骨橋蛋白在缺血性腦卒中發(fā)病中腦保護(hù)作用機(jī)制的研究進(jìn)展

郭 群，任曉玉，張 琦，聶木蘭，徐 璐，龍倩梅，郭一凡，王 東，劉 斌，何 瑋，金銀川

（1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺264000；2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州256600；3.第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安710000）

缺血性腦卒中是全球范圍內(nèi)居民死亡、致殘的重要原因［1］，目前針對缺血性腦卒中的主要治療方法是通過靜脈溶栓恢復(fù)大腦血流［2］，但是這類治療方法有嚴(yán)格的時(shí)間窗，僅有一部分患者能夠在嚴(yán)格的時(shí)間窗內(nèi)接受溶栓治療［3］，并且溶栓治療還可能帶來再灌注損傷等問題［4］，因此通過藥物或生物活性物質(zhì)來保護(hù)缺血性腦卒中后的大腦尤為重要，但是目前各種神經(jīng)保護(hù)藥物或者生物活性物質(zhì)的探索與運(yùn)用仍然不足。近年來，骨橋蛋白在缺血性腦卒中發(fā)病中的神經(jīng)保護(hù)作用逐漸引起了關(guān)注，本文綜述了近年關(guān)于骨橋蛋白在缺血性腦卒中發(fā)病中腦保護(hù)作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展，希望促進(jìn)對于骨橋蛋白腦保護(hù)作用及機(jī)制的研究，盡早闡明其作用機(jī)制及治療運(yùn)用方法，豐富針對缺血性腦卒中的腦保護(hù)藥物或生物活性物質(zhì)的選擇，最終降低缺血性腦卒中的致死率、致殘率。

1 概述

缺血性腦卒中是腦卒中最常見的類型［5］，是指各種腦血管病變所致腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致的局部腦組織缺血、缺氧性急性壞死，而迅速出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征［6］，主要損傷機(jī)制為在神經(jīng)組織急性缺血缺氧的基礎(chǔ)上繼發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞、免疫系統(tǒng)平衡失調(diào)等一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致永久性局部神經(jīng)組織壞死和神經(jīng)功能缺損［7‐11］。骨橋蛋白（OPN）由分泌型磷蛋白‐1 基因表達(dá)［12］，是一種由314 個(gè)氨基酸組成的磷酸化糖蛋白，在肺、心、腦、骨等多種組織中表達(dá)［13］，同時(shí)在阿爾茨海默病、帕金森病、癲癇、腦卒中等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。OPN 含有一個(gè)RGD（精氨酸‐甘氨酸‐天冬氨酸）結(jié)合域、一個(gè)凝血酶切割位點(diǎn)、一個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)、兩個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)，其中OPN 主要通過RGD 序列結(jié)合αvβ3、αvβ5 等整合素與神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞相互作用，發(fā)揮保護(hù)、調(diào)節(jié)炎癥、促細(xì)胞遷移等功效［14］，而凝血酶切割后則會(huì)暴露一個(gè)SVVYGLR 序列［15］，該序列可介導(dǎo)與α9β1，α4β1 和α4β7 整合素及CD44 受體的相互作用［16］，該序列的探索相對較少。

2 OPN 在缺血性腦卒中發(fā)病中腦保護(hù)作用機(jī)制的研究進(jìn)展

目前針對缺血性腦卒中腦保護(hù)的策略主要從抗炎、促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增值、促血管新生、保護(hù)血腦屏障等角度切入，既往研究顯示，在缺血性腦卒中發(fā)生后的3～24 h 內(nèi)，骨橋蛋白在梗死核心和梗死周圍區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中被誘導(dǎo)，并在第7天達(dá)到高峰，通過促使小膠質(zhì)細(xì)胞極化向保護(hù)性M2 表型轉(zhuǎn)變、減輕神經(jīng)炎癥、血運(yùn)重建、誘導(dǎo)可塑性等途徑影響腦梗死體積、急性期神經(jīng)功能狀態(tài)和遠(yuǎn)期預(yù)后［17，18］，也有研究認(rèn)為，相對于炎癥因子等，骨橋蛋白的表達(dá)較晚，可能在形成新屏障等組織重塑中作用更為明顯［19］。

