口蹄疫病毒病毒樣顆粒疫苗的研究進展

李國秀，丁耀忠 綜述，劉磊，張杰 審校

1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州730070

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MDV）引起的一種烈性傳染病，主要感染牛、豬、綿羊、山羊等偶蹄動物。FMDV 有7 種不同的血清型（O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2 和SAT 3），各血清型間無交叉反應(yīng)。FMD 雖死亡率較低，但給全球畜牧業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，我國將其列為一類傳染病。

病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）由病毒的衣殼蛋白組成，其缺乏病毒核酸而不具有傳染性，VLPs 形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子類似，保留了天然病毒粒子的空間構(gòu)象。VLPs 疫苗能夠有效地誘導T 細胞和B 細胞的免疫反應(yīng)。目前，我國預(yù)防FMD 仍采用滅活疫苗，但滅活疫苗存在一定的局限性。因此，開發(fā)一種廉價的、非傳染性的亞單位或VLPs 疫苗尤為重要的。近年來，VLPs 還在納米生物技術(shù)中作為外源抗原載體或支架材料而得到廣泛應(yīng)用。國內(nèi)外許多學者也開展了對FMDV VLPs 的研究，并取得一定的進步。本文就FMDV 及其VLPs 疫苗的研究進展作一綜述，為今后FMD 的防控提供參考。

1 FMDV 結(jié)構(gòu)蛋白

FMDV 粒子包含一個單鏈RNA 基因組，大小為8 400 bp，病毒粒子呈二十面體對稱，翻譯后加工成12 種蛋白質(zhì)（Lpro，VP1，VP2，VP3，VP4，2A，2B，2C，3A，3B，3Cpro，3D）［1］。FMDV 結(jié)構(gòu)蛋白由VP1、VP2、VP3 和VP4 共4 種衣殼蛋白各60 個拷貝組成，是P1衣殼前體多肽的裂解產(chǎn)物。在組裝過程中，5 個含有VP0、VP1 和VP3 拷貝的原基組裝成1 個五聚體，12個五聚體與1 個新轉(zhuǎn)錄的RNA 分子結(jié)合形成1 個病毒顆粒［2］。在RNA 存在下，VP0 最終成熟切割產(chǎn)生VP4 和VP2。VP1、VP2 和VP3 暴露于表面，VP1圍繞5 倍對稱軸，含有1 個G-H 環(huán)，其頂部有高度保守的RGD 氨基酸基序［3］，RGD 序列吸附至細胞表面并與表面受體結(jié)合，是病毒感染的關(guān)鍵。VP2 和VP3圍繞二十面體3 倍軸交替。VP4 在FMDV 血清型間高度保守，且VP4 和RNA 緊密結(jié)合，形成病毒粒子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。VP0、VP1、VP3、Lpro、2B、3A、3Cpro蛋白在抑制宿主先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用［4］。

2 FMDV 疫苗

2.1 傳統(tǒng)疫苗及其缺陷 FMD 是全球最主要的動物疾病之一。在發(fā)展中國家，F(xiàn)MD 的控制和根除依賴于疫苗接種。20 世紀80 年代我國培育出溫度敏感毒株和O 型OP4 細胞培養(yǎng)弱毒疫苗［5］，由于技術(shù)的限制，導致毒株在模式動物體內(nèi)馴化困難。同時RNA 病毒在宿主體內(nèi)極易由于基因突變導致毒株返強或毒株重組等情況。隨后，弱毒疫苗逐漸被滅活疫苗所取代，滅活疫苗在FMD 防控中占主導地位。我國滅活疫苗的發(fā)展經(jīng)歷了兩個技術(shù)階段，即轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞生產(chǎn)病毒抗原及細胞懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)病毒抗原［6］。歐洲和南美洲一些國家經(jīng)歷了10 多年滅活疫苗接種后，疫情得到了控制［7］。盡管滅活疫苗在當前的FMD 控制方面取得了成功，但近年來其在緊急控制規(guī)劃應(yīng)用中也存在一些問題和局限性，如疫苗生產(chǎn)過程中出現(xiàn)病毒逃逸及病毒滅活不完全等問題，導致接種動物感染FMDV［8］。因此，為避免傳統(tǒng)滅活疫苗所帶來的不足，迫切需要開發(fā)一種新型廉價的FMDV 疫苗，如重組亞單位疫苗、合成肽疫苗、VLPs 疫苗［9-11］。

