牛乳中嗜冷菌產(chǎn)耐熱酶的研究進展

鄧應(yīng)旺，韓雪，涂遠(yuǎn)強，王宇

哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院黑龍江（哈爾濱 150001）

牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等物質(zhì)，營養(yǎng)價值極高，被營養(yǎng)學(xué)家譽為“白色血液”而備受青睞[1]。牛乳的pH接近中性并且水分含量高，故牛乳也是一種優(yōu)良的微生物培養(yǎng)基質(zhì)，極其適于微生物的生長繁殖[2]。雖然鮮牛乳通常被認(rèn)定為是無菌的，但是擠奶和貯藏運輸?shù)冗^程易被微生物污染。隨著冷鏈運輸技術(shù)的普遍采用，牛乳中的嗜溫微生物生長停滯，而嗜冷菌選擇性地生長成為牛乳中的優(yōu)勢菌。

嗜冷菌是一類在0～5 ℃可以生長，最適生長溫度一般不超過15 ℃，但最高生長溫度可以高于20 ℃的微生物[3-4]。嗜冷菌種類繁多，從新鮮牛乳中最常分離到的是不動桿菌屬（Acinetobacter）、無色桿菌屬（Achromobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、腸桿菌屬（Enterobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬（Pseudo-monas）和沙雷菌屬（Serratia），其中假單胞菌屬是最主要的菌屬[5]。嗜冷菌是低溫貯藏牛乳中最活躍的一類微生物，與嗜溫微生物相比，其細(xì)胞膜組成成分有所不同，其中含有大量的多不飽和脂肪酸，熔點降低，使細(xì)胞膜在低溫下能有良好的流動性[6]；此外，嗜冷菌中還含有抗凍蛋白和冷休克蛋白[7]，這些能幫助嗜冷菌更好的在低溫下生長，并且嗜冷菌中參與代謝的酶所需活化能較低，催化效率高[8]，這都給它適應(yīng)低溫創(chuàng)造良好條件。

液態(tài)牛乳主要分為兩類，一類是巴氏殺菌乳，另一類是UHT乳。這兩類乳均采用熱處理的方式進行滅菌。雖然熱處理能有效殺滅嗜冷菌，但是嗜冷菌在低溫環(huán)境下分泌的酶高度耐熱，經(jīng)過高溫?zé)崽幚砣匀粴埩艋钚郧以谂Ｈ橘A藏期間通過分解蛋白質(zhì)和脂肪導(dǎo)致牛乳發(fā)生沉淀、凝膠和變味，造成發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)缺陷，進而影響產(chǎn)品貨架期[9]。近年來，隨著膜分離技術(shù)的成熟，由于它具備運行溫度低、不易相變、可避免由熱加工帶來的乳營養(yǎng)損失等優(yōu)點，是一種安全的冷殺菌技術(shù)而受到越來越多乳制品加工企業(yè)的青睞。北京三元極致ESL乳就是利用微濾殺菌的乳制品。雖然膜分離通過截留微生物保證乳品的安全性，但是由于嗜冷菌所產(chǎn)耐熱酶分子質(zhì)量較小，不能被有效截留而殘留到乳中，造成乳制品保藏過程中變質(zhì)。因此無論是熱殺菌還是冷殺菌，對牛乳中的嗜冷菌及其產(chǎn)生的耐熱酶進行研究并找出切實可行的控制方法十分重要。

1 嗜冷菌的分布及多樣性

地球上有80%左右的表面處于15 ℃以下，深海地區(qū)、高寒地區(qū)、永久凍土地區(qū)及極地地區(qū)占據(jù)地球的絕大部分[10]，這些低溫地區(qū)都為嗜冷菌提供基本的生長繁殖環(huán)境。嗜冷菌分布廣泛，有研究相繼從海洋[11]、北極[12]、南極洲[13]、龍蝦肌肉[14]中分離到嗜冷菌，在牛乳中分離到的嗜冷菌主要是假單胞菌屬[15]。

身體狀況良好的奶牛分泌的牛乳一般被認(rèn)為是無菌的，因此牛乳中的嗜冷菌主要來自于外部環(huán)境，它們的種類和數(shù)量也因貯運溫度、地域因素、季節(jié)因素和貯藏時間變化而變化。Izidoro等[16]研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯存溫度升高，嗜冷菌數(shù)量也隨之增加，因此嚴(yán)格控制低溫貯運能有效減少嗜冷菌數(shù)量。Hantsis-Zacharov等[17]研究來自以色列北部4個不同農(nóng)場的原料乳經(jīng)冷藏后可培養(yǎng)嗜冷菌的多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中主要的嗜冷菌為相同菌屬，但每種樣品的菌群結(jié)構(gòu)并不相同。Kable等[18]比較春、夏和秋三季采集的牛乳的菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)春季樣品中微生物的多樣性指數(shù)最高，并且認(rèn)為降雨可能是導(dǎo)致該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因。但是，冬季的牛乳中嗜冷菌在微生物菌群中所占比例最高，春秋季節(jié)稍低，夏季最低[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，原料乳在4 ℃條件下貯存時間的延長會導(dǎo)致Pseudomonasspp.和一些Bacillusspp.數(shù)量的增加[20]。直接從乳房分泌出來的牛乳中主要是革蘭氏陽性的嗜中溫需氧菌，只有10%是嗜冷菌，冷藏1 d后，嗜冷菌的含量可增加到微生物總量的50%；冷藏2 d后，嗜冷菌可達到微生物含量的90%以上[5]。由此可見，牛乳從分泌到加工這段時間越短越好，能有效減少嗜冷菌數(shù)量增加。

