鼠疫疫苗的臨床應用及研究進展

魏東 綜述，王國治，趙愛華 審校

中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病和過敏原產(chǎn)品室衛(wèi)生部生物技術產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京102629

鼠疫（plague）是由鼠疫耶爾森菌（Yersina pestis）（簡稱鼠疫菌）引起的一種烈性傳染病，其傳染源主要是嚙齒動物，傳播媒介主要是鼠蚤。鼠疫對人類的影響至少有1 500年的歷史，對社會和經(jīng)濟均造成巨大影響［1-2］。歷史上的3次鼠疫大流行中有近2億人感染死亡，我國在3次流行中均發(fā)生了疫情，而且第3次大流行始于我國［3］。

目前，世界范圍內(nèi)鼠疫自然疫源地并未縮小，加上經(jīng)濟差異造成各國衛(wèi)生條件參差不齊，鼠疫仍時有暴發(fā)［4］。2017年8月，非洲馬達加斯加暴發(fā)了嚴重鼠疫疫情，8月1日—11月26日，感染2 414例，其中78%為肺鼠疫［5-6］。2019年11月，北京確診2例由內(nèi)蒙古輸入的肺鼠疫。因此，國際上將鼠疫稱為一種再發(fā)性疾?。?-9］。

為預防鼠疫，美國自1942年開始生產(chǎn)滅活全菌體鼠疫疫苗（Plague vaccine，USP），是將鼠疫菌195／P強毒株經(jīng)甲醛滅活處理制備而成。該疫苗有效性的間接證據(jù)是在越南戰(zhàn)爭中預防了美軍士兵腺鼠疫的發(fā)生。但該滅活疫苗副反應較大，而且對肺鼠疫預防作用較差［10-12］，在1999年停止生產(chǎn)［13］。

新研制的鼠疫亞單位疫苗處于臨床研究或臨床后上市審批階段，當前可及的人用疫苗主要是減毒活疫苗。1929年，GIRARD和ROBIC在馬達加斯加的一名鼠疫患者體內(nèi)分離到1株鼠疫菌，經(jīng)5年16~20℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)獲得EV減毒株。1936年，前蘇聯(lián)開始使用該疫苗，目前許多前蘇聯(lián)國家、中國及蒙古等國家仍使用鼠疫EV株減毒活疫苗［14-15］。

鼠疫傳染性強，病死率高，我國將其列為甲類傳染病之首，其也是國際上公認的致死性生物武器［16-17］，而且有可能出現(xiàn)抗生素耐藥菌株的感染［18-20］。近20年來，國內(nèi)外對鼠疫的基礎研究較為深入和充分，基本形成了以F1莢膜抗原（F1 capsular antigen，F(xiàn)1）和低鈣V反應抗原（low calcium response V antigen，LcrV或V）為鼠疫疫苗主要成分的共識。在動物試驗中，以這兩種抗原為主要成分的疫苗均顯示出較好的保護效果，可預防腺鼠疫及肺鼠疫［21-26］，部分疫苗已完成Ⅱ期臨床研究。本文就鼠疫減毒活疫苗的臨床應用及鼠疫亞單位疫苗的臨床研究進展作一綜述。后3個月的抗體陽轉(zhuǎn)率為5%～15%。使用250個最小致死量（minimum lethal dose，MLD）的鼠疫菌強毒株皮下感染，免疫后3、6個月的保護率分別為100%、75%。該結(jié)果表明，即使血清中未檢測到F1抗體，仍具有較好的保護效果，可能是鼠疫活疫苗誘導產(chǎn)生的復合抗體和細胞免疫發(fā)揮了保護作用。

