腺苷酸環(huán)化酶毒素的生物特性及其在百日咳疫苗中的潛在應用

張學 綜述，江文文 審校

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南昆明650118

腺苷酸環(huán)化酶毒素（adenylate cyclase toxin，ACT）是在百日咳桿菌對數(shù)增長期培養(yǎng)基上清中發(fā)現(xiàn)并純化出來的，與細菌胞內腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）功能相似，可催化三磷酸腺苷（ATP）向環(huán)狀單磷酸腺苷（cAMP）轉化。在全細胞百日咳（whole cell per-tussis，wP）疫苗中也發(fā)現(xiàn)有 AC 活性的存在［1］，AC 與鈣調蛋白結合后，其酶活性可增加100 ~ 1 000倍，鈣調蛋白僅存在于真核細胞胞漿中，表明百日咳桿菌的AC 與真核細胞存在一定關系［2］，百日咳桿菌分泌的這種具有AC 活性的物質能穿透并進入真核細胞（吞噬細胞），使吞噬細胞內生成超生理水平的cAMP，從而降低吞噬細胞的殺菌能力。同時WEISS 等［3］將分離的1 株Tn5 轉座子突變百日咳桿菌株（BP348），即無AC 活性和溶血活性的百日咳桿菌感染幼鼠后，其對幼鼠的毒力損傷比常規(guī)百日咳桿菌大幅減弱，且10 d 內可迅速從小鼠肺部清除，表明ACT 是百日咳桿菌感染早期所必需的定植毒力因子［4］。

1 ACT 的生物特性

ACT 由百日咳桿菌CyaA 基因編碼表達，是其主要的致病因子之一，在百日咳桿菌感染呼吸道早期定植中發(fā)揮關鍵作用。ACT 全長含有1 706 個氨基酸，具有AC 活性和溶血素活性的雙重功能，其完整的活性依賴于賴氨酸?；D移酶（cyclolysin activating lysine acyltransferase，CyaC）基因編碼的 CyaC對ACT 的860 和983 位賴氨酸進行棕櫚酰化修飾。ACT 的N-末端364 個氨基酸殘基具有AC 活性，即腺苷酸環(huán)化酶域（adenylate cyclase domain，ACD）；C-末端 1 342 個氨基酸（365 ~ 1 706 位氨基酸殘基）負責AC 易位，具有溶血素活性，即溶血素域（hemolysin，Hly）［5］。ACD 在 C-末端 Hly 的輔助下進入靶細胞［6］，由胞內鈣調蛋白激活并催化ATP 向cAMP超生理水平生成［7］。Hly 由以下幾個區(qū)域組成：①易位域（translocation region，TR），即365~527 位氨基酸殘基，參與ACD 轉移至靶細胞過程，并可提高細胞膜的通透性，具有膜活性肽的特征；②疏水域（hydrophobic region，HR），即 528 ~ 710 位氨基酸殘基，插入細胞膜并形成陽離子孔［8］；③?；颍╝cylation region，AR），即711 ~ 1 005 位氨基酸殘基，包括影響ACT有效折疊和AC 域移位的兩個酰化位點（860 和983位賴氨酸）；④重復子毒素域（RTX domain，RD），即1 006 ~ 1 600 位氨基酸殘基，由富含甘氨酸和天冬氨酸的9 肽重復序列形成5 個區(qū)段，可與靶細胞受體結合，另外，RD 也是鈣離子結合位點，在鈣離子的存在下，9 肽重復序列進行有序折疊，使ACT 具有AC活性［9］；⑥C-末端分泌信號肽（secretion signal，S），由細菌Ⅰ型分泌系統(tǒng)（typeⅠsecretion system，TⅠSS）識別［10］。