2 嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶及其危害機制

嗜冷菌菌體本身對牛乳的危害有限，經(jīng)過熱處理，嗜冷菌基本不能存活，但是其在低溫條件下分泌的酶具有高度耐熱性，經(jīng)過巴氏殺菌甚至經(jīng)過UHT處理依然能保持一定活性，在牛乳的后續(xù)貯藏中分解蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，影響牛乳風(fēng)味，破壞牛乳質(zhì)地，造成腐敗變質(zhì)。

2.1 蛋白酶對牛乳的影響

牛乳中的蛋白酶包括：乳自身的纖維蛋白溶酶和由嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶，其中纖維蛋白溶酶在生乳中主要以無活性的酶原形式存在，經(jīng)過熱處理幾乎完全失活；而嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶經(jīng)過UHT處理仍殘留一部分的活性。嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶有胞內(nèi)、胞壁和胞外蛋白酶，當(dāng)菌體被殺死后，胞內(nèi)和胞壁蛋白酶釋放到乳中影響產(chǎn)品的品質(zhì)。研究主要集中于嗜冷菌產(chǎn)的胞外蛋白酶上，尤其是假單胞菌屬所產(chǎn)的胞外蛋白酶。

2.1.1 胞外蛋白酶的熱穩(wěn)定性

嗜冷菌分泌的胞外蛋白酶多為堿性金屬蛋白酶，Zn2+和Ca2+構(gòu)成其酶活中心，相對分子質(zhì)量多為40～50 kDa，一般出現(xiàn)在對數(shù)生長末期，最適生長溫度30～40℃、pH 6～8，大多數(shù)嗜冷菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶具有良好耐熱性，在140 ℃下的D值為2～300 s[21]。純化后的蛋白酶在乳中比在水中有更高的穩(wěn)定性，乳脂肪的存在會增加蛋白酶的耐熱性[22]，且乳脂對蛋白水解有促進作用。Dong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，對于乳脂對蛋白水解活性的影響，有這樣幾種可能的解釋：脂肪會影響假單胞菌的代謝，刺激酶的產(chǎn)生；脂肪會影響蛋白酶釋放的形態(tài)，蛋白酶更多地暴露活性位點，使其更容易水解蛋白質(zhì)；水乳狀液似的脂肪可以協(xié)助蛋白水解酶與其底物之間的疏水相互作用，可能增加活性位點和肽鍵之間的可達性，促進蛋白酶活性。此外，Chunyue等[23]發(fā)現(xiàn)AprX的熱穩(wěn)定性主要歸功于其靈活的三級結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度再次降低時，它可以通過鈣鹽橋的形成快速準(zhǔn)確地重新折疊。鈣存在時，蛋白酶AprX的耐熱性也隨之提高。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶在乳中具有較強的復(fù)原活性，經(jīng)過高溫?zé)崽幚?，未徹底失活的蛋白酶在溫度降低后再次?fù)原成能分解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這一特性決定一旦牛乳中原始蛋白酶數(shù)量過多，單一的熱處理方式將不能有效抑制蛋白酶[24]。此外，雖然胞外蛋白酶有良好的耐熱性，但多數(shù)嗜冷菌蛋白酶也具有低溫失活現(xiàn)象，即蛋白酶在40～70 ℃熱處理較為敏感，這可能是由酶分子間的自我水解引起的[25]。

2.1.2 胞外蛋白酶對牛乳的危害

蛋白酶是一類水解酶，它催化蛋白質(zhì)水解成氨基酸。嗜冷菌在低溫時大量分泌蛋白酶，經(jīng)過巴氏殺菌和UHT處理，嗜冷菌被滅活但蛋白酶耐高溫能持續(xù)影響牛乳的質(zhì)量。在UHT乳中，陳化膠凝是最常見的質(zhì)量缺陷問題，以貯存過程中牛乳的流動性損失為特征，牛乳的黏度在較長時間內(nèi)保持恒定，有時甚至稍有降低；之后黏度陡然提高（成熟稠化），并且不久便形成不能再分散的凝膠。凝膠有多種不同類型，從弱而透明的膠凝狀態(tài)到似凝乳酶凝乳的膠凝狀態(tài)。

