柯薩奇病毒A 16 型疫苗的研究進(jìn)展

馮驍 綜述，李琦涵 審校

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650118

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是由腸道病毒引起的傳染病，腸道病毒包括20 多種類型，其中柯薩奇病毒A16 型（Coxsackievirus type A 16，CA16）和腸道病毒71 型（enterovirus71，EV71）最常見。HFMD 可引起5 歲以下兒童的口腔疼痛、厭食、低熱及手、腳和口腔潰瘍，大多數(shù)兒童約1 周痊愈，但也可能導(dǎo)致少數(shù)兒童出現(xiàn)心肌炎、肺水腫、無菌腦膜炎等并發(fā)癥［1］，其中重癥病例可能出現(xiàn)病情的迅速發(fā)展，甚至導(dǎo)致死亡。HFMD 多次在全球范圍內(nèi)流行暴發(fā)，大多數(shù)由CA16 和EV71 引發(fā)，目前EV71滅活疫苗已上市［2-3］，但CA16 疫苗研究進(jìn)展仍較緩慢。因此，CA16 感染機(jī)制的研究及CA16 疫苗的研發(fā)仍是目前解決該病公共衛(wèi)生問題的熱點(diǎn)和關(guān)鍵。CA16 疫苗的研發(fā)可充分借鑒EV71 疫苗的工藝、質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。目前，許多企業(yè)及機(jī)構(gòu)開展了CA16 全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗、病毒樣顆粒樣（virus-like particle，VLP）疫苗的研發(fā)。本文就上述類型CA16 疫苗的研發(fā)進(jìn)展作一綜述。

1 CA16 的病毒形態(tài)及基因結(jié)構(gòu)特征

CA16 屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，病毒顆粒呈20 面體立體對(duì)稱的球形結(jié)構(gòu)，直徑23～30 nm，由內(nèi)部核酸和衣殼蛋白質(zhì)組成，無脂質(zhì)包膜。其核酸為單股正鏈RNA，全長約7 410 個(gè)核苷酸。RNA兩端為5′和3′非編碼區(qū)，中間的開放閱讀框編碼1個(gè)多聚前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解為P1、P2 和P3 3 個(gè)前體蛋白，P1 可進(jìn)一步酶解為VP1、VP2、VP3、VP4，共同組成病毒衣殼，VP1 含病毒主要的中和抗原決定簇［1］。

2 CA16 流行病學(xué)調(diào)查

2.1 C A 16 流行范圍 有研究顯示，CA16 的感染率高于EV71，CA16 引起的HFMD 流行在全球范圍內(nèi)均有報(bào)道。1994 年，英國暴發(fā)了嚴(yán)重的HFMD，此次導(dǎo)致流行的病原是CA16［4］；芬蘭暴發(fā)的HFMD的主要病原也是CA16［5］；日本監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)提示，CA16每3 年流行1 次［6］；在中國許多省份均有CA16 作為主要流行株引發(fā)HFMD 的報(bào)道，如上海、武漢等［7-9］。另外，由CA16 引發(fā)的重癥和死亡病例也在美洲和南亞［10］的許多地區(qū)有報(bào)道。

2.2 C A 16 的致病性 CA16 會(huì)引起5 歲以下嬰幼兒出現(xiàn)發(fā)熱、手足口皰疹和潰爛等，極少數(shù)重癥患兒也可出現(xiàn)肺炎、心肌炎、腦膜炎等致死病癥［11］。根據(jù)CA16 分子流行病學(xué)的調(diào)查研究顯示，CA16 基因組具有低保真復(fù)制和頻繁重組的特點(diǎn)，導(dǎo)致了CA16 具有高突變率的特性［12］。同時(shí)HFMD 流行病學(xué)提示，EV71 與CA16 常交替或共同流行［13］。這些證據(jù)均表明CA16 與EV71 將有較大幾率發(fā)生基因重組，且導(dǎo)致更為嚴(yán)重和復(fù)雜的HFMD。已上市的EV71 疫苗對(duì)CA16 無交叉保護(hù)作用，不能對(duì)由其他病原體引起的HFMD 起到預(yù)防保護(hù)作用［14］，因此研制有效的CA16 疫苗對(duì)HFMD 的防治將起到至關(guān)重要的作用，可擴(kuò)大HFMD 的防治范圍。