2.1 抗炎

缺血性腦卒中發(fā)生后，由于缺氧、缺血等損傷導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境改變，致使小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)，這些細(xì)胞活化后釋放各種炎性細(xì)胞因子，比如白細(xì)胞介素‐6（IL‐6）、組織壞死因子‐α（TNF‐α）等，這些炎性細(xì)胞因子除了本身的細(xì)胞毒性以外，還誘導(dǎo)選擇素等黏附分子的表達(dá)，而黏附分子則誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移、聚集，導(dǎo)致血栓形成加快，并且聚集而來的白細(xì)胞可以釋放更多的炎性介質(zhì)，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），進(jìn)一步加重腦血流阻塞并促進(jìn)血腦屏障（BBB）的損傷；隨著BBB 的損傷，外周循環(huán)中的單核/巨噬細(xì)胞可募集到缺血腦組織中，其中的MMP2、MMP9 以及氧自由基（ROS）等細(xì)胞毒性物質(zhì)都會(huì)進(jìn)一步繼續(xù)損害血腦屏障，最終導(dǎo)致外周的白細(xì)胞大量浸潤腦實(shí)質(zhì)伴隨更大量的炎癥介質(zhì)釋放，整個(gè)過程呈級聯(lián)式不斷加重腦損傷［20，21］。因此，炎癥是缺血性腦卒中的重要病理生理環(huán)節(jié)，并與缺血性腦卒中的遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān)［22］?，F(xiàn)在也有一些抗炎藥物的研究，比如阻斷細(xì)胞因子的IL‐1 阻斷劑（戊硫氧嘧啶）、TNF‐α 阻斷劑、神經(jīng)肽類等，但是均效 果 欠 佳［23，24］。骨 橋 蛋 白 的 早 期 研 究 中，Meller等［25］給予缺血性腦卒中大鼠外源性O(shè)PN，發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血的面積減少，并可能是通過整合素受體發(fā)揮作用，Jin 等［26］在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)含有RGD 序列的OPN 具有良好的減輕缺血性腦卒中梗死面積的作用，并且缺血半球中TNF‐α、IL‐1β 等炎性物質(zhì)被顯著抑制，而當(dāng)在RGD 序列組加入抗αvβ3 抗體或者使用RGD 變異序列時(shí)，上述抗炎作用則明顯消退。這些結(jié)果表明，含有RGD 的OPN 通過αvβ3 整合素發(fā)揮抗炎作用。但是，Chung 等［27］發(fā)現(xiàn)，大腦在缺血性腦卒中后的第4～8 周會(huì)迎來第2 次的炎癥爆發(fā)，而在這個(gè)過程中，OPN‐/‐小鼠（OPN 基因敲除的小鼠）的梗死區(qū)域中MMP 等相關(guān)炎癥因子的表達(dá)反而顯著降低，并且繼發(fā)性神經(jīng)減退的程度也較低，具體表現(xiàn)為梗塞區(qū)域神經(jīng)元保留較多、運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)更快等。其原因可能為腦梗死區(qū)域吞噬細(xì)胞不能有效清除富含膽固醇的髓鞘碎片造成大量膽固醇晶體存在進(jìn)而導(dǎo)致OPN 表達(dá)升高持續(xù)促進(jìn)慢性炎癥所致，但是具體的機(jī)制仍未闡明。所以，對于骨橋蛋白的抗炎作用及機(jī)制尤其是作用時(shí)效仍需進(jìn)一步研究。

2.2 促小膠質(zhì)細(xì)胞遷移與運(yùn)動(dòng)

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞在免疫和炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。雖然生理?xiàng)l件下大多數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞保持靜息狀態(tài)，但是即使是微小的病理刺激，小膠質(zhì)細(xì)胞也會(huì)被迅速激活，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷后最早反應(yīng)的細(xì)胞。激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞涉及增殖、遷移至損傷部位、免疫調(diào)節(jié)劑表達(dá)增加以及轉(zhuǎn)化為吞噬細(xì)胞等，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞也通過釋放細(xì)胞因子、一氧化氮（NO）和ROS 等促炎性因子介導(dǎo)神經(jīng)元的損傷［28，29］。因此小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮雙重作用，即促炎型（M1）和 抗 炎 型（M2），M1 傾 向 于 釋 放TNF‐α、iNOS、IL‐1β 等破壞性介質(zhì)；M2 產(chǎn)生有益的介質(zhì)，如IL‐4、轉(zhuǎn)化生長因子‐β（TGF‐β）等［30］。因此，促使小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖及向M2 型的轉(zhuǎn)化極為重要。以往的研究一般使用姜黃素、丹皮酚、miRNA124 等來促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化［29，31，32］，但均效果欠佳。隨著研究的進(jìn)一步深入，Ladwig 等［33］發(fā)現(xiàn)在缺血性腦卒中發(fā)病中，OPN 可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型的表達(dá)，并且可以降低M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS 的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)M1 和M2 表型小膠質(zhì)細(xì)胞往往互相重疊，而骨橋蛋白可以促進(jìn)M2 表型的小膠質(zhì)細(xì)胞從重疊區(qū)域分離，并且這種M1 和M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的分離可能對卒中后的結(jié)局是有益的。其他研究也發(fā)現(xiàn)，OPN 可以增加應(yīng)激狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞的存活，并且抑制小膠質(zhì)細(xì)胞超氧化物生成甚至可以直接清除氧自由基，但是在OPN 與小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、吞 噬 等 方 面 未 發(fā) 現(xiàn) 明 顯 促 進(jìn) 作 用［34，35］。Kim等［36］卻有了新發(fā)現(xiàn)，他們發(fā)現(xiàn)含有RGD 和SLAY基序的OPN 可以明顯增強(qiáng)BV2 細(xì)胞（小膠質(zhì)系的一種）的吞噬能力，并可以增強(qiáng)BV2 細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度、偽足長度等指標(biāo)，同時(shí)與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的F‐肌動(dòng)蛋白的強(qiáng)度及陽性區(qū)域均顯著增加［37］。因此骨橋蛋白可能通過小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮腦保護(hù)作用。

