原代細(xì)胞在人用狂犬病疫苗中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

石磊泰 綜述，李玉華 審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京102629

據(jù)考證，公元16世紀(jì)，我國(guó)明朝隆慶年間已有種痘的醫(yī)書記載，將天花患者康復(fù)后的皮膚痂皮磨碎成粉，吹入未患病的兒童鼻腔即可預(yù)防天花［1］。19世紀(jì)70年代，病原菌的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了疫苗免疫學(xué)的研究。1882年，巴斯德從牛腦分離到1株狂犬病病毒，在家兔腦內(nèi)連續(xù)傳90代后馴化為固定毒，將感染固定毒的家兔脊髓取出后干燥減毒，給狗免疫后能預(yù)防狂犬病。1885年，巴斯德用這種疫苗成功救治了一名被瘋狗咬傷的9歲男孩，這一舉措開啟了人用狂犬病疫苗預(yù)防狂犬病的新紀(jì)元［2-3］。巴斯德發(fā)明的這種狂犬病疫苗其實(shí)是一種依賴神經(jīng)組織培養(yǎng)的疫苗，半個(gè)多世紀(jì)的應(yīng)用出現(xiàn)了眾多因神經(jīng)組織殘留而引起的變態(tài)反應(yīng)，因此，人們開始嘗試采用非神經(jīng)組織培養(yǎng)狂犬病病毒。

用于病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展為疫苗生產(chǎn)的模式轉(zhuǎn)變鋪平了道路，原代細(xì)胞直接來源于動(dòng)物，保留了其來源組織的特性，不具有致瘤特性。它們不被儲(chǔ)存或只作為細(xì)胞庫在有限的范圍內(nèi)被儲(chǔ)存。本文就原代細(xì)胞在人用狂犬病疫苗中的應(yīng)用及研究進(jìn)展作一綜述。

1 鴨胚疫苗

病毒學(xué)家在20世紀(jì)30年代取得了突破性進(jìn)展，他們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)多種動(dòng)物病毒的一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的方法是禽胚技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：可用性，易于操作，胚胎存在自然無菌環(huán)境；胚胎無法產(chǎn)生針對(duì)用作接種物的病毒的抗體；胚胎具有相對(duì)統(tǒng)一的遺傳結(jié)構(gòu)。

1955和1956年，PECK等［4-5］為進(jìn)一步避免引起變態(tài)反應(yīng)的事故，又研制了用鴨胚制備的疫苗（DEV）。系用固定毒接種7日齡鴨胚卵黃囊，培養(yǎng)12~14 d，取胚制成40%懸液并用β-丙內(nèi)脂滅活。這種疫苗在美國(guó)和其他許多國(guó)家廣泛應(yīng)用達(dá)27年，多數(shù)用于感染前預(yù)防。據(jù)報(bào)道，中和抗體水平不如腦組織疫苗。自1958—1975年共發(fā)生21例神經(jīng)并發(fā)癥，死亡2例。在全程免疫中其發(fā)生率為1∶25 000，但局部反應(yīng)和一般全身副反應(yīng)幾乎所有接種者均有發(fā)生。由于抗體應(yīng)答低，效果未能肯定，以及二倍體細(xì)胞疫苗的成功開發(fā)，1981年起，美國(guó)及其他國(guó)家不再生產(chǎn)和使用這種疫苗。

在伯納的瑞士血清和疫苗研究所開發(fā)了一種高純度的狂犬病疫苗［6-7］，該疫苗具有高含量的有效狂犬病病毒糖蛋白抗原，新疫苗是從鴨胚（PDEV）衍生而來的。根據(jù)世界衛(wèi)生組織針對(duì)強(qiáng)效狂犬疫苗推薦的暴露后時(shí)間表進(jìn)行的免疫（在第0、3、7、14、28和90 d進(jìn)行6次注射）已在第14天誘導(dǎo)出保護(hù)性抗體滴度（大于1 IU／mL）。最新的放射免疫法的使用并未揭示新狂犬病疫苗中髓鞘堿性蛋白的存在。由于狂犬病疫苗PDEV的制備有所改進(jìn)，是一種經(jīng)濟(jì)高效的疫苗，僅涉及極少的疫苗后腦炎風(fēng)險(xiǎn)。