3 CA16 疫苗研發(fā)的可行性

3.1 中和抗體對(duì)人群的保護(hù)效果 在對(duì)于CA16 流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，人感染CA16 后產(chǎn)生的中和抗體可保護(hù)人群避免二次感染［15］，提示CA16 的中和抗體可對(duì)其感染產(chǎn)生保護(hù)作用，這為CA16 疫苗的研發(fā)提供了可能和基礎(chǔ)。另外，有調(diào)查表明，新生嬰兒體內(nèi)的CA16 的抗體水平較高，但約9 月齡時(shí)開始減少，5 歲以上的幼童抗體水平又接近成人［16］，該結(jié)果符合HFMD 多發(fā)于9 月齡～5 歲嬰幼兒的特征，這也提示了人體內(nèi)相關(guān)中和抗體水平與HFMD 的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，中和抗體可保護(hù)人體對(duì)抗HFMD。在以上流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，為驗(yàn)證中和抗體的保護(hù)作用，多項(xiàng)研究進(jìn)行了細(xì)胞水平和動(dòng)物水平試驗(yàn)，結(jié)果也證實(shí)了中和抗體具有保護(hù)作用［17-19］。這些均為CA16 疫苗的研發(fā)提供了基礎(chǔ)和可能。

3.2 EV 71 及其他腸道病毒疫苗的研發(fā)經(jīng)驗(yàn) 目前已有腸道病毒疫苗（脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗，全病毒滅活EV71 疫苗等）成功上市，其中EV71 與CA16 的遺傳物質(zhì)有較高的同源性，同類腸道病毒的毒株篩選、制備工藝、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、動(dòng)物模型的建立將為CA16疫苗的制備提供依據(jù)［20］。

4 CA16 疫苗相關(guān)的研發(fā)進(jìn)展

4.1 免疫原性評(píng)價(jià) 免疫原性是抗原的一種特性，用疫苗模擬病原體接種機(jī)體后，抗原能刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)抗體和致敏淋巴細(xì)胞，抗體和致敏淋巴細(xì)胞則直接抵御病原體的入侵。因此，免疫原性是評(píng)價(jià)疫苗有效性的重要指標(biāo)。體液免疫和細(xì)胞免疫是構(gòu)成適應(yīng)性免疫反應(yīng)的兩個(gè)方面，CD4+T 淋巴細(xì)胞具有激活B 淋巴細(xì)胞和CD8+T 淋巴細(xì)胞的功能。B 淋巴細(xì)胞主要產(chǎn)生中和抗體，中和抗體通過阻止病原體入侵宿主細(xì)胞而發(fā)揮體液免疫的作用；CD8+T 細(xì)胞通過靶向殺傷病原體入侵的宿主細(xì)胞而發(fā)揮細(xì)胞免疫的作用。當(dāng)病原體再次入侵機(jī)體時(shí)，記憶B 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞迅速反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體不受感染和損傷［21］。且在中和抗體不足的情況下，機(jī)體主要靠細(xì)胞免疫發(fā)揮作用。因此，體液免疫和細(xì)胞免疫是免疫原性評(píng)價(jià)的指標(biāo)，免疫原性的評(píng)價(jià)是通過對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫的評(píng)價(jià)來實(shí)現(xiàn)的。目前，評(píng)價(jià)免疫引起的病原體特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)多通過體外檢測(cè)脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［15］，評(píng)價(jià)免疫引起的病原體特異性體液免疫反應(yīng)則是通過體外檢測(cè)血清中中和抗體的效價(jià)。

