新西蘭兔骨缺損模型的文獻綜述△

艾子政，董謝平

（1江西省人民醫(yī)院骨科，江西南昌 330006；2江西中醫(yī)藥大學研究生院，江西南昌 330004）

骨缺損可由感染、腫瘤、創(chuàng)傷和各種先天性疾病等引起［1］，常需植骨。由于自體骨移植和異體骨移植受到可用性、發(fā)病率或潛在風險（如免疫原性和疾病傳播）等限制［2］，為此，近幾十年來進行了大量人工骨替代物的研發(fā)。這些研發(fā)均需進行臨床前的動物實驗，而選擇或建立合適的骨缺損動物模型是順利完成動物實驗的前提條件。新西蘭白兔因其骨骼成熟時間短，廉價且易于飼養(yǎng)和處理，抗病能力較強，能夠進行符合足夠統(tǒng)計條件的研究等特點，成為世界上肌肉骨骼系統(tǒng)研究中使用最為廣泛的實驗兔品種［3-5］。

在骨缺損的實驗中，不僅建立骨缺損模型的骨骼及其部位、類型、骨膜剝離情況和是否固定等外因對實驗結果影響很大，新西蘭兔的年齡、性別、體重和日?；顒恿康葍纫蛞矔嶒灝a生較大的影響；但在以新西蘭兔為實驗動物制作骨缺損的文獻報道中，有關上述因素的組合方式卻大相徑庭，沒有相對公認的標準與通行做法，也鮮有對所述組合方式的原因進行說明者，影響了對研究結果的評價。為此，本文對上述因素進行綜述，以期為新西蘭兔骨缺損動物模型的設計或制作提供參考。

1 新西蘭兔制備骨缺損模型的骨骼及部位

制備骨缺損模型的骨骼有四肢骨、顱骨和下頜骨等。顱骨不負重，對材料的力學性能要求低，故多用于填充型植骨材料的骨缺損模型制備；口腔存在易感染的特殊環(huán)境，故下頜骨缺損模型常用于口腔領域的實驗材料研究。但由于有兔牙的存在，下頜骨可用骨質并不多，因此下頜骨與顱骨一樣，骨缺損模型使用頻率均較低。而四肢骨則因骨骼類型較多、骨量豐富、結構規(guī)則、能測試材料的負重性能和手術操作簡單等優(yōu)勢，成為骨缺損實驗優(yōu)先選擇的模型。

四肢骨包括前肢的肱、橈、尺骨以及后肢的股骨和脛骨，可分為負重骨和非負重骨。一般來說，獨立構成肢體部位的單根長管狀骨為負重骨，雙骨結構部位的長管骨為非負重骨。但因兔在標準籠飼養(yǎng)時，上肢常抬起成蹲立位，肱骨受力機會減少，故可視為非負重骨；橈、尺骨共同構成兔前臂的支持結構，其中一骨制備骨缺損時，另一骨可起到支撐作用，自然屬于非負重骨。作為后肢的兔脛腓骨在中下段融合為一體，骨結構成“Y”形，因脛骨缺損模型多選擇在兩骨融合點以下的單骨區(qū)域，故仍為負重骨。因此，通常將新西蘭兔前肢骨視為非負重骨，后肢骨視為負重骨。

在四肢骨模型中制備骨缺損的部位一般選擇長骨骨干和骨端。長骨骨干處骨骼形狀規(guī)則，常用于制備節(jié)段性骨缺損；長骨骨端如股骨髁、肱骨大結節(jié)和脛骨近端內側等處為松質骨結構，且骨骼相對粗大、血運豐富，常用于制備無需固定的圓柱形骨缺損。