1983年，世界衛(wèi)生組織曾提倡使用胚胎卵作為生產(chǎn)平臺(tái)［8］，但使用胚胎蛋仍有許多局限性，包括供應(yīng)不足的風(fēng)險(xiǎn)、產(chǎn)量不一致的耗時(shí)過程、制造成本高以及對(duì)雞蛋成分可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)［9］。從母公司瑞士伯納生物技術(shù)公司轉(zhuǎn)讓技術(shù)后，印度于2001年開始大規(guī)模生產(chǎn)并使用這種疫苗［10-11］，但目前已停產(chǎn)［12］。

2 雞胚細(xì)胞疫苗

1965和1978年，日本的KONDO［13-14］用Flury HEP株適應(yīng)原代雞胚細(xì)胞制成凍干純化雞胚細(xì)胞疫苗PCECV，1980年由日本批準(zhǔn)應(yīng)用，主要在日本和東南亞一些國(guó)家使用。1984年，聯(lián)邦德國(guó)Behring廠用Flury LEP株適應(yīng)雞胚細(xì)胞制成PCECV，并注冊(cè)商標(biāo)Rabipur?，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用。PCECV在全球范圍內(nèi)以Rabipur的形式銷售，但有一些例外：在南非和納米比亞以Rabipor銷售（于2000年獲得許可），在美國(guó)和加拿大稱為RabAvert（分別于1997和2003年獲得許可）。

Rabipur是采用Flury LEP狂犬病病毒在雞胚細(xì)胞上培養(yǎng)，用β-丙內(nèi)酯滅活，通過連續(xù)密度梯度離心法，用聚明膠做穩(wěn)定劑，再凍干制成［15］。Rabipur由通過世界衛(wèi)生組織預(yù)認(rèn)證［16］的制造工廠生產(chǎn)：德國(guó)馬爾堡和印度安克雷什瓦。在德國(guó)馬爾堡，一個(gè)新的最先進(jìn)的Rabipur制造廠已于2014年獲得批準(zhǔn)。來自這兩個(gè)工廠的數(shù)批Rabipur已被證明具有臨床可比性：印度生產(chǎn)的疫苗與德國(guó)生產(chǎn)的疫苗在免疫原性和耐受性方面均無劣效性［17-18］。

Rabipur不僅可通過肌肉免疫誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，還能通過皮內(nèi)途徑刺激類似的免疫反應(yīng)。皮內(nèi)途徑注射在國(guó)家衛(wèi)生當(dāng)局認(rèn)可的流行區(qū)、發(fā)展中國(guó)家為狂犬病疫苗的可負(fù)擔(dān)性作出了重大貢獻(xiàn)［19］。

Rabipur是第一種純化的雞胚細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，1984年在德國(guó)獲得許可，后續(xù)在全世界60多個(gè)國(guó)家獲得許可。Rabipur的免疫原性、有效性和安全性已在大量暴露前和暴露后臨床試驗(yàn)中通過肌內(nèi)和皮內(nèi)免疫途徑進(jìn)行了評(píng)估，試驗(yàn)人群包括成人和兒童，健康志愿者和被實(shí)驗(yàn)室證明的狂犬病動(dòng)物咬傷者，營(yíng)養(yǎng)不良的兒童和免疫功能低下人群。在過去30年中，使用Rabipur進(jìn)行的廣泛的全球臨床經(jīng)驗(yàn)表明，該疫苗具有免疫原性，有效且通常具有良好的耐受性［20］。

CTN-1株由中國(guó)食品藥品檢定研究院建株和保存，是WHO和我國(guó)有關(guān)部門批準(zhǔn)用于疫苗生產(chǎn)的毒株［21］，研究表明，相對(duì)其他疫苗生產(chǎn)株，CTN-1疫苗株與國(guó)內(nèi)多數(shù)流行野毒株的基因同源性較高，對(duì)我國(guó)流行株具有普遍的保護(hù)作用［22］。