1 減毒活疫苗

2 亞單位疫苗

2012年，F(xiàn)EODOROVA等［27］對鼠疫活疫苗免疫人群的長期血清學標志物進行了篩選，檢測血清來自5～30年內(nèi)多次免疫人員，距末次免疫4～30年。采用免疫印跡法進行抗體檢測，檢測用抗原為F1、LcrV、外膜蛋白分泌蛋白F（Yop secretion protein F，YscF）、外膜蛋白M（Yersiniaouter protein M，YopM）、纖溶酶原激活物（plasminogen activator，Pla）。針對F1、LcrV、YscF、YopM抗原的抗體陽性率分別為57%、26%、36%、10%，而針對Pla抗原的抗體陽性率高達82%。該研究表明，鼠疫活疫苗多次免疫可誘導長期的抗體應答，同時也為長期的免疫血清學監(jiān)測指標及新的鼠疫診斷方法提供了研究方向。

2014年，F(xiàn)EODOROVA等［28］對鼠疫活疫苗免疫后針對F1和YscF抗原的抗體亞類進行了分析，結(jié)果表明，針對F1抗原的抗體亞類主要是IgG1，此外，有少量的IgG2和IgG4。針對F1抗原的IgG1抗體可維持20年，表明該疫苗有很好的免疫持久性。針對YscF抗原的抗體亞類主要是IgG1，但未檢測到IgG2和IgG4抗體。這是首次對鼠疫活疫苗免疫后F1和YscF抗體亞類進行分析。

SAGIYEV等［29］對2014～2015年哈薩克斯坦阿拉木圖地區(qū)鼠疫活疫苗接種人群進行了免疫應答研究，將鼠疫活疫苗免疫493人，其中352人免疫1～4次，141人免疫5次以上。分別在末次免疫后4、8、12月，采用間接血凝法測定血清中針對鼠疫菌F1抗原的抗體滴度，以1∶160作為抗體陽性判定標準。結(jié)果表明，對于首次免疫人群，免疫后4、8、12月的抗體陽轉(zhuǎn)率分別為19%、8%、6%；對于多次免疫人群，抗體陽轉(zhuǎn)率分別為49%、23%、16%。國內(nèi)的晏慧芳［30］也曾開展鼠疫活菌苗接種人群血清學反應的研究，對F1抗體陰性人群分別在0和10 d進行鼠疫活疫苗皮上劃痕免疫，采用間接血凝試法測定血清中針對F1抗原的抗體，以1∶20作為陽性判定標準。免疫后1個月陽轉(zhuǎn)率僅為2%，免疫后3及6個月陽轉(zhuǎn)率均為0。該研究的血清學判定標準及檢測結(jié)果均低于SAGIYEV等［29］的數(shù)據(jù)。同時該研究進行了免疫豚鼠的抗體測定及保護力評價，免疫

近年來，鼠疫亞單位疫苗一直是研究熱點。其中除F1、V抗原外，YscF［31-32］也具有較好的保護效果。外膜蛋白YadC［33］及YopD［34］對F1抗原陰性的鼠疫菌具有一定的保護效果。pH6抗原（也稱PsaA）［35］、Pla［36］、其他幾種外膜蛋白（YpkA、YopE、YopH、YopK、YopN［34］、YopM［37］）、ATP結(jié)合盒蛋白轉(zhuǎn)運蛋白［ATP-binding cassette（ABC）transporter proteins］［38］等均無明顯保護作用。目前，進入臨床研究的鼠疫疫苗均以F1和V抗原為主要成分。