2 新西蘭兔骨缺損模型的種類

新西蘭兔骨缺損模型種類有四肢骨骨缺損、顱骨缺損和下頜骨缺損幾種模型［6］。四肢骨骨缺損根據缺損形狀可分為骨干節(jié)段性缺損、部分皮質缺損或松質骨缺損。

骨干節(jié)段骨缺損模型（segmental bone defect,SBD）系在長骨干中段截除一段骨干所遺留的缺損，骨替代物填充后通常需用固定裝置固定，以維持植骨替代物與斷端之間的穩(wěn)定性［7］。

部分皮質骨或松質骨缺損模型（partial cortical defect or cancellous bone defect,PC）是在骨端的一側用小型電鉆穿透皮質骨形成一個可延伸到下面松質骨或骨髓腔的孔，通常不破壞骨的連續(xù)性［7］。

顱骨缺損模型為保護顱骨深層硬腦膜前提下，用環(huán)鉆鉆孔并去除切下來的骨板所形成的圓盤形骨缺損。顱骨模型有以下特點：由于硬腦膜和皮膚提供支撐，不需要固定，骨再生不會受到動物活動的影響，但顱骨不負重，對材料的力學性能要求低，故此模型多用于測試填充型植骨材料。

新西蘭兔的下頜骨模型在下頜骨的下頜體處造成部分厚度或全部厚度的骨缺損，部分厚度缺損包括去除下頜頰皮層和下面的牙根，保留完整的骨內膜和牙周膜作為再生干細胞的潛在來源，而全層缺損包括頰皮層、牙根和舌皮層的切除［8］。

在四肢骨模型中，橈骨干或尺骨干缺損雖為非負重骨模型，以橈骨干缺損模型為例，其不需固定器固定，但實驗中尺骨可能因過度運動和負重導致骨折，長骨部分皮質骨或松質骨缺損模型對移植材料的力學性能要求較低，且制備的圓柱形缺損的大小容易受到該部位最小矢狀面前后徑或上下徑大小的限制。

3 缺損大小的選擇

實驗動物在自然情況下不能自行愈合的最小尺寸的骨缺損即臨界骨缺損或稱骨極限缺損（critical size defect,CSD）［9］。有學者認為長管骨CSD的大小應為骨直徑的1.5～2.5倍或骨長的十分之一［10］。為探尋不同骨骼不同部位的CSD值，骨干骨缺損模型一般將缺損處的骨膜和骨一并切除，圓柱形骨缺損模型的骨膜缺損通常比缺損空腔直徑大2～3 mm。研究人員常以毫米為間隔設計連續(xù)或不連續(xù)數值的骨缺損尺寸，還有學者在骨修復材料實驗中設立空白（缺損）組，從而研究CSD。目前絕大多數文獻采用此方法研究得到的臨界值如下。

SBD臨界值：橈骨干 15 mm［11］、尺骨干 16 mm［12］、肱骨干 7 mm［13］、股骨干 15 mm［14］、脛骨干10 mm［15］；但是，去除脛骨全長骨膜的脛骨大段SBD則為12 mm［16］，3個月齡兔和完全保留骨膜的成年兔的橈骨干SBD臨界值均為20 mm［17，18］；這些研究結果都是基于長管骨CSD的大小應為骨直徑的1.5～2.5倍或骨長的十分之一的觀點所做實驗得出的［10］。PC臨界值（直徑×深度）：股骨髁6 mm×10 mm［19］；脛骨近端內側 8 mm×6 mm［20］；肱骨大結節(jié) 10 mm×5 mm［21］。顱骨臨界值：直徑為 15 mm的圓形缺損［22］。下頜骨模型則常見制備成10 mm的圓孔狀全層骨缺損［8］、10 mm×10 mm 的方孔狀全層骨缺損［23］和12 mm×10 mm×2 mm（長×寬×深）方孔狀去除部分厚度形成凹槽的骨缺損［24］。

