指狀青霉的抗病性，防御相關(guān)酶的活性顯著增強(qiáng)，在人工接種指狀青霉前48～72 h施用紅冬孢酵母，柑橘類水果的發(fā)病率和病害嚴(yán)重程度顯著降低，1×108和1×109cell/mL濃度處理可使指狀青霉感染率分別降低49.6%和52.5%[45]。Liu等[46]從中國重慶橘園分離到8個(gè)種屬71株拮抗酵母菌，有45個(gè)分離株對(duì)指狀青霉有拮抗活性，其中的梅奇酵母(Metschnikowia zizyphicola)FL02可完全抑制指狀青霉的生長。2018年，Cunha等[47]對(duì)從土壤、葉片、花卉和柑橘果實(shí)中分離到的6株抗意大利青霉菌的有效酵母進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)6株酵母菌對(duì)病原菌的菌絲生長抑制率均高達(dá)90%，效果最好的菌株是釀酒酵母(S.cerevisiae)ACBL-11和ACBL-14。Perez等[48]在2018年發(fā)現(xiàn)使用殺手酵母(killer yeasts)可以作為檸檬收獲后真菌疾病的生物防治劑，隨后在2019年發(fā)現(xiàn)殺傷性葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)146具有在檸檬中定殖傷口并在低溫和室溫下繼續(xù)生長的能力，可以抑制指狀青霉的孢子萌發(fā)，在25℃下在天然蠟中可以生存7天，在8℃下可以生存40天，是一種具有廣泛市場應(yīng)用前景的殺手酵母[49]。

3.2.3 抗菌肽 殼聚糖寡糖和抗菌肽(AMPs)對(duì)柑橘青霉病有防治效果[50]。AMPs是基因編碼的核糖體合成的多肽，廣泛存在于許多生物中。盡管AMPs的長度、序列和結(jié)構(gòu)不同，但大多數(shù)都是陽離子性和兩親性的。由于對(duì)微生物的作用時(shí)間短并且對(duì)哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞的毒性低，AMPs將是抗生素和殺真菌劑的優(yōu)良替代品?？咕腗SI-99已被證明可有效控制水果病害。PAF26（氨基酸序列RKKWFW)是一種人工設(shè)計(jì)的六肽，其序列與其他天然和人工合成的AMPs相似，能有效控制柑橘果實(shí)上的綠霉病。PAF56（氨基酸序列GHRKKWFW）是從PAF26衍生而來的短陽離子抗菌肽，在N端有一個(gè)甘氨酸和一個(gè)組氨酸殘基的延伸，對(duì)某些絲狀植物病原體具有抗菌活性。2018年Wang等[51]證明PAF56對(duì)指狀青霉、意大利青霉和白地霉(Geotrichum candidum)引起的果實(shí)綠霉、藍(lán)霉和酸腐病均有防治效果，為PAF56的商業(yè)應(yīng)用提供了有價(jià)值的信息。

4 展望

目前對(duì)柑橘青霉病主要采用的還是化學(xué)防治方法，雖然化學(xué)方法可以很快地抑制病原體發(fā)展，但會(huì)造成一些副作用。如藥劑在果實(shí)上殘留會(huì)對(duì)人體健康甚至生態(tài)環(huán)境造成危害，而且容易使病原菌產(chǎn)生抗性。物理方法主要對(duì)柑橘表面的病害有效果，且效果不如化學(xué)方法，有時(shí)需要特殊的設(shè)備。使用生物方法防治柑橘青霉病安全性好，但是在商業(yè)化和工業(yè)化應(yīng)用上，還存在一些亟待解決的問題，如成本高，見效慢等。因此，對(duì)柑橘類果實(shí)儲(chǔ)藏期病害進(jìn)行高效安全的綜合治理還存在一定的難度。為了進(jìn)一步有效的控制柑橘青霉病的發(fā)生，今后可從以下幾個(gè)方面開展后續(xù)研究：（1）進(jìn)一步探究柑橘青霉病菌對(duì)柑橘果實(shí)的致病機(jī)制，為預(yù)防柑橘青霉病的發(fā)生和阻斷其發(fā)展提供新的靶點(diǎn)；（2）深入研究生物源制劑對(duì)柑橘青霉病的防控機(jī)理，為推進(jìn)生物防治策略的應(yīng)用進(jìn)程提供有效依據(jù)；（3）積極探索生物防治方法與化學(xué)或物理防治方法聯(lián)用的防治效果，為建立良好的綜合防治管理策略和最大化提高防控效果奠定基礎(chǔ)。