2.2 FM D V V LPs疫苗 VLPs 通常是由病毒衣殼的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的球形空腔結(jié)構(gòu)［12］，VLPs 安全性高、細胞攝取效率高，具有良好的溶解度與生物相容性及靶向給藥和載藥能力［13］，還可通過與天然病毒感染相似的途徑呈遞給樹突狀細胞，繼而有效地誘導動物機體產(chǎn)生體液與細胞免疫，因此，VLPs 被認為是一種理想的生物載體。相關(guān)研究顯示，VLPs 自身具有佐劑分子的功能效應(yīng)，不需要與佐劑混合乳化就可誘導機體產(chǎn)生有效的免疫刺激［14-15］。隨著研究的深入與技術(shù)的不斷進步，基于VLPs 的應(yīng)用具有廣闊發(fā)展前景。目前，已構(gòu)建出多種病毒的VLPs，其中FMDV VLPs、乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）VLPs、豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）VLPs、牛細小病毒（bovine parvovirus，BPV）VLPs 和豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）VLPs 已成功作為載體將FMDV 抗原表位嵌合在表面，并獲得了針對FMDV 的保護力。VLPs 既可與其他危害嚴重的傳染病一起制備成為多價苗，也可與同血清型病毒一起制備聯(lián)苗［16］。

3 FMDV VLPs 高效表達系統(tǒng)

3.1 原核表達系統(tǒng) VLPs 疫苗的開發(fā)嘗試了多種表達平臺，其中原核表達系統(tǒng)最常用的是大腸埃希菌表達系統(tǒng)，其表達量大、產(chǎn)物易于純化、成本低廉、培養(yǎng)技術(shù)簡單、遺傳背景清晰，因此廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域［17］。重組FMDV VLPs 是由VP0、VP1 和VP3結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成，可通過3 個單獨結(jié)構(gòu)衣殼蛋白的共同表達或病毒衣殼前體P1-2A 與病毒蛋白酶3C 的共同表達來實現(xiàn)［18］。XIAO 等［19］開發(fā)了大腸埃希菌共表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過單個質(zhì)粒串聯(lián)驅(qū)動FMDV 衣殼蛋白（VP0、VP1 和VP3）的表達，經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵獲得共表達的FMDV 衣殼蛋白，并在體外自組裝VLPs。研究結(jié)果表明，大腸埃希菌體外組裝VLPs可作為一種有效的FMD 疫苗候選方式。GUO 等［17］利用分子伴侶蛋白SUMO 對大腸埃希菌中FMDV的衣殼蛋白VP0、VP1 和VP3 進行了高效表達，將融合蛋白中的相撲片段用SUMO 切割酶去除后，將3 種衣殼蛋白組裝成VLPs，大小和形狀與FMDV 顆粒相似，該VLPs 在豚鼠、豬和牛體內(nèi)均可產(chǎn)生較強的中和抗體。DONG 等［20］發(fā)現(xiàn)，用于疫苗VLPs 上顯示的表位肽EP141-160 具有較高的免疫活性，隨后，研究人員將反義RNA 與VLPs 結(jié)合，利用原核共表達系統(tǒng)制備FMDV 疫苗。結(jié)果表明，表位RNA VLPs可誘導小鼠對FMDV 產(chǎn)生免疫應(yīng)答。LEI 等［21］將3種FMDV 多表位抗原的分子內(nèi)佐劑與A 型和O 型FMDV 代表性毒株VP1 上的B 細胞表位或非結(jié)構(gòu)蛋白3A 上的T 細胞表位的編碼基因進行串聯(lián)，并插入至截短型乙肝核心抗原的主要免疫原區(qū)進行合成，在原核表達系統(tǒng)中獲得不同的重組抗原，并在體外高效自組裝成帶有FMDV 抗原表位的VLPs。PUCKETTE 等［22］將P1-2A 多聚蛋白和突變體3C（L127P）蛋白克隆至載體中，制備VLPs，突變體3C 蛋白酶L127P，顯著提高了重組FMDV 亞單位抗原的產(chǎn)量，L127P 突變代表FMD 疫苗生產(chǎn)的新進展。

