集落刺激因子在助孕技術(shù)中的應(yīng)用

白瑜，靳松，楊業(yè)洲

集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)是促進髓系祖細胞增殖、分化的一組生長因子，包括巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF/CSF1)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF/CSF2)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF/CSF3)、多重集落刺激因子(multi-CSF/IL3)等，重組上市的商品化產(chǎn)品則稱之為相應(yīng)的形成細胞刺激因子。骨髓、間質(zhì)細胞、成纖維細胞、單核細胞和巨噬細胞均可產(chǎn)生CSF，重組的GM-CSF、G-CSF、M-CSF在血液系統(tǒng)疾病和防治腫瘤放化療不良作用等領(lǐng)域應(yīng)用已經(jīng)超過30年[1]。CSF與其受體(CSF-receptor,CSF-R)結(jié)合后發(fā)揮作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，除髓系祖細胞、髓系白血病細胞、成熟的中性粒細胞、血小板、單核細胞、淋巴細胞和一些T細胞和B細胞膜上表達特異性的CSF-R外，子宮內(nèi)膜上皮細胞、胎盤細胞、滋養(yǎng)細胞和黃素化的卵巢顆粒細胞等許多非造血組織細胞亦可表達CSF-R。CSF與生殖相關(guān)細胞上表達的受體結(jié)合后，參與卵泡發(fā)育、成熟及破裂排出，促進子宮內(nèi)膜的生長，介導(dǎo)母胎界面免疫調(diào)節(jié)，參與胚胎種植、發(fā)育及妊娠維持[2]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CSF中，除GM-CSF被用于胚胎培養(yǎng)成分來提高可利用胚胎形成率外，G-CSF在復(fù)發(fā)性卵泡黃素化不破裂綜合征(luteinized unruptured follicle syndrome,LUFS)、胚胎培養(yǎng)、薄型子宮內(nèi)膜、反復(fù)胚胎種植失敗(recurrent implantation failure,RIF)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent pregnancy loss,RPL)等生育障礙狀態(tài)的治療中得到了較多的試用。

1 卵泡黃素化不破裂綜合征

連續(xù)的超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育顯示卵泡生長，出現(xiàn)黃體生成素(lnteinizing hormone,LH)高峰后卵泡持續(xù)存在，血孕酮水平達到正常黃體期水平，可判斷為LUFS。在規(guī)律性月經(jīng)周期中，LUFS的發(fā)生率為5%～11%，在不孕患者中，LUFS的發(fā)生率為25%～43%，且發(fā)生LUFS后的下一個月經(jīng)周期，80%～90%的患者將再次發(fā)生LUFS。盆腔炎癥、子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔手術(shù)等均可導(dǎo)致LUFS發(fā)生。前列腺素合成或功能障礙可能是導(dǎo)致LUFS發(fā)生的主要分子水平機制。研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡發(fā)育過程中，主要由顆粒細胞產(chǎn)生G-CSF進入卵泡液，卵泡液中的G-CSF水平隨卵泡增大而升高，卵泡晚期達到高峰[3]，其作用是誘導(dǎo)單核細胞和巨噬細胞向卵泡聚集，促進單核細胞向巨噬細胞分化，巨噬細胞分泌蛋白酶導(dǎo)致卵泡壁破裂，卵-冠-丘復(fù)合體從卵泡中排出[4]。在確認LUFS后，應(yīng)在下一個月經(jīng)周期繼續(xù)進行卵泡發(fā)育監(jiān)測，卵泡直徑達到15 mm時檢測LH[5]，LH出現(xiàn)峰值或在給予hCG后，連續(xù)2～4天的B超檢查，卵泡持續(xù)存在，可診斷為復(fù)發(fā)性LUFS。對復(fù)發(fā)性LUFS，后續(xù)的促排卵應(yīng)首選hCG，卵泡平均直徑達到17～18 mm時給予尿源性或重組的hCG 5 000～10 000 IU。連續(xù)使用hCG促排卵3次均發(fā)生LUFS，最好建議患者接受腹腔鏡手術(shù)或體外受精-胚胎移植及其衍生技術(shù)助孕。若患者堅持繼續(xù)自然周期試孕或行人工授精，可在平均卵泡直徑達到16～17 mm時給予G-CSF 100 μg皮下注射，24～48 h后給予hCG 5 000～10 000 IU[3]，可將LUFS的發(fā)生率降低近3/4(4.3% vs 19.1%)[6]。