也有學者采用非臨界值進行骨缺損實驗研究，如：脛骨PC模型在脛骨內側近端一處同時制備兩個不相連且等體積的圓柱形缺損［25］；顱骨模型在顱骨矢狀縫兩邊各設計一個直徑為8 mm的圓盤形骨缺損［26］。這樣的設計具有節(jié)省實驗資源，同種內環(huán)境下相互對照，便于相同時間節(jié)點定量分析骨缺損區(qū)域形成的組織，使實驗結果更加客觀等優(yōu)點。

4 骨膜的處理

由于骨膜能為骨缺損部位提供營養(yǎng)物質和具有成骨潛能的干細胞，參與骨的自我修復，因此在骨干骨缺損模型制備過程中，骨膜是否去除及剝離程度對CSD值有一定的影響。潘朝暉等［18］將24只成年兔股骨干分別制造20 mm的骨缺損，并分為切除與截骨等長的骨膜和骨膜完全保留兩組，術后12周可見切除骨膜組有骨痂生長，骨端部分硬化，但未形成骨性連接；保留骨膜組骨缺損處有均勻的新生骨連接兩端，與缺損處兩端宿主骨難以分辨，出現(xiàn)骨性愈合；提示保留骨膜能促進新生骨的形成，骨修復能力也更好。Zhang等［27］所進行的同種異體骨聯(lián)合骨膜的骨修復實驗結果顯示，其修復能力與自體骨移植效果相當。

在截除一段骨干后對骨膜的處理主要有完全保留骨膜、切除與截骨等長的骨膜和在切除與截骨等長骨膜的基礎上通過擴髓去除兩斷端骨內膜等，它們的修復能力依次降低，對應的臨界缺損值也依次減小。

在對負載骨骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2、生長因子或成骨細胞的骨替代材料所進行的動物實驗中，為避免植入后受周圍組織所釋放的生長因子、成骨細胞等自身修復因素的干擾，常用不可吸收膜采用包裹或隔離的方式［23，28］，阻止血管長入及阻礙營養(yǎng)物質和生長因子等進入骨修復區(qū)域，以客觀反映載體的成骨性能及其與未負載或負載不同生物成分的骨替代材料在修復能力上的差異。

5 模型的固定方式

骨缺損實驗的固定方式主要有髓內針、鋼板［14，29，30］、外固定架［31］、自制固定器［32］等方式。髓內針固定需要移植材料中部有孔，多用于移植骨、醫(yī)用金屬等具有中空結構的力學性能較好材料的實驗；鋼板內固定很常見，如需加強固定可增加鋼絲或手術縫線在骨與鋼板或植入材料之間進行捆扎［14，29，30］，動物實驗中因動物活動等在外固定固定的種類上只能采取單臂外固定器進行固定。

不需要固定的模型，其優(yōu)點是不會受到異物排斥、影像阻擋、固定物費用限制等的影響。而需要固定的模型取螺釘會留孔洞，將影響生物力學的測試，但可以減少骨不愈合或畸形愈合等并發(fā)癥。

6 新西蘭兔一般信息的選擇

6.1 年齡

兔子的平均壽命為8～12年［33］。新西蘭兔年齡階段［34］分為：仔兔：0～1個月；幼兔：1～3個月；中期兔（青春期）：3～8個月；成年兔：8個月～3歲；老年兔：3歲以上。

新西蘭兔的年齡對CSD的大小有較大的影響?，F(xiàn)階段實驗結束時間常設置在12周左右，選擇骨修復能力快的中期兔和成年兔。幼兔的生長發(fā)育較快，但骨骼強度較弱不利于固定器的固定以及耐受手術的能力較差，常只作為骨髓間充質干細胞等生物成分的提供者。

實驗一般選擇骨成熟的兔，可參考兔齡和影像檢查。4月齡新西蘭兔骨骼已生長至其長骨長度的95%，且在5～8個月齡時停止［35］；有學者認為幼年兔的缺損較容易修復，建議實驗選擇大于6個月的兔［11，36］。同樣的，宋子鑒等［37］認為 8 個月齡兔骨骼生長基本發(fā)育成熟，可選擇8個月齡兔代表成年兔進行骨缺損模型的制備；Schlickewei等［20］為保證兔子骨骼成熟，只納入6個月及6月以上的兔，并通過X線觀察骨的發(fā)育情況來挑選需要的兔。此外，宋子鑒等［38］實驗發(fā)現(xiàn)6個月齡或更大的兔，其扭轉力學特性漸漸趨于平穩(wěn)。

