脊髓灰質(zhì)炎疫苗的研究進(jìn)展

劉悅越，趙榮榮 綜述，李長貴 審校

中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室，北京102629

脊髓灰質(zhì)炎（以下簡稱脊灰）是由3 種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus，PV）引起的急性傳染病，嚴(yán)重危害兒童健康。在疫苗問世之前，脊灰是兒童終身殘疾的主要原因，疫苗是預(yù)防脊灰最經(jīng)濟(jì)有效的手段。世界衛(wèi)生大會于1988 年提出全球徹底消滅脊灰的目標(biāo)，通過全球范圍持續(xù)有效地接種疫苗，每年的脊灰病例數(shù)已從1988 年的350 000 例降至2020 年的140 例，疾病流行的國家也從125 個減少至 2020 年的 2 個（阿富汗和巴基斯坦）［1］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分別于2015 和2019 年宣布確認(rèn)全球已消滅Ⅱ型和Ⅲ型脊灰野病毒，目前報(bào)告的野病毒病例均由Ⅰ型病毒引起［2-3］。隨著全球根除脊灰進(jìn)入關(guān)鍵的最后階段，疫苗接種是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的關(guān)鍵措施，針對傳統(tǒng)疫苗的局限性，國內(nèi)外研究者進(jìn)行了深入和廣泛的新型疫苗研發(fā)。本文就脊灰疫苗的應(yīng)用現(xiàn)狀和研究進(jìn)展作一綜述。

1 傳統(tǒng)疫苗

由喬納斯·索爾克研發(fā)的三價(jià)脊灰滅活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine，IPV）于 1955 年在美國上市。隨后，由阿爾伯特·薩賓研發(fā)的3 種單價(jià)口服脊灰減毒活疫苗（oral poliomyelitis vaccine，OPV）分別于1961 和1962 年在美國獲得許可使用，三價(jià)OPV（trivalent OPV，tOPV）于 1963 年問世［4］。IPV和tOPV 是全球免疫接種的主要疫苗，尤其是tOPV，因其具有優(yōu)越的免疫原性，口服接種方便，可誘導(dǎo)黏膜免疫等優(yōu)點(diǎn)，成為全球根除脊灰行動（Global Polio Eradication Initiative，GEPI）的首選疫苗。隨后，由于Ⅱ型野病毒被消滅，tOPV 引起的Ⅱ型疫苗相關(guān)性麻痹性脊灰（vaccine associated paralytic poliomyelitis，VAPP）病例和傳染性循環(huán)疫苗衍生脊灰病毒（circulating vaccine-derived poliovirus，cVDPV）凸顯出來，因此，自2016 年4 月起，全球停止使用含Sabin Ⅱ型病毒株的tOPV，轉(zhuǎn)換為二價(jià)OPV（bivalent OPV，bOPV，Ⅰ型和Ⅲ型）。

1.1 OPV OPV 是由脊灰野病毒株經(jīng)細(xì)胞傳代使病毒毒力減弱，通過篩選得到疫苗株，制成的脊灰減毒活疫苗。OPV 含有減毒的活病毒，能夠激活接種者體內(nèi)免疫反應(yīng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但不致病，從而起到有效預(yù)防脊灰的作用。與IPV 相比，OPV 具有生產(chǎn)成本低，口服給藥更容易等優(yōu)點(diǎn)。OPV 能夠在腸道內(nèi)復(fù)制，誘導(dǎo)黏膜免疫，不僅限制脊灰病毒感染和疾病，還能阻斷病毒的傳播。因此，接種OPV是終止脊灰病毒傳播的主要策略，已成為全球根除脊灰的主要手段。雖然OPV 的使用使世界上大多數(shù)國家和地區(qū)已中斷了脊灰病毒的傳播，但疫苗病毒株基因組中的減毒位點(diǎn)有可能會發(fā)生回復(fù)突變，從而引起VAPP 或?qū)е耤VDPV 傳播。監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，90%以上的cVDPV 病例由Ⅱ型脊灰病毒疫苗株突變引起［5］。對于cVDPV2，唯一有效的控制方法是使用儲存的單價(jià)Ⅱ型OPV（monovalent OPV type 2，mOPV2）。但接種 mOPV2 又有可能引起新的cVDPV，尤其是在常規(guī)免疫中OPVⅡ型成分被停止使用后人群黏膜免疫力下降的情況下，引發(fā)進(jìn)一步的疫情。由疫苗本身衍生的突變病毒株引起的疾病暴發(fā)，已成為全球消滅脊灰面臨的一個主要問題。