2 薄型子宮內(nèi)膜

薄型子宮內(nèi)膜目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，普遍認為是指卵泡晚期或使用雌激素準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜超過10天，B超下子宮內(nèi)膜厚度<7 mm。薄型子宮內(nèi)膜周期取消率高，胚胎種植率和臨床妊娠率降低，流產(chǎn)率增加。宮腔鏡排除宮腔粘連等器質(zhì)性病變后，可使用藥物來增加子宮內(nèi)膜厚度，臨床常試用的方法包括增加子宮局部雌激素水平(加大使用劑量或陰道使用雌激素制劑)、每日加用75～100 mg阿司匹林、維生素E、西地那非或他達那非、左旋精氨酸、己酮可可堿、干細胞療法、宮腔灌注富血小板血漿等[7]。G-CSF可能刺激子宮內(nèi)膜干細胞或動員骨髓干細胞而刺激內(nèi)膜生長，此外，內(nèi)膜祖細胞及單核細胞中促血管生成基因的表達增加，促進了內(nèi)膜局部血管生成[8]。控制性卵巢刺激下擬進行新鮮胚胎移植患者，若hCG扳機日的子宮內(nèi)膜厚度<7 mm，可在hCG注射前6 h左右使用人工授精管或胚胎移植管將100～300 μg的G-CSF注入子宮腔內(nèi)。采用自然周期或誘導(dǎo)排卵方案準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜行凍融胚胎移植期間，若卵泡平均直徑≥16 mm時的子宮內(nèi)膜厚度<7 mm，當(dāng)日可在宮腔注入100～300 μg G-CSF。行凍融胚胎移植應(yīng)用雌激素準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜期間，雌激素使用10天后的子宮內(nèi)膜厚度<7 mm，當(dāng)日可在宮腔注入100～300 μg G-CSF，2～3天后子宮內(nèi)膜厚度增加不明顯，可重復(fù)宮腔注入一次。臨床報道顯示G-CSF宮腔注入后，子宮內(nèi)膜厚度較未使用該藥人群增加1～4 mm，Meta分析后的OR值達到1.79(95%CI為0.92-2.67)[9]，效果較為肯定。

3 反復(fù)胚胎種植失敗

胚胎種植成敗受諸多因素影響，胚胎質(zhì)量、子宮內(nèi)膜容受性、胚胎-子宮內(nèi)膜界面的免疫學(xué)狀況等發(fā)揮著重要作用，目前應(yīng)對RIF的方法均從優(yōu)化這些方面著手。G-CSF除改善子宮內(nèi)膜厚度外，還可刺激胚胎分裂和囊胚形成以及滋養(yǎng)細胞生長，影響胚胎粘附于子宮內(nèi)膜而參與胚胎種植過程，抑制胚胎-子宮內(nèi)膜界面的淋巴細胞和巨噬細胞的免疫反應(yīng)，抑制Th1細胞分化和功能，刺激Th2細胞增殖分化及其功能表達，產(chǎn)生母胎免疫耐受，維持持續(xù)妊娠[10]。對RIF患者，若準(zhǔn)備進行鮮胚移植，可在控制性卵巢刺激注射hCG日或取卵結(jié)束后或胚胎移植前5～60 min使用G-CSF。自然周期或誘導(dǎo)排卵方案準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜行凍融胚胎移植時，G-CSF使用時間點則定在LH峰值日或排卵日或胚胎移植前5～60 min。應(yīng)用雌孕激素準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜時，則在加用孕激素轉(zhuǎn)換子宮內(nèi)膜當(dāng)日或在胚胎移植前5～60 min應(yīng)用G-CSF。單次宮腔內(nèi)注入G-CSF 100～300 μg，也可單次皮下注射G-CSF 300 μg，或每日皮下注射G-CSF 100 μg至確認妊娠或超聲確認宮內(nèi)活胎。Meta分析顯示，對兩次及以上胚胎移植后種植失敗者，使用G-CSF后臨床妊娠率是未使用該藥者的2.11倍(95%CI為1.56-2.85)[11]，效果肯定。