有研究者分析了狂犬病病毒CTN-1株在雞胚細(xì)胞馴化過程中的特性［23-25］。利用RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增CTN-1株19個(gè)代次的G蛋白基因，獲得cDNA進(jìn)行序列測(cè)定；并以免疫熒光法測(cè)定各代次毒株在細(xì)胞中的滴度。序列測(cè)定結(jié)果顯示，CTN-1株在雞胚細(xì)胞馴化過程中G蛋白基因序列發(fā)生不同程度變異且逐步積累，從第30代開始，G蛋白基因序列趨于穩(wěn)定。與CTN-1株相比，雞胚細(xì)胞馴化株在G蛋白的第147、333、389、421和485位氨基酸發(fā)生了突變。與此相對(duì)應(yīng)，CTN-1株雞胚細(xì)胞馴化株滴度逐漸趨于穩(wěn)定，并于第33~58代滴度維持在7.0~7.5 lgFFU／mL。G蛋白同源性分析表明，CTN-1株雞胚細(xì)胞馴化株與我國(guó)近期不同區(qū)域分離得到的街毒株具有較高的同源性，其G蛋白氨基酸序列同源性為89.3%～99%。CTN-1株在雞胚細(xì)胞馴化過程中G蛋白基因發(fā)生穩(wěn)定變異，滴度在傳代后33~58代達(dá)到較高水平，穩(wěn)定性較好。將CTN-1株在雞胚細(xì)胞的適應(yīng)株命名為CTNCEC25株。

王春華等［26］初步證實(shí)，CTNCEC25株是1株高度減毒、不易返祖的弱毒株，其在雞胚細(xì)胞上可穩(wěn)定、快速增殖，病毒滴度高（＞107.0FFU／mL），是1株安全性較高的狂犬病疫苗候選毒株。研究狂犬病病毒CTNCEC25株的增殖能力、病毒的感染力及致病力等表型特征，為將該毒株應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)提供基礎(chǔ)信息。將CTNCEC25株及其母株CTN-1分別接種Vero細(xì)胞、原代雞胚成纖維細(xì)胞（primary chick embryo cell，CEC）和小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞（moue neuroblastma N2a cell，N2a），觀察其細(xì)胞病變特性及其復(fù)制規(guī)律；以腦內(nèi)注射的方式接種動(dòng)物，觀察其對(duì)乳鼠、小鼠、豚鼠及家兔的致病力；同時(shí)還將CTNCEC25株在CEC上連續(xù)傳20代，在乳鼠腦內(nèi)傳3代，觀察其增殖能力、病毒感染力及致病力的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，與母株CTN-1株相比，CTNCEC25株在Vero細(xì)胞和N2a細(xì)胞上的增殖并無顯著差異，但在CEC上，CTNCEC25株具有明顯優(yōu)勢(shì)，其72 h滴度可達(dá)107.5～7.6FFU／mL，而CTN-1株滴度只有105.8FFU／mL；此外，CTNCEC25株在N2a細(xì)胞、Vero細(xì)胞及CEC上均可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。腦內(nèi)致病力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTNCEC25株雖然對(duì)1~3日齡乳鼠仍具有較強(qiáng)的腦內(nèi)致病性，但對(duì)成年小鼠的腦內(nèi)致病力大大減弱，對(duì)豚鼠和家兔不致病。經(jīng)細(xì)胞和乳鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代，CTNCEC25株在CEC上增殖穩(wěn)定，其減弱的毒力并未回升，無弱毒返祖現(xiàn)象。

郭采平等［27］對(duì)CTNCEC25株在雞胚細(xì)胞（chick embryo cells，CECs）上的培養(yǎng)工藝進(jìn)行探索和研究，以M199為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入人血白蛋白、胎牛血清及HEPES緩沖液，并均加入碳酸氫鈉，配制培養(yǎng)基M1、M2和M3。將馴化獲得的CTNCEC25株按1∶5 000的比例接種于CECs懸液中，在不同培養(yǎng)條件下，通過單因素試驗(yàn)初步確定培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)溫度、接種MOI及培養(yǎng)時(shí)間4大工藝參數(shù)范圍，再以正交試驗(yàn)確定上述條件的最佳組合。單因素試驗(yàn)初步確定的工藝參數(shù)為：采用M2或M3培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度33~36℃，MOI=0.01~0.001 FFU／細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間72~120 h，可獲得較高的病毒滴度（7.0 lgFFU／mL以上）。正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件為：采用M3培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度33℃，MOI=0.01 FFU／細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間120 h，該工藝參數(shù)獲得的病毒滴度可達(dá)7.5 lgFFU／mL。優(yōu)化了CECs培養(yǎng)RV的工藝，CTNCEC25株的病毒滴度由約6.0 lgFFU／mL提高至7.0 lgFFU／mL以上，為疫苗生產(chǎn)獲得理想抗原量奠定了基礎(chǔ)。

