肝吸蟲引發(fā)膽管細胞癌發(fā)病機制的研究進展

謝紅丹(綜述)， 曹 聰(審校)

肝吸蟲病主要受華支睪吸蟲或麝貓后睪吸蟲感染所致。華支睪吸蟲多在中國、越南、韓國流行，廣東、廣西、黑龍江是我國主要流行地區(qū)；而麝貓后睪吸蟲多見于東南亞國家[1]。我國感染者與患者人數(shù)大概有1 500萬，約11億人存在感染風險。因此，華支睪吸蟲病已成為我國現(xiàn)如今最嚴重的食源性寄生蟲病[2-3]。其病理學基礎(chǔ)主要是機械性損傷、排泄-分泌代謝產(chǎn)物(excretory-secretory products,ESPs)產(chǎn)生的免疫炎癥改變、進行性膽管周圍纖維化及膽管上皮細胞的增生。膽管細胞癌(cholangiocarcinoma,CCA)是肝吸蟲感染導致的最嚴重的并發(fā)癥，其發(fā)病率在原發(fā)性肝癌病理分型中位居第二，疾病特征為早期缺乏臨床癥狀、病情快速進展且病死率高[4]。因此，2012年，華支睪吸蟲被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)國際癌癥研究署正式列為CCA的Ⅰ類致癌物[5]。肝吸蟲感染和CCA之間的致病聯(lián)系包括由吸蟲的取食和遷移活動引起膽管上皮的機械性損傷、感染相關(guān)炎癥引起的免疫病理學改變及其ESPs的直接影響，這些機制共同導致膽管上皮增生和腺瘤性改變，繼而膽管上皮細胞逐漸向惡性轉(zhuǎn)化[6]。近年來有許多學者對肝吸蟲感染的致癌機制做了相應的臨床及實驗研究，但至今其致癌機制尚未明晰。本文就肝吸蟲引發(fā)CCA的發(fā)病機制作一綜述。

1 機械性損傷

當內(nèi)含肝吸蟲囊蚴的生/半生的淡水魚被人攝食進入十二指腸后，囊蚴與胰蛋白酶接觸并排出幼蟲，隨后幼蟲經(jīng)膽汁趨化性快速遷移到肝內(nèi)膽管，并逐漸發(fā)育為成蟲。蟲體移動、ESPs及其免疫病理改變可使膽管上皮損傷。隨著蟲體體積增大及數(shù)量增多，膽管上皮損傷漸進性加重，致使膽道壁變厚、膽道狹窄、膽道內(nèi)壓增加，而后膽管上皮逐漸形成潰瘍。蟲卵從潰瘍口進入膽管周圍組織后，許多炎癥細胞浸潤并逐步發(fā)展為嗜酸性肉芽腫性炎，致使膽管周圍纖維化。研究[7]發(fā)現(xiàn)，華支睪吸蟲感染組家兔肝內(nèi)膽管明顯增粗，鏡下見匯管區(qū)增大并有膠原成分積聚，肝內(nèi)膽管增粗、膽管壁增厚，膽管及周圍組織炎癥，膽管內(nèi)皮局部可見低級到高級的上皮內(nèi)瘤變。長期華支睪吸蟲感染引起的機械損傷與慢性炎癥反應致使的膽管上皮病理性增生是膽管上皮癌前病變和腺瘤樣改變的標志[8]。此外，肝吸蟲長期寄生于宿主的外周膽管中，引起膽管和周圍肝組織的病理變化，包括炎癥、黏膜中產(chǎn)生黏蛋白的細胞化生、進行性膽管周圍纖維化和上皮細胞增生，尤其是肝吸蟲機械和化學刺激引起的膽管上皮持續(xù)性損傷和炎癥反應，有助于肝吸蟲相關(guān)性CCA的發(fā)生[9]。

