黃韌帶肥厚動(dòng)物模型研究進(jìn)展△

吳立康，陳 煜，宋國強(qiáng)，許 鵬

（1.常州大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院，江蘇常州2131642；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；3.海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院脊柱二科，上海200003）

黃韌帶連接各椎體，起保護(hù)脊髓神經(jīng)的作用。當(dāng)黃韌帶肥厚（ligamentum flavum hypertrophy，LFH)后，壓迫硬膜囊和神經(jīng)根導(dǎo)致患者出現(xiàn)下肢麻木或間歇性跛行的癥狀。建立可靠的動(dòng)物模型對黃韌帶肥厚的發(fā)病機(jī)制研究具有促進(jìn)作用，也可體內(nèi)驗(yàn)證新開發(fā)的治療方法。黃韌帶肥厚屬于慢性退變性疾病，造模耗時(shí)長且個(gè)體間差異大給實(shí)驗(yàn)研究增加難度［1］。近年來，國內(nèi)外關(guān)于黃韌帶肥厚動(dòng)物模型的制作方法多樣，本文總結(jié)這些制作方法的進(jìn)展，為進(jìn)一步研究提供思路。

1 黃韌帶肥厚的變化

影像學(xué)分析中，正常的黃韌帶組織厚度應(yīng)在4 mm以下，超過5 mm可判斷為黃韌帶肥厚。正常的黃韌帶是一種結(jié)締組織，主要由彈性纖維（80%）和膠原纖維（20%）組成。隨著黃韌帶的退變，組織肥大，表現(xiàn)為彈性纖維丟失和膠原纖維增多并沉積，具有纖維化病變的特征［2］。引起黃韌帶纖維化的原因復(fù)雜，小關(guān)節(jié)和椎間盤退變是最直接的因素。小關(guān)節(jié)退變導(dǎo)致椎間序列不穩(wěn)定，黃韌帶受到異常的機(jī)械應(yīng)力刺激［3］。長期的機(jī)械應(yīng)力刺激引發(fā)組織微損傷和慢性炎癥的產(chǎn)生，炎癥因子的釋放促使組織過度修復(fù)進(jìn)而產(chǎn)生纖維化。纖維化是黃韌帶肥厚的重要病理因素［4］，如果不能有效控制纖維增生，則會(huì)導(dǎo)致結(jié)締組織在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積，成纖維細(xì)胞大量增殖，最終引起彈性纖維減少，膠原沉積增加。

在黃韌帶肥厚的過程中，多種分子表達(dá)異常。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的表達(dá)增加，并刺激Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達(dá)增加［5］。肥厚的黃韌帶組織中毛細(xì)血管明顯增多，血管生成素樣蛋白2和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)增加［6］。這些因素共同作用，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞活化，最終引起黃韌帶肥厚［7］。

2 動(dòng)物模型建立的方法

近年來多個(gè)動(dòng)物模型模擬了黃韌帶肥厚的病理變化，考慮到經(jīng)濟(jì)成本及實(shí)驗(yàn)難度，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以實(shí)驗(yàn)兔和實(shí)驗(yàn)鼠為主，模型重復(fù)性好，且生理與解剖特征與人相似。

相較于四足站立或俯臥態(tài)，雙足站立姿勢會(huì)使脊柱承受的壓力增加，引起脊椎退變。有限元分析顯示，直立姿態(tài)下，腰椎黃韌帶韌帶受到的應(yīng)力明顯高于伸展?fàn)顟B(tài)。Zheng等［8］利用小鼠的恐水誘導(dǎo)它們采取兩足站立姿勢，將小鼠置于類似燒杯的空間，底部有水，每天站立6 h。并對站立姿態(tài)的小鼠進(jìn)行mi?cro-CT掃描，檢查脊柱的變化。造模10周后，對黃韌帶面積、彈力纖維/膠原纖維比值和細(xì)胞因子受體樣因子1（cytokine receptor like factor 1,CRLF1）的表達(dá)進(jìn)行定量。雙足站立使腰椎黃韌帶受力增加，引起黃韌帶肥厚。組織學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組小鼠的黃韌帶中，彈性纖維減少，膠原纖維和纖維化因子表達(dá)增加。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，CRLF1表達(dá)增加與黃韌帶肥厚具有重要關(guān)系，在CRLF1敲除的小鼠中，雙足站立實(shí)驗(yàn)組卻不會(huì)刺激肥厚。黃韌帶肥厚是慢性疾病，久坐和不良坐姿會(huì)很大程度提高黃韌帶肥厚的發(fā)病率。通過模擬人類站立的姿勢，可造成黃韌帶受到的擠壓或牽拉應(yīng)力增加。該方法使用的工具簡單，但雙足站立姿勢引起的應(yīng)力不夠明顯，造模效果有待驗(yàn)證，且樣本間個(gè)體差異較大。