1.2 IPV IPV 是由篩選出的野病毒株經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后滅活制成的三價(jià)疫苗。其可作為單苗獨(dú)立使用，也可與一種或多種其他抗原如百白破或b 型流感嗜血桿菌聯(lián)合配制。IPV 具有較好的安全性，不會引起VDPV 和VAPP，能夠激活機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。但I(xiàn)PV 在誘導(dǎo)腸道黏膜免疫方面不如OPV 有效。在瑞典進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明，接種者在接種4劑IPV 后，體內(nèi)未檢測出腸道中和抗體及IgA，采用口服mOPV1 的方式模擬攻擊后，檢測出11 ～17 d排毒［6］，表明IPV 無法有效阻止病毒傳播。另外，IPV 的生產(chǎn)成本高，需要的生產(chǎn)設(shè)備生物安全等級更高。在全球消滅脊灰后，世界范圍的常規(guī)免疫用疫苗將全部轉(zhuǎn)向IPV，但在全球范圍內(nèi)提供IPV 所需的生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大是亟待解決的問題。而且，IPV的生產(chǎn)用毒株為野毒株，在生產(chǎn)過程中有很大的生物安全隱患。這些問題均提示，迫切需要研發(fā)新的疫苗以推進(jìn)脊灰根除的行動。

2 新型疫苗研究策略

2.1 Ⅱ型新型脊灰減毒活疫苗（novel OPV2，nOPV2）nOPV2 是在脊灰疫苗Sabin 株Ⅱ型病毒的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)對其進(jìn)行改造制成的［7］。研發(fā)者在Sabin 2 基因組5′非翻譯區(qū)的減毒決定簇V 結(jié)構(gòu)域（V domain，domV）引入修飾，以使其更加穩(wěn)定，防止回復(fù)突變；將cre 從正常的2C 位置移至5′非翻譯區(qū)，以防止nOPV2 domV 與共同傳播的腸道病毒發(fā)生基因重組；改造病毒聚合酶編碼區(qū)，以促進(jìn)病毒復(fù)制的保真性，防止回復(fù)突變和重組。通過以上改造，nOPV2 保留了Sabin 2 的抗原和免疫原性，同時提高了其安全性，具有遺傳穩(wěn)定性。而且，在產(chǎn)量方面，nOPV2 與常規(guī)的 Sabin OPV2 相似，因此，具有與常規(guī)OPV 相似的節(jié)約成本的優(yōu)點(diǎn)［8］。

研究者利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型評估該疫苗誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)的能力，接種1 劑nOPV2 或常規(guī)Sabin OPV2 后的血清轉(zhuǎn)換率均為75% ～100%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）［8］。在比利時進(jìn)行的關(guān)于nOPV2的臨床研究中，曾接種過IPV 的成年人再接種1 劑nOPV2，83%的接種者免疫后1 個月抗體水平升高4倍，人群平均中和抗體水平較免疫前升高8 倍。采用深度測序技術(shù)對接種者排出的病毒進(jìn)行序列分析，未發(fā)現(xiàn)domV 發(fā)生突變，表明該疫苗在預(yù)防小兒麻痹癥方面安全有效，同時降低了在免疫不足人群中轉(zhuǎn)化成 VDPV 的風(fēng)險(xiǎn)［9］。

WHO 資格預(yù)審（Pre-Qualification，PQ）計(jì)劃已于2020 年11 月13 日針對nOPV2 發(fā)布了緊急使用清單（Emergency Use Listing，EUL）建議［10］，意味著nOPV2 已成為GPEI 在cVDPV2 控制策略中的備選工具。這也是WHO 首次將未經(jīng)許可的疫苗通過其EUL 程序。

2.2 Sabin IPV（sIPV） 與常規(guī)IPV 的毒種是野毒株不同，Sabin IPV 是由穩(wěn)定的 ／ 減毒的脊灰病毒疫苗株制成的。首個Sabin IPV 于2012 年在日本上市［11］。我國自主研發(fā)的Sabin IPV 也于2015 年獲批上市，目前已成為我國計(jì)劃免疫用疫苗的主力軍。Sabin IPV 以減毒的疫苗株作為病毒種子，降低了生產(chǎn)時的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，從而降低了對生產(chǎn)設(shè)施的生物安全要求，提高了其在不同國家和地區(qū)的生產(chǎn)可及性。