2 肝吸蟲ESPs的作用

肝吸蟲將ESPs的成分通過體表排泄口排出并滲入膽管上皮和肝臟組織，形成一種ESPs微環(huán)境，這在宿主與寄生蟲的相互作用中產(chǎn)生重要的影響。在ESPs微環(huán)境下的細胞呈現(xiàn)出多種病理改變，如氧化還原失調(diào)、增殖、凋亡及炎癥反應[10-11]。研究者通過分析經(jīng)ESPs處理的人CCA細胞系(human cholangiocarcinoma cell line,HuCCT1)的差異轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)，被調(diào)控的基因或蛋白質(zhì)參與了細胞信號轉(zhuǎn)導、凋亡、癌變、代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)，這表明ESPs在宿主細胞的病理改變過程中起著多重作用[12]。華支睪吸蟲ESPs的成分中一些已鑒定的蛋白質(zhì)，如解毒酶、肌紅蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制劑、哺乳動物生長因子的同源物和抗凋亡蛋白，具有高度的免疫原性，在人類宿主中具有同源物[13]。重組麝貓后睪吸蟲ESPs的蛋白質(zhì)如硫氧還蛋白、顆粒樣生長因子被人膽管細胞內(nèi)化，并調(diào)節(jié)與凋亡信號、傷口愈合和癌癥途徑相關(guān)的基因/蛋白表達，這說明了ESPs的蛋白質(zhì)成分可能在肝吸蟲相關(guān)CCA的致病機理中起著至關(guān)重要的作用[14]。據(jù)報道[15]，源于華支睪吸蟲的ESPs誘導組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶募集和微小染色體維持蛋白7的反式激活，可能通過組蛋白乙?；揎椄淖冎掳┌谢虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，從而導致正常細胞向CCA細胞轉(zhuǎn)化。此外，肝吸蟲產(chǎn)生的ESPs還能推動CCA細胞的遷移和侵襲，這是導致CCA進展至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。Pak等[16]的研究表明，ESPs依賴性基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9的活性增強與核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、NF-κB-α抑制蛋白(inhibitor of NF-κB-α,IκB-α)的活性誘導可能有助于CCA的進展，在慢性華支睪吸蟲病相關(guān)肝膽損害的情況下，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2-NF-κB-MMP-9信號通路的組成性失調(diào)或許可以促使正常膽管細胞向惡性轉(zhuǎn)化，進而獲得如CCA細胞等更具侵襲性的表型。據(jù)報道[17]，經(jīng)ESPs處理的HuCCT1細胞能促使其三維侵入相鄰的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，同時增加了局灶性黏附蛋白和金屬蛋白酶的表達水平，表明ESPs可能改變CCA細胞的細胞-細胞和細胞-ECM黏附特性，ESPs的刺激通過促進局部黏附形成和增強ECM降解能力，促進了HuCCT1細胞的侵襲。Kim等[18]的研究表明，華支睪吸蟲的ESPs在體外誘導環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)-2表達，促進CCA細胞的增殖及其細胞周期從S向G2/M轉(zhuǎn)換，導致細胞表型變化，抵消小白菊內(nèi)酯的抗癌作用。在CCA細胞與膽管細胞共培養(yǎng)的更為復雜的腫瘤微環(huán)境中，由于膽管細胞、CCA細胞和華支睪吸蟲ESPs之間的協(xié)調(diào)相互作用，梯度電刺激可促進HuCCT1細胞侵襲正常膽管細胞形成膽管板，并以濃度依賴的方式形成 Ⅰ 型膠原基質(zhì)，這導致了暴露于ESPs的細胞中白介素(interleukin,IL)-6和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1的分泌增加，并引起細胞鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換，從而促進了更具侵襲性的CCA細胞表型[10，19]。

3 免疫炎癥反應

3.1細胞因子的產(chǎn)生 在肝吸蟲感染過程中，膽管上皮細胞持續(xù)被刺激后產(chǎn)生細胞因子參與免疫炎癥反應[19]。細胞因子識別并結(jié)合膜受體后啟動信號轉(zhuǎn)導通路，致使免疫細胞活化、細胞增殖、遷移、分化與凋亡。炎性細胞因子通常分為促炎性：IL-12、IL-1、IL-15、IL-4、IL-17、IL-6、IL-23、干擾素(interferon，IFN)-α、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α，以及抗炎性：IL-10、TGF-β[20]。肝吸蟲感染可依次激活不同宿主細胞中促炎性細胞因子的表達[13，21]。促炎性細胞因子的增加可能促使膽管上皮與周圍肝組織的免疫炎癥反應，最終導致更嚴重的慢性肝膽損傷甚至CCA的發(fā)展[21]。研究[22]表明，華支睪吸蟲感染引起的肝損傷和炎癥反應，激活了IFN-α1、IL-2、IL-1b及TGF-β2等細胞因子的表達，持續(xù)提高了免疫網(wǎng)絡(luò)分泌的呈時間依賴性的IL-3和IL-6濃度。IL-6作為一種重要的調(diào)節(jié)性細胞因子，其參與人體對病原微生物的天然免疫反應和慢性炎癥反應，在各種炎癥性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著不可或缺的作用。血循環(huán)中IL-6水平的升高顯著增加了麝貓后睪吸蟲感染引起的膽管周圍纖維化及CCA的風險，IL-6可能在慢性致病過程中通過創(chuàng)造一個刺激膽管纖維沉積和癌變的持續(xù)性炎癥環(huán)境發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。一項體外實驗[24]證明，IL-6和TGF-β1參與了CCA炎癥條件下的串擾，CCA細胞通過Smad家族蛋白(SMAD family member,Smad)4功能從促進細胞凋亡向增強惡性轉(zhuǎn)變，獲得侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變等惡性特征。IL-17a可經(jīng)過刺激血管形成、集聚中性粒細胞促進腫瘤的發(fā)展。Su等[25]研究表明，IL-17a在腫瘤內(nèi)或癌旁組織中的表達在肝吸蟲感染的CCA患者中明顯高于無肝吸蟲感染的CCA患者，IL-17a的上調(diào)與肝吸蟲感染有關(guān)，提示肝吸蟲感染本身是CCA發(fā)展的危險因素，肝吸蟲感染引起的炎癥反應有助于CCA的發(fā)展。

