細胞移植治療椎間盤退變的研究進展△

王宇翔，徐海棟，趙建寧

（南京醫(yī)科大學金陵臨床醫(yī)學院，江蘇南京 210002）

下腰痛發(fā)病率近年來逐漸增加，終生患病率為84%，這與人口老齡化、肥胖率增加、不良的生活習慣等密切相關［1］。導致下腰痛的病因有很多，其中最常見的病因就是椎間盤退變［2］。腰椎間盤由纖維環(huán)、髓核和終板三個結(jié)構(gòu)構(gòu)成，隨著年齡增大，纖維環(huán)逐漸松弛、髓核內(nèi)含水量減少，最終可能發(fā)生椎間盤的膨出、突出甚至髓核的脫出，當退變突出的椎間盤壓迫神經(jīng)根時甚至會產(chǎn)生相應的臀腿部的疼痛。

椎間盤突出給整個社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。目前對于這種疾病的治療方法主要有兩種，一種是保守治療，以臥床休息和藥物止痛為主，另一種則是手術治療，通過手術摘除突出的椎間盤，解除神經(jīng)壓迫緩解癥狀。但無論是哪種方法，都無法解決椎間盤內(nèi)的促炎環(huán)境、細胞外基質(zhì)合成代謝障礙、功能性細胞數(shù)量的減少和功能的喪失等問題［3］，并且可能會產(chǎn)生腰椎活動度減小、手術并發(fā)癥等問題。

在這樣的背景下，在疾病早期通過生物技術在細胞層面去延緩椎間盤退變的進程自然引起了人們的關注。由于髓核組織內(nèi)沒有血管，大大降低了細胞移植后發(fā)生免疫反應的風險，提高了同種異體細胞移植的可行性。通過向退變的椎間盤內(nèi)移植具有正常分泌細胞外基質(zhì)的功能細胞，可以改善髓核內(nèi)部的不利于細胞生存的環(huán)境，減少功能細胞的凋亡。本文從植入的種子細胞、作為細胞移植載體的生物支架和促進細胞生存的生物因子等幾個方面對近幾年的相關研究作一文獻綜述。

1 種子細胞

目前的研究中，常用于細胞移植研究的種子細胞有髓核細胞和間充質(zhì)干細胞。

1.1 髓核細胞

健康的椎間盤中髓核細胞稀疏，髓核中富含蛋白聚糖和水分，很大程度上分擔了脊柱的負荷［4］。這些髓核細胞通過分泌蛋白聚糖和二型膠原蛋白來維持這些細胞外基質(zhì)的功能［5］。因此當髓核細胞數(shù)量減少、功能異常時，通過外源性的細胞直接替換這些退變的細胞是最直接的辦法，已有多項研究證明髓核細胞移植的有效性。Hirashi等［6］通過在犬退變椎間盤模型中植入預培養(yǎng)的髓核細胞，使得退變的椎間盤細胞外基質(zhì)特征有明顯改善；Wang等［7］的研究則表明將同種異體的髓核細胞移植到大鼠的椎間盤退變模型中能有效抑制細胞凋亡，并可以觀察到細胞遷移增加，有效減少了椎間盤的退變。盡管目前應用于臨床上的相關研究很少，但Mochida等［8］對9名患者的3年前瞻性安全性研究表明，3年隨訪期間未觀察到不良反應，證實了這項技術臨床應用的安全性。目前髓核細胞移植面臨的最大問題是細胞來源不足，既難以從患者體內(nèi)提取到足量的髓核細胞用于移植，又難以排除同種異體細胞移植潛在的健康安全問題，同時髓核細胞經(jīng)過多次培養(yǎng)傳代后容易發(fā)生表型消失、向成纖維細胞分化的問題，因此需要考慮采用來源更加豐富的細胞作為種子細胞。