3 原代狗腎細(xì)胞疫苗

1978年，荷蘭學(xué)者VAN WEZEL等［28］研制了一種原代狗腎細(xì)胞疫苗，生產(chǎn)用毒種為巴斯德PM人二倍體細(xì)胞適應(yīng)株。用6~9周齡beagle狗腎經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞，液氮凍存，建立原代狗腎細(xì)胞庫。用第2代細(xì)胞制備疫苗，細(xì)胞培養(yǎng)于含微載體的40立升培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃培養(yǎng)6~8 d，細(xì)胞濃度達(dá)106個(gè)／mL時(shí)接種病毒，置35℃再培養(yǎng)6 d，經(jīng)洗換后，間隔4~5 d收獲病毒液。病毒感染滴度為105.1~107.3LD50／mL。病毒液經(jīng)濃縮純化后，用β-丙內(nèi)脂滅活，加5%乳糖為穩(wěn)定劑制成凍干疫苗。在荷蘭用于人體暴露前和暴露后接種的觀察結(jié)果顯示，具有良好的效果并可與人二倍體細(xì)胞疫苗（HDCV）相比，但疫苗未大量生產(chǎn)和應(yīng)用。

UYTDEHAAG等［29］在1983年報(bào)道了一種用于獲得針對(duì)狂犬病病毒（DKCV）狗腎細(xì)胞疫苗的人類輔助抗體應(yīng)答的體外方法。DKCV在體外刺激了來自正常狂犬病免疫和非免疫供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)，通過ELISA監(jiān)測(cè)上清液中病毒特異性抗體的產(chǎn)生?？贵w是由狂犬病免疫個(gè)體的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，而非免疫個(gè)體的淋巴細(xì)胞在體外用DKCV刺激后始終未能產(chǎn)生抗狂犬病抗體。用DKCV刺激的淋巴細(xì)胞的抗狂犬病病毒抗體應(yīng)答的產(chǎn)生顯示為抗原依賴性以及抗原特異性的過程。在相對(duì)較低的抗原濃度（10-1～10-2μg／培養(yǎng)物）下，觀察到最佳的抗原特異性應(yīng)答。隨著培養(yǎng)物中抗原濃度的增加（每次培養(yǎng)大于1 μg），抗狂犬病病毒反應(yīng)受到抑制，刺激后產(chǎn)生的抗體能夠中和狂犬病病毒。

EGERT等［30］于1989年報(bào)道了巴斯德固定狂犬病病毒株（巴黎巴斯德研究所，兔腦第2 061代）通過交替?zhèn)鞔猎纺I細(xì)胞而適應(yīng)，適應(yīng)性強(qiáng)的狂犬病病毒命名為巴斯德·波茨坦（Pasteur Potsdam），未形成CPE，收獲4次，滴度為5.5～7.0 logMICLD50／mL。該菌株可在BHK21／S13、CER和N2a神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中生長(zhǎng)。在BHK21／S13細(xì)胞培養(yǎng)物中，病毒滴度為6.0～8.5 logMICLD50／mL。在SDS-PAGE中，其G蛋白遷移速度比ERA株快，滅活的抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生干擾素，該毒株通過抗狂犬病免疫球蛋白鑒定。收獲的病毒液顯示出0.4 IU／mL的抗原值。在對(duì)小鼠、大鼠、敘利亞倉(cāng)鼠和兔進(jìn)行皮下和腹腔接種，對(duì)敘利亞倉(cāng)鼠和大鼠進(jìn)行即時(shí)接種后，該病毒無致病性。