3.2細胞因子的失調(diào) 盡管炎性細胞因子的產(chǎn)生是宿主抵抗感染或損傷的一種防御機制，但在慢性華支睪吸蟲病相關(guān)肝膽系統(tǒng)異常的情況下，這些多效性細胞因子的持續(xù)和失調(diào)的產(chǎn)生被認為是促發(fā)性的，它們調(diào)節(jié)抗腫瘤反應和誘導惡性細胞轉(zhuǎn)化，炎性細胞因子的組成性失調(diào)可能會增強膽管及其周圍肝組織中更具侵襲性的病理過程，從而導致CCA的發(fā)生[13，21]。例如，TNF-α最初被認為是引起腫瘤壞死的一個相對高濃度因子，它在慢性和中度水平上的活性可以促進腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。對于分泌的IL-1β，低濃度的IL-1β誘導局部炎癥反應并激活保護性免疫，而高濃度的IL-1β誘導廣泛炎癥反應并伴有組織損傷和惡性細胞侵襲性增加。IL-1β和TNF-α的組成性失調(diào)的產(chǎn)生歸因于炎癥相關(guān)的組織損傷以及隨后的腫瘤發(fā)生和進展[13]。在華支睪吸蟲感染小鼠模型中[21]，血循環(huán)TNF-α和IL-6濃度的峰值出現(xiàn)時間分別為感染后1周和2周，而IL-1β的峰值出現(xiàn)時間為感染后8周，這意味著在華支睪吸蟲感染期間，促炎細胞因子的表達可能受到免疫反應的差異調(diào)節(jié)。研究[26-27]證明，華支睪吸蟲感染小鼠的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)/IL-17分泌性T細胞(IL-17-secreting helper T cells,Th17)升高，提示Treg與Th17比值的異常可能對華支睪吸蟲病引起肝纖維化的進展產(chǎn)生重要的影響，一旦Treg與Th17之間的平衡被破壞，炎癥細胞的數(shù)量就會減少，膠原沉積會隨著感染的發(fā)展而急劇增加。

3.3氧化自由基的產(chǎn)生 肝吸蟲感染引起的慢性炎癥會產(chǎn)生大量能破壞細胞生物分子的氧化自由基，如活性氧(reactive oxygen species,ROS)、活性氮(reactive nitrogen species,RNS)，導致氧化產(chǎn)物的形成，發(fā)生突變、遺傳不穩(wěn)定、表觀遺傳變化和基因表達的改變[28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)，用ESPs處理的人CCA細胞，可以激活COX、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthetase,iNOS)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)、NADPH氧化酶[nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH) oxidase,NOX]及脂氧合酶，并呈時間依賴性，從而引發(fā)自由基的增加。據(jù)報道[12]，ESPs介導了ROS的產(chǎn)生，這表明在華支睪吸蟲ESPs的反應中產(chǎn)生的ROS導致了HuCCT1細胞中硫氧還蛋白和過氧還蛋白亞型等抗氧化蛋白的表達升高，而肝吸蟲通過線粒體膜去極化引起大鼠嗜酸細胞凋亡。這意味著來自肝吸蟲的ESPs觸發(fā)了自由基的產(chǎn)生，這些自由基與宿主細胞的初始病理生理反應有關(guān)。在暴露于華支睪吸蟲ESPs的HuCCT1細胞中，由NOX、XO和iNOS活化產(chǎn)生的自由基參與了NF-κB的活化，自由基的增加顯著促進胞漿降解IκB-α及NF-κB亞基RelA與p50的核易位，并增加了NF-κB共有DNA結(jié)合活性，這表明酶促產(chǎn)生的自由基是宿主NF-κB介導的炎癥反應的關(guān)鍵觸發(fā)因子[11]。氧化損傷產(chǎn)物通過iNOS誘導局部一氧化氮生成，并積聚在膽管周圍的慢性炎癥部位。膽管上皮細胞一直處于高濃度的氧化損傷環(huán)境中，致使CCA的發(fā)生和(或)進展[30]。在炎癥反應中生成多余的自由基導致脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation,LPO)，致使大量的氧化性DNA損傷和細胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)。研究[21]表明，華支睪吸蟲感染由于產(chǎn)生LPO而破壞宿主的氧化還原平衡，從而創(chuàng)造了一種促進癌癥的微環(huán)境，這有利于華支睪吸蟲相關(guān)CCA的發(fā)生與發(fā)展。宿主細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的破壞以及自由基和Toll樣受體激活之間的內(nèi)源性相互作用的延長加重了膽管上皮和周圍肝組織的慢性炎癥環(huán)境，最終導致更嚴重的肝膽損害[9]。除了ROS和RNS直接修飾DNA外，LPO產(chǎn)物如反式-4-羥基-2-壬醛、丙二醛以及巴豆醛也能修飾DNA堿基，形成各種外環(huán)加合物，導致細胞突變以及致癌性損傷。自由基和LPO產(chǎn)物還可以調(diào)節(jié)信號分子，改變參與炎癥和癌變的轉(zhuǎn)錄因子和酶的功能[31]。