1.2 干細胞

干細胞是具有高分化能力、高增殖率的一類細胞，目前已經(jīng)可以從人體的多種組織中提取獲得干細胞，包括骨髓、脂肪、肌肉、皮膚、骨膜、血液、滑膜等［9］。其中常用的是胚胎干細胞、誘導多能干細胞和間充質(zhì)干細胞［10］。其中胚胎干細胞和誘導多能干細胞由于數(shù)量較少、存在發(fā)生腫瘤的可能等問題，應用受到限制。而間充質(zhì)干細胞是源自于中胚層組織和器官的多能細胞，在適當?shù)纳L因子或誘導劑的誘導下，具有分化為其原始組織或器官的某些或全部細胞的能力。

目前已有較多研究顯示出間充質(zhì)干細胞用于治療椎間盤退變性疾病的巨大潛力。為了促進間充質(zhì)干細胞向髓核細胞分化，促進其合成蛋白聚糖和II型膠原蛋白，已嘗試多種體外誘導方式，包括模擬椎間盤內(nèi)的低氧環(huán)境［11］、使用II型膠原蛋白混合處理的水凝膠以及通過將髓核細胞與間充質(zhì)干細胞混合培養(yǎng)等［12，13］，都可以促使其分化為髓核細胞表型?，F(xiàn)有的動物實驗證明多種來源的間充質(zhì)干細胞可以用于治療椎間盤退變性疾病。Perez-Cruet等［14］將臍帶來源的間充質(zhì)干細胞移植到兔的椎間盤退變模型中，觀察到髓核的組織學結(jié)構(gòu)得到增強，蛋白聚糖和水含量都顯著改善。Li等［15］通過將骨髓來源的間充質(zhì)干細胞植入兔椎間盤，觀察到椎間盤高度指數(shù)和II型膠原蛋白水平明顯增高，顯著修復了變形的椎間盤纖維環(huán)。Wang等［16］將脂肪來源的間充質(zhì)干細胞在軟骨形成培養(yǎng)基中預分化7～10 d，其促進椎間盤再生的作用得到大大提高。

臨床上已有一些初步的研究證明其安全性。Kumar等［17］在10例椎間盤退變的患者的髓核中植入了自體脂肪來源的間充質(zhì)干細胞和透明質(zhì)酸，隨訪1年后可觀察到患者的ODI和VAS評分均得到改善，部分患者髓核的含水量增加。Petine等［18，19］則將患者的自體骨髓濃縮液注射到退變的髓核中，隨訪3年，觀察到20名患者的ODI和VAS評分明顯改善，同時觀察到，注射的骨髓液中細胞濃度越高，患者的癥狀改善越明顯，治療過程中也沒有發(fā)生注射相關的不良事件。

2 生物材料載體

為了模擬髓核的物理狀態(tài)和為種子細胞提供一個適合生存的環(huán)境，需要利用一些生物材料構(gòu)建適合的載體。目前常用的一些材料主要分為三種：

一種是天然材料，包括膠原蛋白、殼聚糖、透明質(zhì)酸和藻酸鹽等［20］。Omlor等［21］將纖維蛋白基質(zhì)與間充質(zhì)干細胞結(jié)合，植入豬椎間盤退變模型，經(jīng)過12周治療后發(fā)現(xiàn)椎間盤退變明顯減少，且營養(yǎng)因子表達增多、炎癥因子表達減少。Zhou等［22］使用II型膠原和硫酸軟骨素的復合水凝膠構(gòu)建細胞載體，在大鼠尾椎退變模型中植入后，使退變椎間盤的高度、水含量和細胞外基質(zhì)的合成均得到改善。Zeng等［23］使用藻酸鹽水凝膠作為間充質(zhì)干細胞的載體將間充質(zhì)干細胞植入犬椎間盤退變模型，經(jīng)過6個月治療后退變程度與對照組相比明顯減輕。

