BFAR 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系

程 哲，汪潮潮，吳 娟，王 棒，周星辰

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 蚌埠 233000）

膠質(zhì)瘤（glioma）為最常見的原發(fā)性中樞性神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，具有高致死致殘率[1-3]，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的發(fā)病率最高，占原發(fā)中樞系統(tǒng)惡性腫瘤的46.1%。盡管目前膠質(zhì)瘤的診療技術(shù)不斷更新，包括最大范圍內(nèi)的腫瘤切除術(shù)聯(lián)合放化療、基因靶向治療、免疫治療及電場(chǎng)療法等，但膠質(zhì)瘤患者平均生存期僅為12 個(gè)月，且5 年生存率不足5%[4-7]，因此，研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尤為重要。雙功能凋亡調(diào)節(jié)器（bifunctional apoptosis regulator，BFAR），其可以調(diào)控凋亡信號(hào)通路，一方面其能促進(jìn)Bcl-2 和Bcl-XL 的相互作用，同時(shí)其也可以直接或間接與Caspase-8 和Caspase-10 的前體作用，從而阻礙Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路[8]。研究表明[9]，BFAR 在組織中的表達(dá)具有高度特異性，在腦組織中為高表達(dá)。但目前關(guān)于BFAR 與起源于腦組織的膠質(zhì)瘤研究較少，基于此，本研究通過腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)來分析BFAR在膠質(zhì)瘤中組織標(biāo)本中的表達(dá)情況以及其與膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 使用癌癥基因組圖譜（cancer genome atlas，TCGA）在線數(shù)據(jù)庫(kù)（GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/） 分 析BFAR 在 低 級(jí) 別 膠 質(zhì) 瘤（LGG）及膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤（GBM）中的表達(dá)，應(yīng)用中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因圖譜（Chinese glioma genome atlas，CGGA，http：/www.cgga.org.cn）數(shù)據(jù)庫(kù)分析BFAR 在各個(gè)級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。

1.2 材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、T98 和LN229 由蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院腦神經(jīng)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；正常人腦星形細(xì)胞株NHA 購(gòu)于合肥希研生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 及胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Trizol試劑購(gòu)于上海Sangon Biotech 公司；RIPA、PMSF 試劑及BCA 試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；BFAR 及GAPDH 引物由上海Sangon Biotech 合成；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 及TransStart Tip Green qPCR Super Mix 購(gòu) 于TRANS 公司；BFAR、GAPDH 一抗購(gòu)于中國(guó)ABclonal公司；二抗（羊抗兔）購(gòu)于BIOMIKY 公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 濃度。根據(jù)試劑盒中步驟：在每個(gè)反應(yīng)中加入2.0 μg RNA，70 ℃溫浴3 min，取出后冷卻至室溫，加0.5 μl 逆轉(zhuǎn)錄酶后置于37 ℃水浴60 min。20 μl 反應(yīng)體系中含2 μl cDNA，在Roche Light Cycler96 儀器上進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)反應(yīng)，按照94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s。設(shè)3 個(gè)重復(fù)組，結(jié)果以2-ΔΔCT值計(jì)算。BFAR 及GAPDH 的引物如下：BFAR 正向，5'-GAGTTTGCTTGGGACTGGTTGGAG-3'，反 向，5'-GAGGCACGGTCTTCAGTTCACTTC -3'；GAPDH 正向，5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，反向，5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，以GAPDH 的mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參。

1.4 Western Blot 提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)蛋白質(zhì)濃度，配置8%的分離膠，5%的濃縮膠；每孔上樣10 μl，分別以濃縮膠80 V，30 min，分離膠120 V，1 h電泳；200 mA 濕轉(zhuǎn)2 h；1% BSA 室溫下封閉1 h；一抗：BFAR（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）4 ℃孵育過夜，二抗：1∶10000 室溫下孵育1 h；ECL 曝光顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用GrapPad Prism 8 及SPSS 17.0 軟件處理，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，生存分析采用Log-Rank 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BFAR 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況 基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，低級(jí)別膠質(zhì)瘤BFAR 的表達(dá)高于非瘤腦組織（P＜0.05）；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤BFAR 表達(dá)高于非瘤腦組織（P＜0.05），且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加，BFAR 的表達(dá)量增加，見圖1。

2.2 BFAR 在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后情況 BFAR 低表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者總體生存時(shí)間長(zhǎng)于BFAR 高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者（P＜0.05）；高表達(dá)BFAR 的高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者總體生存期短于低表達(dá)BFAR 的高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者（P＜0.05）；異檸檬酸脫氫酶（IDH）野生型膠質(zhì)瘤患者BFAR 表達(dá)高于IDH 突變型患者（P＜0.05）；非1p/19q 聯(lián)合缺失的膠質(zhì)瘤患者BFAR 表達(dá)高于1p/19q 聯(lián)合缺失的患者（P＜0.05），見圖2。