綜上所述，可選擇6個月或>6個月齡的兔作為骨缺損動物模型。如實驗有需要，兔齡結合影像檢查的方法同樣適用選擇出幼齡兔或老年兔進行相關年齡階段的骨缺損修復實驗。

6.2 性別

性別對CSD的影響暫不清楚。Mapara等［39］認為性別的選擇通常沒有標準，但研究人員傾向選擇更加溫順的雌兔；而Mills等［40］認為雌性激素周期對骨的生長有顯著影響，尤其是生殖泌乳期間，骨生長會受到極大的抑制。同時，6個月齡雌性兔子已達到性成熟［21］。因此，在實驗中多數學者傾向選擇雄性兔或>6 個月齡雄兔作為實驗對象［12，19，21，25，37］。

6.3 體重

新西蘭兔體重是實驗需要考慮的影響因素，一般選擇3～3.5 kg以上的健康新西蘭兔進行實驗，可使實驗對象具有良好的承受外科手術的能力，并能防止大多數嚴重的術后問題，可獲得更高的生存率［39］。有研究表明體重過大會使實驗過程中橈骨干缺損模型的尺骨發(fā)生骨折［36，37］。

兔橈骨模型因不需要內外固定裝置穩(wěn)定斷端，體質量較大直接導致日?；顒又谐吖鞘芰υ龃?，在雙側同為實驗部位時更容易發(fā)生骨折，從而在實驗過程中需剔除或替換骨折兔。因此，為了實驗的順利進行，橈、尺骨模型選擇體質量不宜過大；其他長骨模型因需固定，同種情況下體重帶來的影響因素更小。

6.4 日常活動量

在兔骨缺損的相關研究中，較大的居住空間可以增加日?；顒恿?，對骨骼的形成有促進作用［36］。對于居住空間大小的選擇需根據實驗目的、經費、飼養(yǎng)及護理條件的實際情況進行設計，較大的活動空間可能使兔子活動過多導致內固定物松脫甚至折斷，需要考慮更多不確定的因素。而標準大小的籠飼養(yǎng)單只兔可避免疥瘡等高度傳染性疾病在兔群中傳播，且不會出現(xiàn)互相撕咬、競爭食物等情形；如果不是實驗明確需要，選擇標準籠飼養(yǎng)兔是首選。

7 小結

新西蘭兔骨缺損的長度是CSD模型的主要影響因素，年齡、骨膜剝離度和居住空間（日?；顒佣龋堑纳L也有影響，從而影響缺損的臨界值；性別因素的影響暫不明確，體重過大可能影響固定的穩(wěn)定性，甚至在雙骨部位發(fā)生支撐骨的骨折；骨骼結構和部位可以限制骨缺損的大小和類別的選擇。

另外，新西蘭兔骨缺損動物模型的制作及設計需綜合考慮:（1）根據實驗經費、目的、骨缺損制備手術的難易度和不同模型的優(yōu)缺點，選擇合適的部位、缺損值；（2）合理調整缺損的次要影響因素，如年齡、體重、居住空間、骨膜剝離度等；（3）合理設置兔的數量，并通過影像學和組織學等檢查方式，確認在實驗結束后未移植材料的缺損不能自愈。綜合近年來新西蘭兔骨缺損模型的實驗，為簡便操作，可選擇在標準籠中飼養(yǎng)6個月及6個月以上、體重3～3.5 kg的新西蘭兔作為骨缺損動物模型，根據部位合理選擇模型類別、骨膜剝離情況和缺損大小，最后再作適當的調整。