2.1 重組F1和V抗原疫苗 英國PharmAthene公司研制了由大腸埃希菌重組表達的F1和V抗原與氫氧化鋁組成的鼠疫疫苗。在Ⅰ期臨床研究中，分為4個劑量組，每種抗原劑量分別為5、10、20和40 μg，1、21 d各免疫1次。各劑量組針對F1和V抗原的抗體水平均在初次免疫后1個月左右達到高峰，隨后出現(xiàn)了降低的趨勢。各劑量組外周血中CD19+B、CD3+CD4+Th和CD3+CD8+CTL表達水平與免疫前無差異，但進行相應表型細胞數(shù)量測定之前未用抗原對細胞進行體外刺激。在被動免疫保護研究中，將各劑量組初次免疫后35 d的原倍血清以及分別混入25%、50%、75% PBS的血清經(jīng)腹腔注射BALB／c小鼠，注射體積均為0.5 mL，以鼠疫疫苗免疫食蟹猴獲得的血清為陽性對照。注射后2.5 h用10 CFU（相當于10 MLD）鼠疫菌GB株進行皮下感染，觀察期為10 d。結(jié)果表明，除5 μg劑量組外，其他劑量組均有一定的保護效果，但僅40 μg劑量組的保護水平與陽性對照血清相當，該劑量組的血清中混入25% PBS時，動物存活率為100%，而注射原倍血清的動物存活率為60%［39］。

為進一步評價該疫苗對氣溶膠感染的保護效果，GRAHAM等［40］對Ⅱ期臨床研究中40、80及120 μg劑量組人群免疫后35、196及365 d的血清進行被動免疫保護力研究。各劑量組均取混合血清250 μL經(jīng)腹腔注射BALB／c小鼠，3～6 h后用10.6～13.9半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）鼠疫菌CO92株進行氣溶膠感染。結(jié)果表明，免疫后不同時間點各劑量組血清免疫動物的死亡中位時間（median time to death，MTD）均顯著高于陰性血清對照組，MTD延長1～2 d，但不同劑量組間的MTD無顯著差異。對全部保護力試驗匯總結(jié)果的分析表明，MTD與F1和V抗體水平均有較好的相關性。同時，該研究比較了不同品系小鼠對被動保護評價的影響，在相同試驗條件下，Hsd：NIHS小鼠的MTD高于BALB／c小鼠，表明Hsd：NIHS小鼠可能更適于臨床血清被動免疫保護力的評價研究。

2.2 重組F1-V融合抗原疫苗 美國DynPortVaccine公司（DVC）研制了由大腸埃希菌重組表達的F1和V融合抗原與氫氧化鋁組成的鼠疫疫苗。該疫苗最初是由美國陸軍傳染病醫(yī)學研究所（United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases，USAMRIID）研制的［41］。研究用血清來自Ⅱa期臨床試驗中39名受試者，在3針次免疫（0、28、182 d或0、56、182 d）結(jié)束后14、28 d（196、210 d）采血。為滿足樣本使用量，將每名受試者196和210 d的血清進行等量合并。取0.5 mL血清，經(jīng)腹腔注射Swiss Webster小鼠，每名受試者血清注射10只小鼠為1個試驗組，24 h后用23 LD50（3～76 LD50）的鼠疫菌CO92株進行氣溶膠感染，全部血清的被動免疫保護試驗分3次進行。感染前2～3 h采集小鼠血清，測定針對F1抗原、V抗原及F1-V融合抗原的抗體水平。結(jié)果表明，35個試驗組中有3組小鼠存活率超過50%，各免疫組中位生存期（median survival time）為3.9～13.9 d，顯著高于陰性血清對照組（平均2.7 d）。小鼠的循環(huán)抗體水平與中位生存期相關性分析結(jié)果表明，第1次試驗中僅F1抗體水平與中位生存期顯著相關，第2次試驗中3種抗體水平均與中位生存期顯著相關，第3次試驗中V抗體及F1-V抗體水平均與中位生存期顯著相關。免疫人群血清中抗體水平與動物的中位生存期相關性分析結(jié)果表明，在后2次試驗中，免疫后196 d血清的3種抗體水平均與動物的中位生存期顯著相關。同時，該研究也比較了不同血清注射體積對中位生存期的影響。可能是由于動物數(shù)量原因，雖然中位生存期結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，但1 mL劑量組的中位生存期大于0.5 mL劑量組，這為后續(xù)研究提供了很好的啟發(fā)［42］。