ACT 在細菌胞質中經(jīng)CyaC 蛋白修飾為有活性的蛋白，破壞宿主固有免疫防御系統(tǒng)，穿透靶細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、嗜中性粒細胞及非吞噬細胞［11］，使靶細胞內產(chǎn)生大量的cAMP，進而損害吞噬細胞的殺菌能力［12］，使百日咳桿菌能夠在宿主呼吸道上定植。ACT 的AC 域易位進入表面有補體受體 3（CR3，CD11b ／ CD18）的靶細胞內分為兩步［13-14］：①ACT 與分散在脂質筏外部的受體 CD11b ／ CD18 結合，使 CD18 亞基的胞質尾部通過連接蛋白（talin）束縛在肌動蛋白細胞骨架上；②與受體結合后，ACT 的“易位中間體”插入細胞膜的脂質雙層，其中ACD 與Hly 一起滲透至細胞膜中，并參與瞬時打開Ca2+傳導路徑；細胞外的鈣離子流入細胞，誘導Ca2+依賴性鈣蛋白酶（calpain）活化，使 action 蛋白和 talin 蛋白裂解，ACT-CD11b ／ CD18復合物從肌動蛋白細胞骨架中釋放；ACT-CD11b ／CD18 復合物募集至富含膽固醇的脂筏（lipid raft）中，其豐富的膽固醇和有序排列的磷脂分子幫助ACD 直接易位至宿主細胞的細胞質區(qū)，ACD 在胞質側暴露后，駐留在細胞內的蛋白酶從ACT 上切下，經(jīng)鈣調蛋白（CaM）激活，催化ATP 向cAMP 超生理水平生成［15］。ACT 作用于巨噬細胞，通過 ACD 進入胞內催化ATP 產(chǎn)生大量cAMP 等機制直接減弱巨噬細胞黏附病原菌的能力［16］，還可觸發(fā)成熟的初級肺泡巨噬細胞分化為單核細胞樣細胞，抑制巨噬細胞的殺菌能力［17］。ACT 還可作用于 DCs，使 DCs 內的cAMP 濃度升高，高濃度的cAMP 通過增強絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化、抑制干擾素調節(jié)因子-1（inter-feronregulatory factor-1，IRF-1）和干擾素調節(jié)因子-8（interferon regulatory factor-8，IRF-8）的表達，進而促進免疫抑制細胞因子白介素-10（interleukin-10，IL-10）的增多，并抑制促炎因子IL-12p70 生成［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，ACT 通過激活半光氨酸天冬氨酸酶（caspase-1）和胞內危險信號［19］，如細菌穿孔毒素應答的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，誘導DCs 產(chǎn)生和分泌IL-1β，使T 細胞應答向輔助性 T 淋巴細胞 17（T helper cell 17，Th17）型轉變；ACT 通過破環(huán)DCs 介導百日咳桿菌免疫逃逸，同時減弱Th1，增強Th17 型應答，后者應答過強時，可能會加重肺部炎癥和損傷。另外，中性粒細胞也是ACT 攻擊的目標。在小鼠呼吸道攻毒模型中，ACT通過誘導胞內cAMP 信號轉導及巨噬細胞環(huán)氧化酶-2（cyclooxy-genase-2，COX-2）的表達，從而釋放具有趨化性的前列腺素，并在上皮DCs 細胞膜上形成的陽離子通道，隨后鉀離子外流、形成NALP3 炎癥小體復合物、活化caspase-1、釋放促炎因子IL-1β，從而招募中性粒細胞到達感染部位成為ACT 的攻擊目標［20］。ACT 除了能損傷固有免疫反應的相關細胞，還能作用于適應性免疫反應的T 細胞。低濃度ACT 使 T 細胞分泌 IL-4、IL-13 等 Th2 型細胞因子，抑制 IFNγ 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等Th1 型細胞因子的生成，使T 細胞向Th2細胞分化，促進Th1 ／ Th2 平衡向Th2 偏移。大量的ACT 則可阻礙T 細胞活化，抑制T 細胞應答。ACT與 T 細胞上免疫突觸（immunological synapse，IS）位置的淋巴細胞功能相關抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）相互作用，使 LFA-1 過早脫離，并伴隨talin 蛋白的斷裂消失；IS 處是T 細胞受體（T cell receptor，TCR）和其他關鍵受體（如CD4／CD8、CD28 和LFA）微調和集成去驅動T 細胞活化的部位，因此該部位生成的cAMP 可有效地靶向T 細胞活化的途徑，抑制T 細胞活化［21］。

綜上所述，百日咳桿菌的AC 通過破壞固有免疫反應相關細胞和T 細胞來延遲細菌的清除和免疫記憶的發(fā)展。因此，在研發(fā)下一代百日咳疫苗時既要考慮引起機體的體液免疫，還要考慮激發(fā)特異性T細胞免疫來對抗病原菌［22-23］。