近期在中國進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)對照研究表明，接種3 劑sIPV 后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型血清陽轉(zhuǎn)率分別為99.5%、98.6%和99.6%，對照組常規(guī)IPV 免疫后的血清陽轉(zhuǎn)率分別為99.3%，97.0%和99.6%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），且sIPV 組的抗體水平均顯著高于常規(guī)IPV 組［12］。一項(xiàng)國外研究對比了接種3 劑sIPV 或常規(guī)IPV 后，血清中針對Sabin 疫苗株和野毒株的中和抗體，sIPV 組的血清陽轉(zhuǎn)率達(dá)95.8%～99.2%，與常規(guī)IPV 組的94.8%～100%相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。類似的很多研究表明，sIPV 的免疫原性不亞于常規(guī)IPV，且具有良好的安全性［13］。在全球根除脊灰的最后階段，WHO 鼓勵發(fā)展sIPV，使其成為在中低收入國家生產(chǎn)和使用的候選苗之一，以減少從設(shè)施獲得的脊灰病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP） VLP 是通過表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，并自行組裝形成的不含病毒核酸、不能自主復(fù)制的病毒樣蛋白顆粒。VLP 具有與天然病毒顆粒相似的空間構(gòu)象，但缺乏基因組，不能復(fù)制、突變或重組，因此，其作為安全且廉價(jià)的潛在候選疫苗十分具有吸引力。目前已有上百種VLP 被成功表達(dá)，成為病毒性疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)，如已上市的乙型肝炎病毒疫苗、戊型肝炎疫苗和重組人乳頭瘤病毒疫苗［14-16］。PV VLP已在許多不同的表達(dá)系統(tǒng)中被成功表達(dá)，包括哺乳動物細(xì)胞、植物、昆蟲和酵母等［17-20］。

重組產(chǎn)生的PV VLP 存在的固有問題是自然產(chǎn)生的病毒顆粒不如天然病毒穩(wěn)定，空顆粒具有從D抗原轉(zhuǎn)變?yōu)镃 抗原形式的趨勢［17］，但只有D 抗原才能激活機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。研究證實(shí)，位于PV VP1 的疏水性裂隙中的口袋因子有助于維持衣殼的穩(wěn)定性，但在很多表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的VLP 缺乏該口袋因子［21］。但最近的研究表明，通過表達(dá)突變體添加口袋因子可使VLP 的D 抗原穩(wěn)定，維持天然構(gòu)象［22］。

成功表達(dá)的穩(wěn)定PV VLP 具有與天然病毒相同的D 抗原構(gòu)象，與IPV 一樣具有免疫原性和有效性。MARSIAN 等［18］在植物系統(tǒng)中合成穩(wěn)定的PV VLP，對攜帶人PV 受體基因的小鼠進(jìn)行免疫，產(chǎn)生的中和抗體水平與常規(guī)IPV 相當(dāng)，且可保護(hù)小鼠免受野生型PV 的攻擊。研究者們在其他表達(dá)系統(tǒng)如畢赤酵母、BHK-21 哺乳細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞中通過基因突變均能表達(dá)出穩(wěn)定的PV VLP，使其在結(jié)構(gòu)上與野病毒幾乎無區(qū)別，在免疫原性上與常規(guī) IPV 相當(dāng)［17，19-20］。VLP 成為脊灰根除后時代更安全的非感染性疫苗候選物。

2.4 佐劑 佐劑是新型疫苗研究的熱點(diǎn)。通過添加佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫原性可減少誘導(dǎo)保護(hù)性抗體達(dá)到保護(hù)水平所需的疫苗抗原劑量，從而降低生產(chǎn)成本。氫氧化鋁佐劑是使用廣泛的疫苗佐劑。在巴拿馬和菲律賓進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中，研究者將接種人群分為兩組，一組接種常規(guī)IPV，一組接種含有氫氧化鋁佐劑的IPV，后者的D 抗原含量僅為前者的1 ／ 10，結(jié)果顯示，接種后兩組的血清轉(zhuǎn)換率無顯著差異，安全性也相當(dāng)［23-24］。表明氫氧化鋁佐劑能夠加強(qiáng)機(jī)體對疫苗的免疫應(yīng)答，是生產(chǎn)新型低成本IPV 的方法之一。

其他新型佐劑也是近年來研究的重點(diǎn)。近期的一項(xiàng)研究表明，CP971P 與MF59 混合形成的佐劑化合物KML05，可在大鼠模型中提高sIPV 的免疫原性，在誘導(dǎo)相當(dāng)水平的保護(hù)性抗體的前提下，KML05佐劑可將sIPV D 抗原用量降至不用佐劑時的1 ／ 8，且刺激的中和抗體效價(jià)能夠保持更長時間［25］。DIETRICH 等［26］用 CAF01 配制的 IPV 接種小鼠，發(fā)現(xiàn)CAF01 可影響針對IPV 的細(xì)胞和體液反應(yīng)的動力學(xué)，從而產(chǎn)生更快、更強(qiáng)的反應(yīng)；另外，通過肌內(nèi)和皮內(nèi)同時注射含CAF01 的IPV，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生糞便IgA，表明這種免疫方式激活機(jī)體產(chǎn)生了針對脊灰病毒的腸道免疫應(yīng)答。