還有一種是合成材料，包括聚乳酸、聚乙二醇等［20］。Pirvu 等［24］利用聚碳酸三亞甲基酯 （PTMC）作為間充質(zhì)細胞的載體，同時使用聚酯酸酯（PU）膜修復斷裂的纖維環(huán)防止髓核漏出，在牛椎間盤退變模型中恢復了椎間盤高度，同時誘導了合成代謝基因的表達上調(diào)和分解代謝基因的下調(diào)。Varma等使用氧化還原聚合的羧甲基纖維素水凝膠，體外培養(yǎng)人間充質(zhì)干細胞，獲得了豐富的蛋白聚糖和膠原蛋白等細胞外基質(zhì)沉積。另外還有使用多空編制鈦和自組裝鈦納米纖維等作為載體材料，都顯示出了良好的應用前景［25，26］。

最后一種是生物來源載體支架，利用脫細胞的髓核甚至是整個椎間盤脫細胞后進行移植［27，28］，經(jīng)過血管重建和骨重塑后，脊柱的活動性和穩(wěn)定性都能得到明顯改善。Shan等［29］利用脫細胞的豬小腸粘膜下層制成顆粒，接種兔髓核細胞后植入兔椎間盤退變模型，有效預防了退變的進展。

3 生長因子

除了通過引入外源性功能細胞增加細胞數(shù)量外，如何減少細胞凋亡是另一個重要的研究方向。通過直接注射生長因子或者在種子細胞中通過病毒轉(zhuǎn)染相關基因使其表達生長轉(zhuǎn)化因子，可促進細胞從分解代謝狀態(tài)向合成代謝狀態(tài)轉(zhuǎn)化，并減少細胞凋亡。目前已證明有多種生長因子在體外可刺激椎間盤細胞的增殖和基質(zhì)合成，包括 TGF-β［30］、GDF-5［31］和 BMP-2［32］等。

TGF-β是調(diào)節(jié)多種細胞類型的生長、粘附和分化的多功能因子，同時也是一種強大的免疫抑制劑。在髓核內(nèi)通過上調(diào)TGF-β誘導產(chǎn)生IκB來抑制NF-κB活性，從而減輕髓核內(nèi)的炎癥反應，減少髓核細胞的凋亡［33］。Jiang 等［34］通過將 TGF-β1 與間充質(zhì)干細胞共同植入退變的大鼠髓核內(nèi)，對變形的椎間盤明顯起到修復作用，且這種修復作用強于單獨植入間充質(zhì)干細胞。

GDF-5也被稱為軟骨衍生的形態(tài)發(fā)生蛋白1，在1994年被確定為TGF-β超家族的新成員［35］。GDF-5在肌肉、骨骼的發(fā)育過程中起到關鍵作用，例如軟骨內(nèi)骨化、肌腱和韌帶的形成、修復等［36］，因此考慮到其多效性可能有助于椎間盤退變的治療。在GDF-5基因缺陷的模型小鼠中，可觀察到椎間盤中的蛋白聚糖和II型膠原的表達明顯下調(diào)，通過外源注入GDF-5后蛋白聚糖和II型膠原呈劑量依賴式的表達上升［37］。Colombier等［38］將 GDF-5 與 TGF-β1 協(xié)同作用以使脂肪來源的間充質(zhì)干細胞向髓核樣細胞分化，最終分泌了與天然髓核細胞相當?shù)木哂胸S富的蛋白聚糖和II型膠原的細胞外基質(zhì)。

4 展 望

目前細胞移植用于治療椎間盤退變疾病已取得一定的進展，但在研究過程中仍然存在很多問題亟待解決，如如何進一步促進移植細胞的生存、減少凋亡；需要開發(fā)更加高效的載體生物材料；尋找創(chuàng)傷更小的移植方法等等。更重要的是，目前臨床方面的研究還比較少，且多局限于論證細胞移植安全性的前瞻性研究，對于用什么方式、在椎間盤退變進展到何種程度時進行移植更有效等問題，目前尚無相關研究進行論證，因此這一治療方式仍值得進一步探索。