2.3 促神經(jīng)干細(xì)胞遷移

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是一種多潛能細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新能力并可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等。內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞廣泛存在于脊髓齒狀回顆粒下區(qū)、腦室下區(qū)等。在缺血性腦卒中發(fā)生后，這些特定區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞急劇上調(diào)，并且通過受損組織所釋放的趨化因子遷移至梗死核心，隨后分化為受損類型的神經(jīng)細(xì)胞，這種遷移在缺血性腦卒中治療中非常重要，因?yàn)閾p傷部位原有的神經(jīng)干細(xì)胞無法支持功能修復(fù)，而遷移來的NSC 除了分化以外還可以分泌適當(dāng)數(shù)量和類型的信號因子，持續(xù)影響缺血區(qū)域的微環(huán)境，因此也有助于對缺血性腦卒中損傷做出個(gè)性化反應(yīng)［38，39］。既往研究一般使用外源性神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行靜脈或者經(jīng)腦實(shí)質(zhì)的移植，并觀察到外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植后可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移，抑制炎癥、促進(jìn)突觸重塑、刺激新血管形成，這一過程可能是與分泌一些神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)。雖然外源性神經(jīng)干細(xì)胞對于缺血性腦卒中有一定治療作用，但由于倫理、治療效果和安全性問題，外源性NSC 移植療法仍距離臨床應(yīng)用階段非常遙遠(yuǎn)［38，40］。除此之外，也有研究試圖使用重復(fù)經(jīng)顱磁刺激等手段來促進(jìn)缺血性腦卒中后神經(jīng)干細(xì)胞功能的分化，但效果欠佳［41］。雖然內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的遷移對于缺血性腦卒中發(fā)病區(qū)域的治療非常重要，但是這種遷移對于嚴(yán)重的大腦損傷來說遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠［42］。Rogall 等［43］使用DCX‐luc轉(zhuǎn)基因小鼠（這種小鼠可以通過腹腔注射熒光劑使大腦呈現(xiàn)熒光狀態(tài)，并使神經(jīng)干細(xì)胞的遷移呈現(xiàn)“熱點(diǎn)”狀態(tài)，便于觀察［44］）造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPN 治療后的NSC 的遷移距離及擴(kuò)展數(shù)量極大地增加，并且在第7～28 天增強(qiáng)較為明顯。在類似研究中，Ra‐benstein 等［45］在給予缺血性腦卒中動(dòng)物模型OPN 的同時(shí)加入G 蛋白偶聯(lián)受體4（CXCR4）的阻斷劑AMD3100，而CXCR4 一直被認(rèn)為與神經(jīng)干細(xì)胞的遷移有密切關(guān)系［46，47］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷CXCR4 可以完全消除OPN 對NSC 的遷移誘導(dǎo)?？傊菢虻鞍讓τ谏窠?jīng)干細(xì)胞的遷移可能有密切關(guān)系，還可能與CXXR4 受體有關(guān)，并因此起到腦保護(hù)的作用。