4 膽管周圍纖維化

肝吸蟲感染可以導致膽管周圍纖維化，慢性反復感染或重度感染還能進展至肝硬化。在感染早期階段，幼蟲的ESPs刺激膽管上皮增殖，并沿膽道系統(tǒng)觸發(fā)炎癥反應；而到感染后期，膽管上皮增生逐漸進展為腺體增生和膽管上皮中腺瘤性增生；在重度感染中，膽管周圍纖維化向上延伸至膽管毛細血管，向下延伸至門脈區(qū)域；長期慢性感染的條件下，一些病例形成的膽管周圍纖維化還能夠發(fā)展成膽汁性肝硬化[10]。這些腺瘤性增生、膽管周圍纖維化或肝硬化的形成最終可導致CCA。長期慢性肝損傷時，肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)處于包括氧化應激、凋亡體、細胞因子在內(nèi)的自分泌或旁分泌信號的微環(huán)境中，并轉(zhuǎn)變成活化的肌成纖維細胞，這在發(fā)生肝纖維化的過程中是一個至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。HSCs的活化可產(chǎn)生細胞因子及生長因子并導致ECM的生成與積累，從而推動肝纖維化的進展[32-34]。研究[35]結(jié)果顯示，華支睪吸蟲溶血磷脂酶A(lysophospholipase A of Clonorchis sinensis,CsLysoPLA)在成蟲及其ESPs引起的機械和化學損傷后滲透毛細血管，然后通過蛋白激酶A依賴的B型絲/蘇氨酸蛋白激酶(B-type serine/threonine protein kinase,B-Raf)/ERK1/2途徑上調(diào)巨噬細胞IL-25激活HSCs，從而促進肝纖維化。通過免疫定位分析[36]，CsLysoPLA定位于實驗感染大鼠肝內(nèi)膽管內(nèi)的腺瘤樣增生組織中，腺瘤樣增生是由膽管細胞惡性轉(zhuǎn)化而成，它和上皮增生共同參與了細胞增殖介導的CCA的發(fā)生。此外，CsLysoPLA還上調(diào)了HSCs中促纖維化基因的表達。華支睪吸蟲慢性感染導致的膽管周圍纖維化受到TGF-β/Smad信號通路的密切調(diào)控，隨著感染的發(fā)展，膠原沉積逐漸增加[26]。據(jù)報道[37]，華支睪吸蟲ESPs成分中的分泌型磷脂酶A2還能促使HSCs的增殖與活化，從而參與肝纖維化的形成與發(fā)展。華支睪吸蟲感染小鼠模型的研究結(jié)果顯示，Th2和Treg細胞亞群的增加可能在肝纖維化的形成中起重要作用[38]。華支睪吸蟲感染誘導的IL-13和ESPs中糖基化T2核糖核酸酶的免疫也可能有利于肝纖維化的發(fā)生[39]。

5 展望

肝吸蟲在我國廣泛分布，有著嚴重的危害性，CCA的發(fā)生發(fā)展與長期遷延性的肝吸蟲感染有密不可分的聯(lián)系。肝吸蟲感染與CCA致病關(guān)系的相關(guān)研究已經(jīng)持續(xù)了100多年，其致癌機制的研究也取得了重要進展，但目前二者的因果關(guān)系仍未十分明確。在這分子生物學、免疫學及科學實驗技術(shù)飛快發(fā)展的時代，各學科、各領(lǐng)域之間相互影響、相互促進,因此研究者還可從不同角度進一步深入探究肝吸蟲誘發(fā)CCA的分子生物學及基因組學機制，這有助于降低肝吸蟲相關(guān)CCA的發(fā)病率和病死率，為其治療、藥物研制等提供相關(guān)科學理論依據(jù)。