為了使黃韌帶受到的機(jī)械應(yīng)力增加，Sato等［9］人為的造成脊柱序列不穩(wěn)，導(dǎo)致黃韌帶受到異常的應(yīng)力刺激，從而建立黃韌帶肥厚模型。具體做法為：大鼠腰部后路切開，摘除L5棘突、L4～6棘上韌帶、L4～5、L5～6棘間韌帶。使得大鼠腰椎第5節(jié)段與上下段之間的正常平衡被打破，在術(shù)后的活動(dòng)中，由于腰椎后方韌帶被摘除，黃韌帶受到的牽拉力大大增加。8周后處死取材。行EVG（Verhoeff's van Gieson）和Mas?son染色，模型組切片纖維排列規(guī)則變差，EVG染色顯示整體區(qū)域彈性纖維變少，Masson染色顯示膠原纖維增加，模型組黃韌帶發(fā)生纖維化。他們還發(fā)現(xiàn)，纖維化在靠近橫突的背側(cè)區(qū)域更明顯。這說明黃韌帶的背側(cè)受到的刺激更明顯，在背側(cè)的韌帶更容易發(fā)生肥厚。

Hayashi［10］用實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行黃韌帶肥厚造模，進(jìn)行L2～3和L4～5后外側(cè)植骨融合術(shù)，并切除L3～4椎上肌。將機(jī)械應(yīng)力集中在L3～4水平，用來增加L3～4黃韌帶受到的應(yīng)力刺激。而進(jìn)行融合的L2～3和L4～5段的黃韌帶則減少受到的應(yīng)力刺激。術(shù)后16周，在機(jī)械應(yīng)力的刺激下，黃韌帶組織中彈力纖維斷裂，軟骨基質(zhì)增多，與腰椎管狹窄患者的肥大黃韌帶表現(xiàn)相似。該團(tuán)隊(duì)還用DNA芯片進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞生長因子9的表達(dá)增加，主要集中在黃韌帶末端或小關(guān)節(jié)周圍，這是黃韌帶退變肥厚的重要原因［11］。在李學(xué)朋［12］的研究中，雙醋瑞因能抑制肥厚黃韌帶中炎癥因子的表達(dá)，改善纖維化。

通常在黃韌帶肥厚的同時(shí)也伴隨一定程度的椎間盤退變。通過后入路切除或破壞脊椎后方肌肉導(dǎo)致黃韌帶受到的機(jī)械應(yīng)力增加容易導(dǎo)致黃韌帶肥厚，而退變的椎間盤導(dǎo)致椎體間序列變差，引起椎間序列不穩(wěn)也會(huì)引起黃韌帶肥厚。卜憲敏等［13］以新西蘭大白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過頸椎前路穿刺破壞纖維環(huán)及抽吸C4/5髓核組織建立兔頸椎不穩(wěn)動(dòng)物模型。4周后，C4/5節(jié)段黃韌帶纖維排列變差，TGF-β1表達(dá)增加。

采用切除椎體之間韌帶的方法可使黃韌帶受到的應(yīng)力刺激增加，但樣本間差異依舊較大。在動(dòng)物未處于行走活動(dòng)的時(shí)候，黃韌帶則不受異常的應(yīng)力刺激。為了使樣本受到的應(yīng)力刺激量化，減少樣本間差異，Saito［14］制作了一個(gè)可固定小鼠的裝置，裝置可電動(dòng)控制，往復(fù)彎曲并強(qiáng)迫小鼠進(jìn)行牽拉彎腰動(dòng)作，每日持續(xù)3 h。12周后，通過組織學(xué)分析，應(yīng)力牽拉裝置使小鼠黃韌帶增厚，膠原纖維面積，黃韌帶成纖維細(xì)胞數(shù)量和纖維化相關(guān)因子增加。但這種機(jī)械應(yīng)激模型并沒有觀察到巨噬細(xì)胞浸潤、血管增加和TGF-β表達(dá)增加，而這些變化是人黃韌帶肥厚的標(biāo)志性變化，該裝置并沒有完全模擬黃韌帶肥厚。

巨噬細(xì)胞浸潤是黃韌帶肥厚的重要特征，慢性炎癥引起黃韌帶組織中的巨噬細(xì)胞增加，分泌大量炎癥因子和TGF-β1，刺激黃韌帶成纖維細(xì)胞增殖分化，最終引起黃韌帶肥厚。Saito團(tuán)隊(duì)［15］通過手術(shù)常規(guī)暴露小鼠椎體后棘突，鈍性分離椎旁肌，暴露黃韌帶。用30號針對黃韌帶背側(cè)進(jìn)行微損傷，常規(guī)縫合。微損傷導(dǎo)致組織內(nèi)巨噬細(xì)胞增加，黃韌帶表現(xiàn)為肥厚，巨噬細(xì)胞刺激膠原表達(dá)增加，而當(dāng)注射含有氯磷酸鹽的脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞可抑制黃韌帶肥大。

