結(jié)核IgG 抗體檢測、T-SPOT 及痰結(jié)核分枝桿菌核酸檢測對骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷價值

鄢志輝，孫 立，簡月奎

（貴州省人民醫(yī)院骨科，貴州 貴陽 550002）

骨關(guān)節(jié)結(jié)核（osteoarticular tuberculosis）可引起嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞，出現(xiàn)關(guān)節(jié)或脊柱畸形，導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能喪失或肢體功能障礙，早期的診斷及治療至關(guān)重要[1-4]。結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)檢測是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)時間長[5]，而臨床急需能快速診斷的檢測技術(shù)。骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的檢測技術(shù)眾多，外周血結(jié)核感染T 淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）在輔助診斷結(jié)核患者的敏感性高，但是特異性低；血清結(jié)核分枝桿菌IgG 抗體（IgG 抗體）和痰結(jié)核分枝桿菌核酸檢測敏感性低。有研究發(fā)現(xiàn)IgG 抗體檢測技術(shù)準(zhǔn)確度低，誤診率和漏診率較高，建議臨床不應(yīng)繼續(xù)使用[6]。目前這三種檢測技術(shù)的臨床價值存在爭議[6-9]。本研究回顧性分析三種檢測技術(shù)的敏感性和特異性，比較在骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的臨床價值，為骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷提供臨床參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017 年1 月～2018 年10月在貴州省人醫(yī)院骨科確診為骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者病例資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理結(jié)果診斷為骨與關(guān)節(jié)結(jié)核或根據(jù)臨床病例資料，經(jīng)正規(guī)抗結(jié)核治療有效的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并布氏菌感染者；合并患惡性腫瘤者；免疫缺陷性疾病者或采用免疫抑制藥物史；正規(guī)抗結(jié)核治療后無法確診的病例及活動性肺結(jié)核患者。符合研究標(biāo)準(zhǔn)的患者共有196例患者，其中男性110例，女性86例；年齡11～84 歲，平均年齡42.00 歲。脊柱結(jié)核患者155例，關(guān)節(jié)結(jié)核患者41例。選取同時期非結(jié)核患者共69例，作為對照組；其中男性38例，女性31例；年齡7～73 歲，平均年齡為52.30 歲?；颊叨荚跈z驗(yàn)科完善外周血T-SPOT、血清結(jié)核IgG抗體及痰TB-DNA 三種檢查。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核感染T 淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn) 真空采血管采取外周血5 ml，放入15 ml 無菌離心管，加1640 培養(yǎng)液至10 ml，加入到淋巴細(xì)胞分離液，18 ℃2300轉(zhuǎn)離心22 min。將單個核細(xì)胞層從Ficoll 分離管中轉(zhuǎn)移到15 ml 尖底離心管，加入RPMI 1640 培養(yǎng)液至10 ml，18 ℃1900 xg 離心7 min。離心后去除上清，加入RPMI 1640，輕緩重旋細(xì)胞沉淀，加入1640培養(yǎng)液至10 ml，18 ℃1300 xg 離心7 min。再去除上清，加入0.5 ml AIM-V 培養(yǎng)液重旋細(xì)胞。1.5 ml離心管中加入10 μl 已制備樣品細(xì)胞懸液和40 μl的0.4%臺酚蘭，制備1∶5 細(xì)胞稀釋液；取10 μl 臺酚蘭/細(xì)胞混合懸液加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。試劑盒來自上海復(fù)星長征科學(xué)有限公司。根據(jù)抗原A 和B 孔的反應(yīng)判斷結(jié)果：當(dāng)陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5，陽性樣本應(yīng)為：（抗A 或抗B 斑點(diǎn)數(shù)）-（陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)）≥6；當(dāng)陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，陽性樣本應(yīng)為：（抗原A 或抗原B 斑點(diǎn)數(shù)）≥2×（陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)）。如果陽性對照孔結(jié)果良好，但抗原A 或抗原B 均達(dá)不到陽性樣本判斷標(biāo)準(zhǔn)，則結(jié)果為陰性。

1.2.2 結(jié)核分支桿菌IgG 抗體檢測 結(jié)核分枝桿菌IgG 抗體檢測試劑盒由芯片和試劑兩部分組成。芯片字系統(tǒng)為：TBO1A，采用南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的PBT-X4 型生物芯片識別儀分析。無抗凝真空采血管采集靜脈血清樣本，體積不少于150 μl。離心1000 rpm，10 min，吸取上清檢測；芯片上標(biāo)記樣品編號，在芯片盒窗口內(nèi)滴加200 μl 2%吐溫和Tris 緩沖液，使膜表面完全浸濕，室溫放置1 min，加檢測血清100 μl；血清完全滲入后，滴加300 μl 2%吐溫和Tris 緩沖液；完全浸入后，滴加金標(biāo)抗人IgG 500 μl；待完全浸入后，滴加2%吐溫和Tris 緩沖液300 μl。反應(yīng)完畢30 min 內(nèi)，將芯片和校正光盤分別放入生物芯片識別儀內(nèi)檢測。結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖（LAM），結(jié)核分支桿菌16KD 蛋白（16KD） 和結(jié)核分枝桿菌38KD 蛋白（38KD）抗原的IgG 抗體有任何一指標(biāo)為陽性時，該檢測方式結(jié)果為陽性。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌核酸PCR 檢測 清晨取肺深部咳出的痰液，至少5 ml。采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒。利用體外擴(kuò)增法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA。向玻璃管中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫放置20 min 待液化；取液化后標(biāo)本1.5 ml 離心管，12000 rpm 離心5 min；去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1 ml 混合均勻，12000 rpm 離心5 min；去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1 ml 混合均勻，12000 rpm 離心5 min；去上清，沉淀中加入50 μl DNA 提取液充分混合均勻，100 ℃恒溫處理10 min，12000 rpm 離心5 min。通過ABI Prism 7500 操作檢測。陰性質(zhì)控品為增長的曲線不呈S 型曲線或Ct 值=30；陽性質(zhì)控品為增長曲線呈S 型曲線，且強(qiáng)陽性質(zhì)控品定量參考值在1×106～2.0×107基因拷貝/ml 范圍。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并記錄結(jié)核IgG 抗體、T-SPOT及痰TB-DNA 的敏感性和特異性；其中敏感性為真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，特異性為真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。比較各種檢測方式的敏感性和特異性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測技術(shù)敏感性比較 三種檢測技術(shù)對196例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的敏感性，T-SPOT＞結(jié)核IgG 抗體＞痰TB-DNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=252.94，P=0.000）。