新型佐劑可能增強(qiáng)IPV 誘導(dǎo)黏膜免疫的能力是研究者的關(guān)注點(diǎn)之一，以減少脊灰病毒的傳播，突破現(xiàn)有 IPV 的局限性。DE COSTA 等［27］利用小鼠模型評估了含有QB-90 佐劑的IPV 疫苗經(jīng)皮下免疫后引起黏膜免疫反應(yīng)的能力，研究者在膽汁、糞便和陰道沖洗液樣品中均檢測到QB-90 疫苗組的抗脊灰病毒IgA 抗體，應(yīng)答水平明顯高于無QB-90 的疫苗免疫對照組。dmLT 是大腸埃希菌熱不穩(wěn)定腸毒素的解毒形式，是一種有效的黏膜佐劑。在小鼠體內(nèi)接種含有dmLT 的IPV 疫苗，能夠產(chǎn)生比不含dmLT 的對照組高5 倍的血清中和抗體，dmLT 還促進(jìn)生發(fā)中心的形成，延長了血清抗PV 中和效價(jià)維持的時間，且能增強(qiáng)黏膜免疫，分泌糞便和腸道抗PV IgA［28］。

2.5 疫苗傳遞系統(tǒng) 近年來，除了常規(guī)肌肉注射途徑以外的其他遞送方法和技術(shù)也引起了研究者的關(guān)注，以作為節(jié)省劑量、降低成本的替代策略。據(jù)報(bào)道，皮膚中的樹突狀細(xì)胞參與對傳染病的免疫，通過皮膚劃痕成功接種牛痘病毒即采用這種原理。適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)取決于皮膚APC 對抗原的最初識別和捕獲及其向淋巴器官的轉(zhuǎn)運(yùn)［29］，因此，皮內(nèi)遞送途徑被認(rèn)為具有發(fā)展?jié)摿?。已有?bào)道通過常規(guī)針頭對嬰兒進(jìn)行皮內(nèi)接種IPV 能夠節(jié)約抗原用量［30］，且動物實(shí)驗(yàn)表明，這種途徑能夠誘導(dǎo)黏膜免疫［28］，但用常規(guī)針頭進(jìn)行皮內(nèi)注射很難執(zhí)行且較痛苦。微針介導(dǎo)的疫苗輸送是一種相對較新的策略，可實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)和潛在的無痛。研究者在大鼠、恒河猴模型中考查了微針介導(dǎo)的皮內(nèi)IPV 的免疫效果［31-33］，結(jié)果表明，中和抗體效價(jià)在微針免疫與肌內(nèi)注射免疫中是等效的；在人群的臨床試驗(yàn)中，通過微針方式皮內(nèi)給藥可在維持保護(hù)性抗體滴度的前提下將標(biāo)準(zhǔn)IPV劑量降低 60%［34］。

通過黏膜表面進(jìn)行疫苗接種也具有潛在的優(yōu)勢，其通過無針遞送，能夠同時誘導(dǎo)血清和黏膜免疫反應(yīng)，以阻斷病毒的傳播。初步研究表明，通過舌下或鼻內(nèi)途徑接種sIPV 能夠誘導(dǎo)系統(tǒng)性脊灰特異性中和抗體免疫應(yīng)答［35-36］，鼻內(nèi)施予sIPV 和黏膜佐劑霍亂毒素誘導(dǎo)的系統(tǒng)性脊灰病毒中和抗體滴度明顯高于通過肌肉內(nèi)途徑遞送的sIPV。鼻內(nèi)接種還可將抗原特異性免疫細(xì)胞募集至腸道，激活局部的腸道免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生腸道特異性IgA［35］。但這種黏膜接種途徑尚需進(jìn)一步研究，包括尋找安全有效的佐劑，開發(fā)新型口服劑型以改善口腔黏膜對抗原的吸收等。

3 小 結(jié)

盡管當(dāng)前的脊灰病毒免疫計(jì)劃在減少世界范圍麻痹性脊灰病例方面非常成功，但目前疫苗衍生的脊灰病毒引起的病例比野生脊灰病毒病例更多，成為根除脊灰的最大障礙之一。改用IPV 可以避免這種情況，但常規(guī)IPV 的生產(chǎn)需要培養(yǎng)大量病毒，生產(chǎn)設(shè)施的要求和疫苗的成本均面臨挑戰(zhàn)。因此，在接近無脊灰時代的現(xiàn)階段，需要考慮其他的疫苗研發(fā)策略，以確保維持對PV 的控制。