溶血磷酸脂酸（lysobisphosphatidic acids,LPA）的高表達(dá)可能與黃韌帶肥厚正相關(guān)。Zhou［16］將LPA吸附在明膠海綿中，選擇8周雄性SD大鼠，從腰椎L1～2棘突上方作縱向皮膚切口，分離椎旁肌。部分切除相鄰的棘上韌帶和棘間韌帶。用明膠海綿作為載體，負(fù)載LPA，插入后外側(cè)硬膜外和黃韌帶之間。LPA通過激活LPAR1-Akt信號通路顯著誘導(dǎo)黃韌帶成纖維細(xì)胞增殖和抑制凋亡，最終引起黃韌帶肥厚。

黃韌帶的動(dòng)物模型目前還不算成熟，多種椎間盤退變動(dòng)物模型的造模思路也可能成為建立黃韌帶肥厚的方法。將小關(guān)節(jié)突切除引起脊柱不穩(wěn)，從而導(dǎo)致應(yīng)力刺激增加，引起脊柱退變、小關(guān)節(jié)炎癥［17］。此方法實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物黃韌帶組織在應(yīng)力和炎癥反應(yīng)下引發(fā)退變，但作者并未進(jìn)行詳細(xì)評價(jià)，且小關(guān)節(jié)切除時(shí)需把握好量，實(shí)際操作時(shí)容易直接損傷黃韌帶。TGF-β1是引起黃韌帶肥厚的重要因子［18］，可采用重組TGF-β1蛋白刺激黃韌帶肥厚。這種方法可用于評估治療黃韌帶肥厚的治療方案，尤其是有關(guān)TGF-β1參與的信號通路。

3 動(dòng)物模型的評價(jià)方法

影像學(xué)檢測：采用MRI可最直觀的觀察黃韌帶的肥厚情況。也可應(yīng)用CT、X線片等對椎體等骨骼退變的觀察。

動(dòng)物行為學(xué)觀察：黃韌帶肥厚造成腰椎管狹窄影響下肢行動(dòng)能力，在建立黃韌帶肥厚的動(dòng)物可進(jìn)行行為學(xué)觀察，如斜板停留實(shí)驗(yàn)，BBB運(yùn)動(dòng)功能評分。

分子檢測：對造模后的動(dòng)物取材，收集黃韌帶樣本。通過PCR或WB分析多種黃韌帶肥厚標(biāo)志物的表達(dá)，如TGF-β1，ColⅠ和Ⅲ等。但這種方法不適用于大鼠或小鼠，由于鼠的脊柱結(jié)構(gòu)較小，其黃韌帶的體積也很小，檢測結(jié)果不夠穩(wěn)定。

組織切片染色：在取材時(shí)，很難完整的直接分離出黃韌帶，一般將整個(gè)脊柱節(jié)段保留。進(jìn)行組織切片檢查。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)取相同節(jié)段，盡可能選擇相似的位置進(jìn)行切片。除了HE染色，還可以選擇EVG染色天狼猩紅（sirius red）染色和Masson染色。其中EVG染色是將彈性纖維染成藍(lán)黑色，將膠原纖維染成紅色，天狼猩紅染色將膠原纖維染成紅色，Masson是將膠原纖維染成藍(lán)色。用軟件對樣本間染色面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比較彈性纖維/膠原纖維的比值。此外，切片后還可對ColⅠ、TGF-β1等黃韌帶標(biāo)志物免疫組化分析。

建立黃韌帶肥厚動(dòng)物模型的目的在于模擬人類黃韌帶退變肥厚的組織、細(xì)胞及分子變化，用于研究黃韌帶肥厚的發(fā)生機(jī)制。也可以對體外研究的內(nèi)容在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，評價(jià)其在組織整體微環(huán)境下的適用情況。在上述的黃韌帶肥厚動(dòng)物模型中，利用黃韌帶受到異常應(yīng)力刺激，損傷或其他刺激以引起炎癥反應(yīng)，從而引起動(dòng)物的黃韌帶肥厚。但也存在一定的問題：（1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定；（2）難以全面的模擬人黃韌帶退變肥厚的機(jī)制；（3）造模時(shí)間長，難度大。黃韌帶肥厚的動(dòng)物模型建立還處于初步探索階段，黃韌帶肥厚的體內(nèi)研究亟需一個(gè)穩(wěn)定且高效的動(dòng)物模型。