3.2 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng) 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)常用于表達FMDV VLPs，利用含桿狀病毒基因組作為重組表達載體轉(zhuǎn)染Sf9 昆蟲細胞。真核表達系統(tǒng)有翻譯后加工修飾過程、表達量大，且具有良好的免疫原性［23］。LIU 等［24］利用昆蟲細胞表達系統(tǒng)構(gòu)建了一種新型嵌合型VLPs，將O 型FMDV 的VP1基因嵌合至A 型P12A 基因中，形成嵌合基因，并利用A 型FMDV 蛋白酶3C 成功將其裂解，自組裝成VLPs。CHANG 等［25］通過篩選噬菌體展示文庫和融合表位肽的分析，鑒定出O 型和Asia1 型的表位8E8和3E11，利用桿狀病毒載體系統(tǒng)表達野生型BPV VP2 和8E8 表位嵌合VP2 蛋白，在Sf9 細胞中產(chǎn)生BPV VP2 蛋白，通過電鏡觀察到融合蛋白能夠組裝成VLPs，嵌合型VLPs 接種小鼠后均可產(chǎn)生抗BPV IgG 抗體與抗FMDV 中和抗體，其中抗FMDV 的中和抗體滴度最高為1 ∶176。因此，鑒定高度保守的中和表位有助于開發(fā)嵌合型FMDV 疫苗。另外，在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中，pH 對VLPs 的組裝有一定影響，研究發(fā)現(xiàn)，O 型FMDV 衣殼比其他血清型對酸性敏感，在低pH 的昆蟲細胞中較難產(chǎn)生空的O 型VLPs［26］。

4 VLPs 疫苗的免疫效果

許多研究表明，F(xiàn)MDV VLPs 疫苗對動物能夠產(chǎn)生較好的免疫效果，LIU 等［24］對組裝的嵌合型VLPs進行了免疫原性和保護效果的評價，結(jié)果表明，嵌合型VLPs 能引起明顯的體液和細胞免疫，接種嵌合VLPs 的5 只豚鼠中，有4 只完全獲得了FMDV 毒株O ／ MAY98 的50%豚鼠感染劑量（50% guinea pig infectious doses，GPID50）的保護，這些數(shù)據(jù)表明，嵌合型VLPs 是開發(fā)FMDV 新型疫苗的潛在候選者。GUO 等［17］利用原核表達系統(tǒng)制備了VLPs，并作為免疫原用于豚鼠、豬和牛，研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MDV 特異性中和抗體、T 淋巴細胞和IFNγ 被有效地誘導免疫動物，F(xiàn)MDV VLPs 對牛的50%保護劑量（50%protection dose，PD50）可達6.34。上述研究結(jié)果表明，F(xiàn)MDV VLPs 疫苗具有良好的研發(fā)潛力。

5 小 結(jié)

FMD 給全球帶來巨大的經(jīng)濟損失，因FMDV 毒株易變異，使FMD 難以得到有效控制。隨著技術(shù)的進步，新型疫苗的出現(xiàn)不僅克服了傳統(tǒng)疫苗的缺點，且在FMD 的防控上也取得了進步。目前，雖然已有多種病毒的VLPs 在實驗室中成功制備，但只有極少數(shù)在疫苗應(yīng)用中取得突破，獲得合適的組裝工藝、放大制備工藝和制劑工藝組合是阻礙其向前發(fā)展的重要原因。且由于VLPs 的特殊性，幾種表達系統(tǒng)組裝VLPs 的效率比較低、較難組裝，利用其制備和組裝結(jié)構(gòu)復(fù)雜的VLPs 仍存在諸多問題。另外，選擇最佳的新型疫苗不僅需要評估其免疫原性，還需要評估其生產(chǎn)策略的可行性。因此，VLPs 作為FMDV抗原表位載體的疫苗還需要進行更深入地探索和研究。