4 改善胚胎培養(yǎng)結(jié)局

自然妊娠時，胚胎先后經(jīng)過輸卵管、子宮腔和胚胎種植后發(fā)育階段。在子宮內(nèi)膜增殖期和分泌期，輸卵管和子宮內(nèi)膜上皮細胞均可產(chǎn)生GM-CSF，在增殖晚期和分泌早期達峰值水平。胚胎種植后，母體的蛻膜細胞和胎兒的絨毛細胞也可產(chǎn)生GM-CSF。人胚胎中的內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)外胚層均可生成與GM-CSF結(jié)合的α受體(granulocyte-macrophage receptor α,GM-Rα)。鼠胚實驗和人胚胎培養(yǎng)均觀察到，GM-CSF可促進胚胎細胞增殖，增加抗凋亡基因及其蛋白表達而抑制胚胎細胞凋亡，增加不同發(fā)育時期的胚胎細胞數(shù)量，減少胚胎細胞碎片，增加優(yōu)質(zhì)可利用胚胎數(shù)。GM-CSF也促進桑椹胚和囊胚分泌τ干擾素(interferon τ,IFNτ)，啟動早期胚胎滋養(yǎng)細胞分化形成和生長，參與胚胎種植，維持胚胎及胎兒發(fā)育[12]。使用含2 ng/mL的GM-CSF胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)后，8細胞胚、桑椹胚、囊胚、擴張期囊胚形成率增加[13]，非整倍體率和流產(chǎn)率呈下降趨勢，臨床妊娠率和活產(chǎn)率呈增加趨勢[14]。

5 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

正常妊娠有賴于胎盤的正常發(fā)育和功能表達以及母胎界面免疫耐受的適時調(diào)整維持。胎盤的蛻膜細胞、細胞滋養(yǎng)細胞、合體滋養(yǎng)細胞、淋巴細胞等均可產(chǎn)生CSF。所有的CSF均促進胎盤的生長和細胞分化。M-CSF在妊娠后的血清水平增加2倍，子宮局部水平增加1 000倍。GM-CSF和G-CSF在子宮局部水平也顯著增加[15]。GM-CSF促進細胞滋養(yǎng)細胞的遷移，促進桑椹胚和囊胚IFNτ分泌[16]。G-CSF增加蛻膜調(diào)節(jié)性T淋巴細胞和Th2細胞數(shù)量及其功能表達，增強RPL患者母胎界面免疫耐受，促進滋養(yǎng)細胞生成G-CSF和血管內(nèi)皮細胞生長因子，促進滋養(yǎng)細胞生長和血管形成[15,17]。對不明原因的RPL患者，可在排卵后6天或hCG檢測確認妊娠后，接受胚胎移植者自移植日開始給予G-CSF,100～150 μg皮下注射，每天1次，或每周皮下注射2次，每次150～300 μg。妊娠滿9～12周或發(fā)生難免流產(chǎn)時停藥。RPL者接受G-CSF治療后的流產(chǎn)率可降低2/3(17.2% vs 51.5%)，活產(chǎn)率增加近1倍(82.8% vs 48.5%)[18]。