表1 三種檢測技術(shù)敏感性比較（n，%）

2.2 三種檢測技術(shù)特異性比較 三種檢測技術(shù)對69例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的特異性，痰TB-DNA＞結(jié)核IgG抗體＞T-SPOT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.670，P=0.000）。

3 討論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核起病隱匿，缺乏典型的全身結(jié)核中毒癥狀，早期的診斷和治療不及時，可引起嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞，具有較高的致殘率[10-13]。研究顯示[9]，T-SPOT檢測肺外結(jié)核患者的敏感性為90%，本研究發(fā)現(xiàn)三種檢測技術(shù)中，T-SPOT 在輔助診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中的敏感性高，為90.82%。本研究結(jié)果與既往研究相似。有研究顯示[14-16]，T-SPOT 檢測結(jié)核患者的總敏感性波動在76%～89%，另有文獻(xiàn)報道[17]，引起T-SPOT 檢測假陰性的高危因素有高齡，體重指數(shù)超過25 kg/m2，病程超過6 個月等。本研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT 檢測骨關(guān)節(jié)結(jié)核出現(xiàn)18例假陰性患者。這18例患者中，有6例患者年齡超過60 歲，與研究報道結(jié)論一致。還有4例患者因胸椎或腰椎結(jié)核術(shù)后取內(nèi)固定住院，入院后發(fā)現(xiàn)T-SPOT 檢測為陰性；這有可能是患者結(jié)核病灶治愈或體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌數(shù)量甚微，未引起特異的效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致檢測技術(shù)非陽性。

結(jié)核分支桿菌IgG 抗體檢測技術(shù)是定性檢測人血清樣本中結(jié)核分支桿菌16 KD 蛋白，脂阿拉伯甘露聚糖和38 KD 蛋白抗原的IgG 抗體。該檢測技術(shù)的核心是通過檢測免疫復(fù)合物。在骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者體內(nèi)持續(xù)存在結(jié)核分枝桿菌分泌抗原，與體內(nèi)的抗體特異性結(jié)合，產(chǎn)生免疫復(fù)合物，所以IgG 抗體檢測技術(shù)特異性較高。Bai XJ 等[18]回顧性分析2549例結(jié)核患者病例資料，發(fā)現(xiàn)IgG 檢測技術(shù)是一種經(jīng)濟(jì)且快速輔助診斷結(jié)核病的方式，尤其是在肺外結(jié)核患者中。但由于骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者長期慢性消耗，免疫力可能低下，加之抗結(jié)核藥物治療，體內(nèi)結(jié)核分支桿菌含量減少，影響特異性抗原分泌，故敏感性不高。

痰結(jié)核分枝桿菌核酸PCR 檢測的敏感性最低，只有13.27%。其原因有為本研究排除了合并有活動性肺結(jié)核的患者，且骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中肺部陽性結(jié)核分支桿菌的數(shù)量少，標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的活性差或數(shù)量少，難于出現(xiàn)陽性結(jié)果。此外，有文獻(xiàn)報道[19]，結(jié)核治療會迅速減少痰中結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量。本研究中手術(shù)患者術(shù)前已正規(guī)抗結(jié)核治療至少2 周，有可能影響痰中結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)量，導(dǎo)致該檢測結(jié)果為陰性。這三種檢測技術(shù)輔助診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的敏感性和特異性有差異。其中T-SPOT 檢測的敏感性最高，為90.82%，但T-SPOT 檢測特異性較低，故臨床工作中還需結(jié)合多種檢測技術(shù)。本研究具有一定的局限之處，這是一項(xiàng)回顧性研究，非結(jié)核組患者及T-SPOT 檢測的假陰性骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的樣本量過少。所以在后續(xù)的研究中，增加樣本量，設(shè)計(jì)前瞻性對照研究，進(jìn)一步探討三種檢測技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者診斷的臨床價值。

綜上所述，三種檢測技術(shù)的敏感性和特異性有顯著差異，其中T-SPOT 檢測敏感性最高，痰TBDNA 特異性最高，在快速診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核還需結(jié)合多種檢測技術(shù)。