4.2 動(dòng)物模型 由于EV71 和CA16 在基因組成和氨基酸序列上的高度同源性，可借鑒EV71 疫苗研制的流程和評(píng)價(jià)方法來研發(fā)CA16 疫苗。目前，EV71疫苗逐步在乳鼠模型、恒河猴模型中成功驗(yàn)證了疫苗的有效保護(hù)性［22-23］，這些均推動(dòng)了疫苗由實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)過度至臨床試驗(yàn)，最后將成功上市。本課題組在前期研究中制備了相關(guān)實(shí)驗(yàn)性CA16 疫苗，同時(shí)參考EV71 疫苗動(dòng)物模型建立了CA16 疫苗有效性評(píng)價(jià)的小鼠模型，在此模型中驗(yàn)證了CA16 疫苗的免疫原性和保護(hù)性；隨后，在小鼠模型成功的基礎(chǔ)上建立了恒河猴模型，模擬了人類感染CA16 病毒引起的典型的皰疹、病毒血癥和臨床狀態(tài)，并對(duì)恒河猴進(jìn)行免疫后攻毒，結(jié)果顯示，制備的疫苗刺激猴機(jī)體可產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，但對(duì)猴機(jī)體未產(chǎn)生有效的保護(hù)作用，表明制備的CA16 疫苗可能不具有有效性［15］，此項(xiàng)研究為改進(jìn)CA16 實(shí)驗(yàn)性疫苗提供了依據(jù)。小鼠模型、猴體模型在CA16 疫苗研發(fā)中發(fā)揮了重要作用。

4.3 疫苗研發(fā)類型

4.3.1 全病毒滅活疫苗 傳統(tǒng)疫苗多為滅活疫苗，此類疫苗具有良好的保護(hù)效果，且安全性較高，因此在CA16 疫苗的研發(fā)過程中，許多研究均采用了抗原的滅活法制備疫苗。CAI 等［24］選用CA16 臨床分離株通過β 丙內(nèi)酯滅活后免疫小鼠，結(jié)果表明，其具有較好的免疫保護(hù)效果：分離得到的抗血清能在CA16-MAV 的致死性攻擊中保護(hù)新生小鼠；選用病毒株CA16-SZ05 和CA16-G08 制備滅活疫苗，分別免疫幼鼠和成年小鼠，可產(chǎn)生較好的交叉保護(hù)效果。該疫苗在幼鼠及成年小鼠體內(nèi)，對(duì)同源及非同源病毒均能有較好的防御作用。CHEN 等［25］用甲醛滅活CA16 臨床分離株免疫小鼠，也觀察到較好的免疫原性及保護(hù)作用。但YANG 等［26］用CA16 滅活疫苗對(duì)乳鼠和獼猴進(jìn)行免疫試驗(yàn)，誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)不高，在體內(nèi)存留時(shí)間較短。

4.3.2 減毒活疫苗 JIANG［27］對(duì)FY18、KMM ／ 08、KM208 株和臨床樣本分離獲得的7 株CA16 在KMB17 細(xì)胞中通過連續(xù)低溫傳代的方式進(jìn)行減毒，經(jīng)以感染性滴度、抗原含量、致病性、免疫原性等為指標(biāo)的篩選后，獲得KM168-8、KM154-6 兩株11 代次的減毒株，感染性滴度≥6.50 1gCCID50／ mL 時(shí)，對(duì)乳鼠不致病，無病理損傷，且單一穩(wěn)定；對(duì)乳鼠加強(qiáng)免疫后，抗體效價(jià)較高，抗體陽轉(zhuǎn)率達(dá)100%。因此，這些減毒株適宜進(jìn)行后續(xù)的減毒疫苗開發(fā)。

4.3.3 亞單位疫苗 結(jié)構(gòu)蛋白VP1 是CA16 中和抗原決定簇的主要集中部位，許多實(shí)驗(yàn)室通過表達(dá)VP1 制備亞單位疫苗，這些研究的區(qū)別主要是其表達(dá)系統(tǒng)不同。YANG 等［28］采用CA16 青島株的VP1序列并利用原核表達(dá)技術(shù)在大腸埃希菌中表達(dá)了CA16 VP1 重組蛋白，經(jīng)純化后免疫小鼠，結(jié)果顯示，血清中和抗體效價(jià)均低于1 ∶8，不具有制備CA16 疫苗的潛力。LI 等［29］利用CA16 山東株的序列在Bacto-Bac 桿狀病毒Sf9 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備了VP1蛋白疫苗，免疫小鼠后，結(jié)果顯示該疫苗可誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫和體液免疫。