2.3 BFAR 在膠質(zhì)瘤中與凋亡相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性 基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，膠質(zhì)瘤中BFAR與抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1 表達(dá)及促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bad、Bim 表達(dá)密切相關(guān)（P＜0.05），見圖3。

2.4 BFAR 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)情況 BFAR 蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、T98 和LN229 中的表達(dá)比正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA 中高（P＜0.05）；定量PCR 顯示，BFAR mRNA 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、T98 和LN229 中的表達(dá)比正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA 中高（P＜0.05），見圖4。

圖1 BFAR 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況

圖3 膠質(zhì)瘤中BFAR 的表達(dá)與凋亡相關(guān)基因的關(guān)系

圖4 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中BFAR 表達(dá)情況

3 討論

膠質(zhì)瘤具有高度的侵襲性和致死性，雖然臨床上治療方式不斷更新，但患者的總體預(yù)后仍較差[10]。因此，在膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)藥物治療中需積極探索尋找新的基因或者通路來調(diào)控膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)及侵襲[11]。BFAR 為凋亡調(diào)控相關(guān)基因，然而有關(guān)其在膠質(zhì)瘤中的研究甚少。

本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，低級(jí)別膠質(zhì)瘤BFAR 的表達(dá)高于非瘤腦組織（P＜0.05）；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤BFAR 表達(dá)高于非瘤腦組織（P＜0.05），且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加，BFAR 的表達(dá)量增加；且BFAR 低表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者總體生存時(shí)間長(zhǎng)于BFAR 高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者（P＜0.05）；高表達(dá)BFAR的高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者總體生存期短于低表達(dá)BFAR的高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者（P＜0.05），提示膠質(zhì)瘤中BFAR 的表達(dá)情況可以作為其預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。異檸檬酸脫氫酶家族包括IDH1、IDH2 和IDH3這3 種異構(gòu)酶，膠質(zhì)瘤多伴有IDH1、2 的突變，而伴有IDH 突變的膠質(zhì)瘤患者往往預(yù)后較好[12]。少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中染色體1p/19q 聯(lián)合性缺失最為常見，1p/19q 聯(lián)合缺失的膠質(zhì)瘤患者總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期較長(zhǎng)[13-15]。大量研究表明膠質(zhì)瘤一旦合并IDH突變及1p/19q 聯(lián)合缺失其對(duì)放化療更敏感。本研究中異檸檬酸脫氫酶（IDH）野生型膠質(zhì)瘤患者BFAR表達(dá)高于IDH 突變型患者（P＜0.05）；非1p/19q 聯(lián)合缺失的膠質(zhì)瘤患者BFAR 表達(dá)高于1p/19q 聯(lián)合缺失的患者（P＜0.05），提示膠質(zhì)瘤中IDH 突變及1p/19q 聯(lián)合缺失可使膠質(zhì)瘤患者對(duì)放化療更敏感，因此BFAR 影響膠質(zhì)瘤預(yù)后很有可能與膠質(zhì)瘤的放化療相關(guān)。

BFAR 被認(rèn)為可以調(diào)控凋亡信號(hào)通路，一方面可以作用于抗凋亡相關(guān)基因，另一方面可以調(diào)控于促凋亡相關(guān)基因，其對(duì)凋亡信號(hào)的調(diào)控處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，膠質(zhì)瘤中BFAR 與抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1表達(dá)及促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bad、Bim 表達(dá)密切相關(guān)（P＜0.05），但關(guān)于膠質(zhì)瘤中BFAR 調(diào)控凋亡相關(guān)通路及基因的機(jī)制還需要大量基礎(chǔ)研究進(jìn)一步探索。此外，本研究結(jié)果顯示，BFAR 蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、T98 和LN229 中的表達(dá)比正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA 中高（P＜0.05）；定量PCR 顯示，BFAR mRNA 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、T98 和LN229 中的表達(dá)比正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA 中高（P＜0.05），提示BFAR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，BFAR 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)且與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，其中與促凋亡及抗凋亡相關(guān)基因表達(dá)關(guān)系密切。然而BFAR 在膠質(zhì)瘤中是如何調(diào)控凋亡通路及其與膠質(zhì)瘤的耐放化療之間的關(guān)系都需要進(jìn)一步的研究，其很有可能成為膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)基因。