6 圍妊娠期使用集落刺激因子的安全性

G-CSF是CSF中臨床應(yīng)用最多的藥物，主要用于惡性腫瘤放化療等導(dǎo)致的獲得性粒細胞減少癥。鼠和兔等動物實驗顯示，懷孕后使用人臨床常用劑量2～10倍的G-CSF，可增加流產(chǎn)率，降低子代存活率，但不增加子代出生后的結(jié)構(gòu)畸形[19]。惡性腫瘤放化療期間應(yīng)采取有效避孕措施，因放療和化療除對孕婦產(chǎn)生嚴重不良反應(yīng)外，還將增加胎兒發(fā)育異常及出生缺陷風(fēng)險。妊娠期間發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤，是否實施放化療，需根據(jù)疾病和妊娠期限等情況，本著“母親優(yōu)先”的原則決定?；颊邎猿掷^續(xù)妊娠且病情許可的情況下使用G-CSF治療放化療所致的粒細胞減少癥，流產(chǎn)、死胎以及存活胎兒結(jié)構(gòu)和功能缺陷風(fēng)險增加，這主要與放化療有關(guān)。單純使用G-CSF對圍孕期母兒影響的證據(jù)，來自使用G-CSF行外周血干細胞捐贈者。這些臨床報道證據(jù)顯示，圍妊娠期使用G-CSF，不增加出生缺陷、流產(chǎn)、孕產(chǎn)期并發(fā)癥和異常圍生兒結(jié)局發(fā)生率[19-20]。輔助生殖技術(shù)、薄型子宮內(nèi)膜、RIF和RPL等情況下應(yīng)用G-CSF，使用藥物種類較多，但使用G-CSF不增加該類人群不良反應(yīng)發(fā)生率[11,21]。

GM-CSF目前僅見添加到胚胎培養(yǎng)液中的文獻報道，對兩篇低質(zhì)量的RCT分析后顯示，胚胎非整倍體率呈下降趨勢(OR=0.32，95%CI為0.03-3.26)，出生缺陷呈增高趨勢(OR=1.33，95%CI為0.59-3.01)[14]。

7 用藥注意事項

① G-CSF在助孕技術(shù)的應(yīng)用為超藥典及藥品說明書適應(yīng)范圍用藥，應(yīng)該根據(jù)相關(guān)規(guī)定報醫(yī)院藥事委員會審定并獲得該領(lǐng)域的臨床試用備案。

② G-CSF為刺激粒細胞生成藥物，非先天性或獲得性粒細胞減少癥的患者可導(dǎo)致使用期間的粒細胞計數(shù)顯著增加，同時增加凝血酶原片段F1+2、凝血酶原-抗凝血酶原復(fù)合物及D二聚體等促凝指標(biāo)產(chǎn)物，增加深靜脈血栓形成風(fēng)險[22]。因此在用藥前及用藥后每3～7天必須進行包括粒細胞計數(shù)在內(nèi)的血常規(guī)檢查，一旦發(fā)現(xiàn)粒細胞計數(shù)超過20×109/L，立即停藥，一般在停藥后1周內(nèi)下降至正常。

8 小結(jié)及建議

在卵泡發(fā)育及排出、子宮內(nèi)膜增殖和轉(zhuǎn)換、胚胎發(fā)育并在子宮內(nèi)膜中成功種植、胚胎與胎盤生長、妊娠維持及分娩等過程中，來自卵巢、輸卵管、子宮內(nèi)膜局部和胚胎細胞通過自分泌和旁分泌途徑產(chǎn)生的細胞生長因子組成的網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。鑒于已有的臨床實踐，僅G-CSF在助孕技術(shù)尤其是薄型子宮內(nèi)膜、RIF和RPL中應(yīng)用較多，GM-CSF添加到胚胎培養(yǎng)液中并已經(jīng)上市成品試劑?？蓹z索到的多數(shù)文獻報道中，顯示G-CSF可增加子宮內(nèi)膜厚度，提高RIF臨床妊娠率和RPL的活產(chǎn)率，但也有隨機對照試驗結(jié)果顯示G-CSF不能改善這些臨床結(jié)局指標(biāo)，但這些文獻所提供的均為低或極低質(zhì)量的臨床證據(jù)[11]，因此尚需經(jīng)過嚴密設(shè)計、嚴格按設(shè)計方案施行的多中心大樣本臨床試驗來確定其臨床效果和安全性。在參考已經(jīng)發(fā)表的文獻來處理助孕技術(shù)中的相關(guān)問題時，使用包括G-CSF等藥物輔助治療，應(yīng)嚴格按照國家規(guī)定和專業(yè)組織制定的相關(guān)要求進行。