2.4 促進(jìn)血管生成

缺血性腦卒中所致神經(jīng)元凋亡的嚴(yán)重程度往往取決于腦血流量減少的時(shí)間，因此促進(jìn)缺血性腦卒中后梗死區(qū)域的血流恢復(fù)對于恢復(fù)梗死區(qū)域的供血、供氧，減少神經(jīng)元凋亡非常重要［48］。但是，如前文所述，并不是所有患者都能及時(shí)接受再通治療，因此通過藥物等促進(jìn)血管生成逐漸引起了更多的關(guān)注。血管生成是一個(gè)多步驟的過程，涉及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管形成、分支和吻合等［49］。許多生長因子與這一過程有關(guān)，包括血管生成因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（FGF2）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等［50］。目前的促血管生成的手段主要包括：（1）藥物：比如芬戈莫德［51］；（2）細(xì)胞因子：如VEGF、FGF2 等，尤其是VEGF 比較多見，但是VEGF 有著引起血管通透性增加、導(dǎo)致滲漏的風(fēng)險(xiǎn)［52］；（3）其他：比如miRNA、重復(fù)的顱腦磁刺 激 等 等，但 均 效 果 有 限。Lee 等［53］發(fā) 現(xiàn) 使 用 含RGD 和SLAY 兩種基序的OPN 治療缺血性腦卒中大鼠，其腦梗死灶中的血管長度顯著增加（對照組的226.1%±11.2%），并且OPN 治療大鼠的缺氧明顯減輕。同樣是加用抗αvβ3 整合素抗體后可以降低這種改善，表明OPN 的RGD 和SLAY 基序與αvβ3 整合素的結(jié)合在促進(jìn)缺血性腦卒中后腦血管生成中發(fā)揮重要作用，當(dāng)然，這兩種基序是否同樣重要仍需進(jìn)一步研究。

2.5 修復(fù)血腦屏障

血腦屏障（BBB）屬于神經(jīng)血管單元，由內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形細(xì)胞末端足和基底膜組成［54］，其中星形細(xì)胞突起幾乎完全包裹腦毛細(xì)血管并覆蓋于血管腔外內(nèi)皮細(xì)胞的表面［55］，同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的末端表達(dá)大量的ATP 敏感性鉀通道，并且水通道蛋白‐4（AQP4）在星形膠質(zhì)細(xì)胞末端大量表達(dá)并定位，以此來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鉀通量及大腦與循環(huán)之間的水通量，此外星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放如膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、NO 等化學(xué)物質(zhì)以發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)元、神經(jīng)遞質(zhì)清除和再循環(huán)、調(diào)節(jié)BBB 的作用［55‐57］，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞對于BBB 的結(jié)構(gòu)和功能的完整非常重要。當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生后，由于MMPs 的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞間緊密連接遭到破壞，血腦屏障喪失其結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致大量的神經(jīng)毒性物質(zhì)、大分子、炎性細(xì)胞等滲入腦組織，同時(shí)BBB功能障礙可進(jìn)一步導(dǎo)致血管源性水腫形成和出血性轉(zhuǎn)化，最終會(huì)加速神經(jīng)損傷和認(rèn)知障礙［58］。目前保護(hù)血腦屏障的治療主要是藥物治療如抗MMPs的抗壞血酸、丙泊酚等，抗炎的黃體酮等，以及低溫治療等方法，但是效果仍不理想［59］。既往一些研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白在血腦屏障功能受損的血管中表達(dá)增加［60］，在進(jìn)一步的研究中，Gliem 等［61］通過追蹤AQP4 以觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在OPN‐/‐的缺血性腦卒中模型中，AQP4 的表達(dá)相對野生型小鼠下降，并且OPN‐/‐小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)于梗死區(qū)域外圍，未能向病變核心延伸其突起，同時(shí)正常表達(dá)大量AQP4 的星形膠質(zhì)細(xì)胞末端未能充分覆蓋新生血管，由于梗死核心區(qū)域缺少功能正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞，血腦屏障持續(xù)滲漏。因此，骨橋蛋白對于血腦屏障的重建可能有著重要作用，但是相關(guān)研究仍需完善。

3 展望

隨著生物科技的不斷發(fā)展，各種制藥技術(shù)也不斷進(jìn)步，Jin 等［62］研究發(fā)現(xiàn)使用明膠微球作為OPN的載體通過快速、持續(xù)的釋放方式可以增強(qiáng)其神經(jīng)保 護(hù) 作 用，而Joachim 等［63］進(jìn) 一 步 制 造 了 可 攜 帶OPN 的明膠納米顆粒（GNP），并且證明了這些攜帶OPN 的GNP 在鼻內(nèi)給藥后擁有良好的進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)、發(fā)揮腦神經(jīng)元保護(hù)的能力。

總之，骨橋蛋白是一種效果理想的缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)蛋白，隨著其保護(hù)機(jī)制的研究深入及運(yùn)用手段的不斷成熟，相信可以在臨床治療中更好應(yīng)用。