2.3 重組Flagellin／F1／V融合抗原疫苗Flagellin／F1／V疫苗是大腸埃希菌重組表達的鞭毛蛋白-F1-V融合抗原組成的鼠疫疫苗，其中的鞭毛蛋白來自腸炎沙門菌，其去除了586～1 134位核苷酸編碼的超變區(qū)域［26］。鞭毛蛋白具有佐劑作用，其為TLR5激動劑，能誘導黏膜免疫及系統(tǒng)免疫應答［43-45］。

2017年，F(xiàn)REY等［46］報道了Flagellin／F1／V疫苗的Ⅰ期臨床研究結(jié)果。受試者為60名18～45歲健康人群，分別設置了1、3、6及10 μg抗原劑量組，0、28 d各免疫1次。免疫后均未出現(xiàn)嚴重副反應，能產(chǎn)生針對F1、V及鞭毛抗原的特異性抗體，具有較好的量效關系，但加強免疫后鞭毛抗原的特異性IgG抗體效價未見明顯增長。在細胞免疫應答檢測中，對外周血單個核細胞經(jīng)F1／V抗原體外刺激24 h后的培養(yǎng)上清進行細胞因子含量測定，但未檢測到細胞因子的明顯變化。

為進一步探索該疫苗的保護性相關免疫學指標，HAMZABEGOVIC等［47］對該疫苗Ⅰ期臨床研究樣本再次進行了檢測分析。將6及10 μg抗原劑量組免疫前、末次免疫后14、28 d的血清和外周血單個核細胞分別進行功能性抗體及T細胞免疫分析。在功能性抗體評價中，測定了血清中巨噬細胞保護性抗體活性，其原理為檢測血清中針對V抗原的抗體對表達V抗原重組假結(jié)核耶爾森菌的中和活性，測定的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）倒數(shù)水平越高，則對巨噬細胞保護力越強。結(jié)果表明，末次免疫后14、28 d，caspase-3倒數(shù)水平較免疫前分別增加29%、75%，而且，末次免疫后28 d的巨噬細胞保護水平與之前測定的血清V抗體效價顯著相關，但與F1抗體效價無關。在T細胞免疫評價中，對之前的檢測條件進行了優(yōu)化，外周血單個核細胞經(jīng)抗原體外刺激7 d后，進行T細胞的胞內(nèi)因子表達水平及培養(yǎng)上清中細胞因子含量測定，結(jié)果表明，末次免疫后28 d，CD4+T細胞表達IL-10、IL-4及共表達TNF-α和IFNγ的水平較免疫前顯著升高；末次免疫后14 d，培養(yǎng)上清中IFNγ水平較免疫前顯著升高。同時，該研究也發(fā)現(xiàn)，末次免疫后14 d，巨噬細胞保護水平與IFNG（IFNγ）基因表達正相關，與ENSG00000225107基因表達負相關。該研究為疫苗保護性相關指標的篩選提供了新的思路。

2.4 天然提取F1抗原和重組V抗原疫苗 蘭州生物制品研究所有限責任公司研制的鼠疫疫苗已經(jīng)完成Ⅱa期臨床研究。該疫苗由天然提取的F1抗原和大腸桿菌重組表達的V抗原組成，以氫氧化鋁為佐劑。受試者為240名18~55歲健康人群，分為15 μg及30 μg抗原劑量組。0、28 d各免疫1次，免疫后未出現(xiàn)嚴重副反應。F1抗體在免疫后6個月達到高峰，免疫后12個月仍高于56 d抗體水平。免疫后6個月及12個月30 μg劑量組的F1抗體水平顯著高于15 μg劑量組。V抗體在免疫后6個月顯著降低，兩個劑量組的抗體水平及陽轉(zhuǎn)率無顯著差異［48］。