4 原代地鼠腎細(xì)胞疫苗

1958和1963年，KISSLING等［31-32］最先研究原代地鼠腎細(xì)胞（PHKC）培養(yǎng)疫苗；以后，F(xiàn)ENJE［33］用SAD株適應(yīng)原代地鼠腎細(xì)胞制成滅活疫苗，1968年，由加拿大批準(zhǔn)用于狂犬病的暴露前和加強(qiáng)免疫。

前蘇聯(lián)用Vnukovo-32株毒種在原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)制備疫苗。Vnukovo-32株的傳代適應(yīng)過程如下為：將SAD株（來源于1935年在Alabama一只狂犬病狗體分離的街毒）在小白鼠腦內(nèi)和PHKC交替?zhèn)?5代；在PHKC 37℃連續(xù)傳10代；在PHKC 32℃?zhèn)?3~178代，命名Vnukovo-32［34-36］。用第33～178代病毒制備主毒種和生產(chǎn)用毒種，感染細(xì)胞培養(yǎng)液的病毒滴度要求不低于104.5，病毒液經(jīng)紫外光照射滅活后制成凍干疫苗。疫苗有2種類型：一種是未濃縮純化的原制疫苗，一種是濃縮純化的疫苗。前者NIH效力要求不低于0.5 IU／mL，后者不低于2.5IU／mL；前者接種量為每次3 mL，根據(jù)暴露程度多次注射，一般接種10~25針；后者接種量為每次1 mL，按WHO推薦的6針法注射。該疫苗在前蘇聯(lián)和東歐許多國(guó)家廣泛應(yīng)用。據(jù)調(diào)查，在對(duì)約6萬名暴露后接種者的治療中，有4 416名證實(shí)為瘋動(dòng)物所咬傷，對(duì)嚴(yán)重咬傷的2 856名合并注射抗狂犬病球蛋白，結(jié)果除2例免疫不全者發(fā)病外均未得病。疫苗的效果還可從390名免疫者的抗體檢查結(jié)果得到證實(shí)，這些免疫者在開始疫苗接種后10 d內(nèi)可檢測(cè)到中和抗體，高峰在25~35 d，并至少能維持240~360 d。SELIMOV等［37］還報(bào)道對(duì)46名被確證為瘋狼咬傷者用PHKCV合并注射抗狂犬病球蛋白治療，觀察1~5年，未發(fā)生狂犬病者。

目前，原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的Vnukovo-32疫苗仍在俄羅斯使用［38，12］。

我國(guó)由衛(wèi)生部武漢生物制品研究所牽頭，長(zhǎng)春生物制品研究所、蘭州生物制品研究所和中國(guó)藥品生物制品檢定所等單位合作，于1965年開始用北京株狂犬病固定毒株，通過原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)傳代，研制成功一種原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗［39-41］。生產(chǎn)用毒種的傳代適應(yīng)培育分以下3個(gè)過程：①用北京株兔腦固定毒感染2~3周齡地鼠腎單層細(xì)胞，置36~37℃培養(yǎng)2周左右（期間換液1~2次），棄去上清液，將感染的單層地鼠腎細(xì)胞用胰酶消化制成細(xì)胞懸液，加適量正常新鮮制備的地鼠腎細(xì)胞懸液，混合后再培養(yǎng)2周。再按上述方法用胰酶消化，加入正常原代地鼠腎細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)（此法稱混合培養(yǎng)法），如此培養(yǎng)連續(xù)傳4代，病毒滴度達(dá)102~103。②將上述第4代病毒液直接種入5 d左右正常地鼠腎單層細(xì)胞，根據(jù)病毒繁殖高峰，取培養(yǎng)的病毒上清液，接種地鼠腎單層細(xì)胞，繼續(xù)傳代。病毒滴度在10代前一直較低，病毒繁殖高峰也長(zhǎng)達(dá)20 d左右。至37~43代期間，病毒滴度才上升至104~104.5，繁殖高峰縮短為8~10 d。傳至44代后，病毒滴度基本穩(wěn)定在104.5左右，繁殖高峰也穩(wěn)定在5~7 d。但繼續(xù)傳代至68代，病毒滴度未見上升，繁殖高峰也未見進(jìn)一步縮短。在整個(gè)傳代過程中均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變作用，將該株地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)株稱為“a”株。③為進(jìn)一步提高“a”株病毒滴度，將第55代“a”株病毒在豚鼠腦內(nèi)和地鼠腎細(xì)胞交替?zhèn)鞔?，結(jié)果在交替?zhèn)?代后，地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)液的病毒滴度提高至104.5~105.5或更高，將該株病毒稱為“aG”株，用于地鼠腎細(xì)胞組織培養(yǎng)疫苗的生產(chǎn)。將豚鼠腦毒種用60%甘油緩沖鹽水于-10℃以下保存，腦毒種的病毒滴度達(dá)108以上。“aG”株毒種的生物學(xué)特性和穩(wěn)定性經(jīng)與北京株固定毒比較，結(jié)果表明，“aG”株對(duì)小白鼠、豚鼠、家兔、狗、猴的外周神經(jīng)致病性幾乎完全喪失，中樞神經(jīng)的致病性明顯下降；毒種抗原性經(jīng)與北京株的交叉保護(hù)力和交叉中和試驗(yàn)表明，兩者的抗原性很相似，無明顯差異。用于制備疫苗的毒種為經(jīng)豚鼠腦內(nèi)傳代的毒種。