2 ACT 在百日咳疫苗中的潛在應用

2.1 作為保護性抗原的潛在價值 有研究表明，無論是主動免疫wP 疫苗，還是自然感染的人群血清中均存在一定的ACT 抗體［24］。ACT 作為百日咳桿菌的一個毒力因子，不僅在細菌感染宿主的早期階段發(fā)揮重要作用，也是一個潛在保護性抗原。ACT 的保護性免疫原性依賴于CyaC 對983 位賴氨酸的修飾，可能是由于修飾的區(qū)域是免疫優(yōu)勢表位的一部分或CyaC 介導的修飾影響了分子構象，從而暴露出免疫優(yōu)勢表位［25］。全長ACT 作為抗原對機體有一定的保護作用，但ACT 本身的毒性（AC 活性）使其在疫苗應用方面受到一定限制。BETSOU 等［26］將天然ACT、重組ACT、ACT828-887（刪除ACT 的828 ~ 887 位氨基酸）、ACT385-828（刪除ACT 的385 ~ 828 位氨基酸）、ACT385-1489（刪除ACT 的385 ~ 1 489 位氨基酸）、ACTC1307（刪除 ACT 的 401 ~ 1 706 位氨基酸）、ACT217（刪除ACT 的1 499~1 706 位氨基酸）免疫的小鼠為實驗組，以未經(jīng)免疫的小鼠為對照組，用百日咳桿菌活菌的亞致死量對小鼠進行鼻內攻擊，結果表明，活菌攻擊6 d 內，對照組小鼠肺部的活菌迅速定植并繁殖，而天然ACT 和重組ACT 免疫的小鼠肺內基本無百日咳桿菌繁殖，且3 d 后肺內百日咳桿菌迅速減少，截短的重組ACT 衍生物與對照組相似。WANG 等［27］用抗體噬菌體展示文庫發(fā)現(xiàn)，抗體主要結合于ACT 的C-末端RTX 域，RTX 域具有免疫優(yōu)勢，能誘發(fā)中和抗體，封閉受體結合位點，表明RTX 域的結構完整性對其保護活性至關重要。另外還發(fā)現(xiàn)，用ACT 免疫的小鼠血清抗體可識別RTX域中兩個新的不重疊中和表位，阻止了ACT 與小鼠單核巨噬細胞（J774A.1）結合，且RTX 域免疫小鼠的血清與ACT 免疫小鼠血清有相似的中和活性。對這兩個表位的準確位置進行定位發(fā)現(xiàn)，RTX751（751 ~ 1 706 位氨基酸殘基）與這兩個表位的單克隆抗體親和力最佳［28］。將RTX751 添加至適當劑量的無細胞百日咳（acelluar pertussis，aP）疫苗中，能增強小鼠抵抗百日咳桿菌感染的能力［29］。上述結果提示，在下一代aP 疫苗中，可考慮用RTX751 作為一種保護性抗原。

2.2 ACT 對共給抗原的佐劑效應 對wP 疫苗和aP 疫苗免疫后所引起的免疫反應類型分析表明，wP疫苗主要引起Th1 ／ Th17 細胞免疫，而aP 疫苗引起Th2 ／ Th17 型免疫［30］。ROSS 等［30］研究表明，在抵御百日咳桿菌的感染病程中，Th2 細胞免疫是非必須的，而誘導特異的Th1 型細胞免疫對百日咳的預防保護效果是重要的，在下一代aP 疫苗中應加入能誘導Th1 細胞免疫的佐劑，以此來提高aP 疫苗的保護效果。ACT 與百日咳桿菌的其他抗原組分共同免疫小鼠時，所得相應抗體水平均比單獨使用這些抗原組分產(chǎn)生的抗體水平高。鑒于ACT 本身的毒性，MACDONALD-FYALL 等［31］通過基因技術在 ACT 蛋白的第188 和189 位氨基酸之間插入亮氨酸-谷氨酰胺二肽，得到一種無AC 活性的ACT 蛋白（ACT*）；CHEUNG 等［32］分別用 ACT、ACT*、翻譯后未修飾的ACT（前體 ACT）、翻譯后未修飾的 ACT*（前體 ACT*）聯(lián)合aP 疫苗免疫小鼠，結果表明，與其他3 種蛋白比較，ACT*的佐劑效果最佳，可顯著降低小鼠肺部定植的細菌數(shù)量，增加血清PRN 的IgG2a 抗體水平，促進脾細胞分泌大量IL-5、IL-6、IFNγ、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage-stimulating factor，GM-CSF）等細胞因子，還可促進巨噬細胞產(chǎn)生更高的NO 水平，表明aP 疫苗聯(lián)合ACT*可將免疫反應從典型的Th2 型轉變?yōu)榛旌系?Th1 ／ Th2 型反應，增強 aP 疫苗的保護力。另外，ACT*還能誘導DCs 成熟，使其發(fā)揮免疫相關功能［33］。因此，ACT*作為一種新型的aP 疫苗佐劑，具有良好的應用前景。

3 小 結

ACT 是百日咳桿菌的關鍵毒力因子之一，其免疫調節(jié)作用復雜且具有雙向性，一方面ACT 破壞宿主免疫細胞，協(xié)助百日咳桿菌逃脫宿主免疫系統(tǒng)的攻擊；另一方面ACT 類毒素可誘導保護性免疫應答。通過在ACT 的N-末端插入二肽，獲得無（或低）AC 活性的ACT*作為佐劑，當其與aP 疫苗共同免疫小鼠時，可提高其他抗原的免疫原性，影響輔助性T 淋巴細胞的分化，協(xié)助aP 疫苗清除小鼠肺部定植的百日咳桿菌。因此ACT 有望成為aP 疫苗的候選組分，但其免疫原性、持久性和免疫效果尚需進一步深入研究。