2017年，焦磊等［49］對該鼠疫疫苗Ⅱa期臨床血清被動免疫保護力水平與抗體效價的相關性進行了分析，將BALB／c小鼠隨機分為6組：含5個不同效價F1抗體和V抗體血清免疫組及陰性對照組，每組10只，每只小鼠經(jīng)腹腔注射1.0 mL血清，各實驗組動物在注射血清3 h后分別用6 MLD鼠疫菌141株皮下感染，對照組用2 MLD感染，觀察期為14 d。結(jié)果表明，對照組小鼠感染后全部死亡，平均存活時間為6.5 d；不同效價（由低到高的順序）血清注射組的動物存活率分別為10.0%、0.0%、40.0%、40.0%、90.0%，小鼠平均存活時間分別提高至9.1、9.9、11.2、11.4、13.9 d，動物的存活率和平均存活時間與Fl和V抗體效價均顯著相關，表明該鼠疫疫苗Ⅱa期臨床試驗血清可對小鼠提供被動免疫保護。

3 展望

由于鼠疫發(fā)病率低，不能通過臨床試驗獲得鼠疫疫苗的有效性數(shù)據(jù)。針對此類無法完成臨床有效性研究藥物的上市審批問題，2002年美國FDA發(fā)布并實施了動物法則“Animal Rule”［50］。該法則規(guī)定，對于已完成臨床安全性評價，但由于倫理道德或不具有可行性等原因無法獲得臨床有效性數(shù)據(jù)的藥物，可在提供能夠推測人體有效性的動物藥效學研究結(jié)果基礎上申請直接上市使用。應用BioThrax炭疽疫苗進行炭疽暴露后預防是首次根據(jù)動物法則批準的增加適應癥類疫苗［51］。

現(xiàn)有研究表明，針對F1抗原、V抗原或F1-V融合抗原的單克隆抗體或多克隆抗體對小鼠的皮下感染、滴鼻感染以及氣溶膠感染均具有被動免疫保護效果［52-54］。小鼠被動免疫保護試驗的保護指數(shù)（mouse protection index，MPI）小于10曾是USP疫苗的效力評價指標［55］。使用鼠疫疫苗臨床受試者免疫血清進行小鼠被動免疫保護力評價是將動物保護力和人體免疫應答建立聯(lián)系的有效方法。當前進入臨床研究的鼠疫疫苗大都開展了臨床血清對小鼠的被動免疫保護力評價研究［39-40，42，49］。但需注意的是，被動免疫保護研究可能會過高要求保護所需的抗體水平，因為在主動免疫的保護作用中除循環(huán)抗體外，記憶B細胞免疫應答也發(fā)揮了重要作用［56］。此外，細胞免疫也是鼠疫疫苗發(fā)揮保護作用的重要因素［57-59］，單純的被動免疫保護力評價可能難以全面評估疫苗對人體的潛在保護效果。人與人之間傳播的肺鼠疫是通過呼吸道感染，因此鼠疫疫苗的主動保護力及被動保護力評價中感染方式應采用滴鼻或氣溶膠感染。2018年，WHO發(fā)布了鼠疫疫苗的目標產(chǎn)品概況文件（Target Product Profile for Plague Vaccines，TPP），用于指導鼠疫疫苗研制［60］。根據(jù)使用目的，鼠疫疫苗可分為常規(guī)預防及緊急預防用疫苗，其中緊急預防用疫苗應能夠誘導快速的保護性免疫應答。緊急情況下高危人群可能會使用抗生素進行預防性治療，因此以也應考慮進行鼠疫疫苗與抗生素的相互作用研究。研究表明，初次免疫和加強免疫使用不同種類疫苗的保護效果要好于同種疫苗免疫［61-62］。也可考慮聯(lián)合使用不同種類鼠疫疫苗進行初次免疫和加強免疫研究，如用鼠疫活疫苗進行初次免疫，再用重組亞單位疫苗加強免疫等。

鼠疫是一種自然疫源性疾病，但也可能被用作生物武器，隨著生物技術的快速發(fā)展，不排除耐藥菌或經(jīng)基因修飾后鼠疫菌被用于生物武器的可能。新型疫苗的研制，將對鼠疫的預防發(fā)揮重要作用。