原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗后經(jīng)濃縮、純化、去佐劑等一系列工藝改進(jìn)和升級(jí)，目前仍在我國(guó)疫苗市場(chǎng)銷售和使用，原代地鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)的人用狂犬病疫苗從2015—2020年連續(xù)6年的批簽發(fā)量分別為80萬、80萬、100萬、120萬、63萬和105萬人份［42］，為預(yù)防我國(guó)人狂犬病發(fā)揮了積極作用。

5 結(jié)語

原代細(xì)胞是分解后組織的活細(xì)胞，通常以貼壁生長(zhǎng)的形式開始于體外細(xì)胞培養(yǎng)。如對(duì)于生產(chǎn)特定的生物制品是必要的，則需篩查所用動(dòng)物的病原微生物，降低生物制品被污染的發(fā)生頻率，一般使用SPF級(jí)別動(dòng)物。

原代細(xì)胞其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)為：①僅使用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基和牛血清即可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；②通常對(duì)多種病毒具有廣泛的敏感性，適合多種生物制品的生產(chǎn)；③質(zhì)量控制中不需考慮DNA殘留和致瘤性的問題。但其不足也很明顯：①感染源污染的風(fēng)險(xiǎn)比傳代細(xì)胞系高；②不同來源動(dòng)物培養(yǎng)物的質(zhì)量和病毒敏感性是可變的；③雖然非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)在過去被廣泛使用，但其在某些國(guó)家和地區(qū)已越來越難以獲得，而且有時(shí)使用這些動(dòng)物需證明是符合要求的；④原代細(xì)胞不能像傳代細(xì)胞系那樣進(jìn)行廣泛的測(cè)試［43-44］。

原代細(xì)胞在生物學(xué)，特別是病毒學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。幾十年來，不同來源的原代細(xì)胞一直被用于生產(chǎn)人用減毒和滅活疫苗。原代細(xì)胞具有對(duì)多種病毒廣泛敏感且制備相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，自20世紀(jì)50年代以來，一些原代細(xì)胞如猴腎細(xì)胞已被用于生產(chǎn)滅活和口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗，在控制脊髓灰質(zhì)炎方面取得了重大成就。另外，麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹和狂犬病等疾病也是通過廣泛使用原代細(xì)胞制備的疫苗而實(shí)現(xiàn)有效防控的，這些細(xì)胞包括雞胚以及猴、狗、兔和倉(cāng)鼠的腎臟等［43-44］。尤其是我國(guó)自主研發(fā)的乙腦減毒活疫苗［45］，采用原代地鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)，已有10個(gè)國(guó)家通過為約3億兒童接種乙腦疫苗控制了流行性乙型腦炎疫情，同時(shí)改進(jìn)了疫情監(jiān)測(cè)體系［46］。

雖然WHO對(duì)使用原代細(xì)胞生產(chǎn)生物制品持觀望態(tài)度，但在某些國(guó)家和地區(qū)，原代細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗類制品仍在市場(chǎng)流通，為人類疾病預(yù)防和控制發(fā)揮著積極的作用。