4.3.4 DNA 疫苗 DNA 疫苗是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)質(zhì)粒直接注射至動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，研究可根據(jù)預(yù)期抗原表位設(shè)計(jì)重組表達(dá)質(zhì)粒，因此該類疫苗具備好的免疫原性和減毒的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又無逆轉(zhuǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，具有較大的應(yīng)用潛力，視為繼傳統(tǒng)疫苗及基因工程亞單位疫苗后的第三代疫苗。TUNG 等［30］制備了EV71 DNA 疫苗，免疫小鼠后可產(chǎn)生血清特異性IgG 和中和抗體，同時(shí)，產(chǎn)生了細(xì)胞免疫應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)也為CA16 DNA 疫苗的研發(fā)起到推動(dòng)作用。LIU 等［31］在減毒傷寒沙門菌中成功構(gòu)建了穩(wěn)定的重組質(zhì)粒VR-CVP1，其能在Vero細(xì)胞中成功表達(dá)出CVA16 VP1 蛋白，且在轉(zhuǎn)染的Vero 細(xì)胞中具有抗原活性。實(shí)驗(yàn)提示，該蛋白可能會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)且具有免疫原性，為CA16 DNA 疫苗的研發(fā)提供了可能。與傳統(tǒng)的減毒或滅活疫苗相比，DNA 疫苗的研制周期更短，同時(shí)也降低了成本，且具備良好的免疫原性和減毒的優(yōu)點(diǎn)，無逆轉(zhuǎn)風(fēng)險(xiǎn)，因此DNA 疫苗將是未來疫苗發(fā)展的方向。

4.3.5 V LP 疫苗 VLP 疫苗也是研究的熱點(diǎn)之一。目前報(bào)道的CA16 VLP 疫苗由于同時(shí)表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白P1 和酶蛋白3CD，均可通過3CD 切割P1 實(shí)現(xiàn)VLP自組裝，VLP 疫苗由于其表達(dá)系統(tǒng)不同而有許多種類。ZHAO 等［32］利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VLP 可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，具有良好的免疫原性。VLP 疫苗誘導(dǎo)的中和抗體滴度較其他疫苗高，對(duì)CA16 疫苗的開發(fā)有較大潛力。CHEN 等［33］對(duì)昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，針對(duì)P1 基因和3CD 基因，在桿狀病毒基因中插入啟動(dòng)子P10 進(jìn)行優(yōu)化。利用Bac-to-Bac 桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)CVA16 VLP，隨后免疫小鼠，可誘導(dǎo)高滴度中和抗體。另外，LYU 等［34］對(duì)釀酒酵母表達(dá)的EV71 VLP 進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析研究，通過在保留EV71 VLP 線性和構(gòu)象中和表位的同時(shí)置換了VP1 GH 環(huán)上的4 個(gè)氨基酸，保證其特異性和增加其同源性，設(shè)計(jì)出EV71 ／ CA16嵌合VLP 新VLP 疫苗的制備思路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該嵌合VLP 可保護(hù)機(jī)體抵御兩種病毒的感染，為HFMD 疫苗的研發(fā)提供了新的方向和手段。

5 展 望

EV71 疫苗上市以來，已有效地降低了HFMD 重癥和死亡的發(fā)生率，但其缺乏交叉保護(hù)性，不能抵抗其他病原體引起的HMFD［35］。因此，研發(fā)CA16 疫苗將成為防治HFMD 的重點(diǎn)。CA16 中和抗體的保護(hù)作用為CA16 疫苗的研發(fā)提供了依據(jù)，該疫苗的研發(fā)可充分借鑒EV71 疫苗的工藝、質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。目前，多家企業(yè)及機(jī)構(gòu)開展了CA16 全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗、VLP疫苗的研發(fā)。但CA16 病毒特性、流行特征、分子流行病學(xué)、血清流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制及保護(hù)機(jī)制等相關(guān)基礎(chǔ)研究，已成為CA16 疫苗研發(fā)中亟待解決的問題，需多部協(xié)作攻關(guān)，為疫苗研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。另外，免疫原性和保護(hù)效果是疫苗有效性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，需開展相關(guān)評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)品研制及體內(nèi)外保護(hù)效果的平行性研究，建立標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)價(jià)平臺(tái)，確保疫苗有效性評(píng)價(jià)的特異性、可靠性和穩(wěn)定性。