陳化膠凝是一個純粹的物理-化學(xué)凝聚過程，即使產(chǎn)品己形成像凝乳酶凝塊似的凝膠，它仍可能是無菌狀態(tài)。對陳化膠凝化的機理有兩種解釋，有學(xué)者認(rèn)為在牛乳貯存期間發(fā)生的陳化膠凝現(xiàn)象是由乳中殘留的蛋白酶活性造成的：乳蛋白被蛋白酶水解，通過形成肽來促進老化凝膠化[26]。乳中的蛋白酶來源有2種：一是嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶；二是乳中內(nèi)源性蛋白酶即纖溶酶系，這種酶也能在UHT處理中活下來[27]。也有學(xué)者認(rèn)為牛乳膠凝化老化是一種非酶或物理化學(xué)變化，在此過程中沒有觀察到蛋白質(zhì)的降解，但這一過程速度較慢，通常需要超過12個月的時間[28]?；诖耍琙hang等[29]研究蛋白酶AprX和血纖維蛋白溶酶對牛乳的影響，為減少非酶物理化學(xué)變化的干擾，通過在較短的時間內(nèi)加入高濃度的酶來進行相關(guān)研究，得出蛋白酶AprX和血纖維蛋白溶酶都能導(dǎo)致牛乳陳化膠凝化，但機制有所不同，AprX主要是通過水解κ-酪蛋白形成副κ-酪蛋白，使κ-酪蛋白無法發(fā)揮穩(wěn)定蛋白質(zhì)的性能，導(dǎo)致蛋白質(zhì)集中，最后蛋白質(zhì)在重力作用和Ca2+作用下逐漸沉到底部，這個過程中乳清不斷排出，出現(xiàn)凝膠。而血纖維蛋白溶酶則是通過水解β-酪蛋白和α-酪蛋白，導(dǎo)致γ-酪蛋白含量升高形成軟凝膠破壞牛乳質(zhì)量。

UHT乳在貨架期內(nèi)還會出現(xiàn)澀味、苦味等風(fēng)味的變化。UHT乳中殘留的耐熱蛋白酶水解乳蛋白形成氨基酸和短肽所致，這些短肽和氨基酸殘基（蘇氨酸等）自身帶有苦味，影響產(chǎn)品口味。蛋白水解的發(fā)展所導(dǎo)致的牛奶產(chǎn)生苦味，這是陳化凝膠現(xiàn)象可能發(fā)生的一個重要特征。

2.2 脂肪酶對牛乳的影響

乳脂肪被分泌于乳脂肪球的一個單一結(jié)構(gòu)，乳脂肪球由一個包含96%～97%的三酰基甘油的核組成，被磷脂和蛋白質(zhì)層包裹。為了受到脂解酶的作用，三酰基甘油必須通過脂肪球薄膜的分解釋放到水相。三?；视捅恢久杆猱a(chǎn)生自由脂肪酸，以此產(chǎn)生不良風(fēng)味如酸臭味、辛辣味、苦味、澀味等，使牛乳及其衍生物不可食用[30]。

牛乳的水解酸敗主要是由于其中的脂肪酶水解乳脂肪造成的。牛乳中的脂肪酶主要有兩種來源，一種是牛乳自身含有的脂蛋白酯酶，另一種是牛乳中污染的微生物產(chǎn)生的脂肪酶。脂蛋白酯酶在乳中含量很低、不耐高溫，75 ℃、5 min或65 ℃、20 min的熱處理或254 nm下紫外線照射30 min可使其失活[31]。脂蛋白脂酶的熱穩(wěn)定性較差，經(jīng)過熱處理基本被滅活，因此主要是對殺菌前的牛乳有影響。牛乳中微生物產(chǎn)生的脂肪酶主要來源于嗜冷菌所產(chǎn)的脂肪酶，這類脂肪酶高度耐熱，即使經(jīng)過UHT處理仍能殘留20%～30%的活性[32]。殘留的脂肪酶在后續(xù)牛乳的貯藏中持續(xù)進行破壞，分解脂肪成脂肪酸，導(dǎo)致牛乳酸敗。

脂肪酶是甘油三酯?；饷?，是一種絲氨酸水解酶。脂肪酶除水解三?；视屯?，還能夠催化酯化反應(yīng)、酯交換、酸解、醇解及氨解等。一些嗜冷菌分泌的脂肪酶經(jīng)過高溫處理能夠保持大部分活力，有的脂肪酶在150 ℃時的D值（酶活性減少90%所需的時間）達到290 s[33]。與牛乳中的脂蛋白脂肪酶相比，嗜冷菌產(chǎn)生的脂肪酶能夠?qū)Π谥厩蛲獾闹厩蚰みM行破壞，使其失去對脂肪的保護作用，嚴(yán)重破壞原料乳和乳制品中的脂肪[34]。由于脂肪球膜被破壞，脂肪球失去穩(wěn)定性，粘在一起，嚴(yán)重時表現(xiàn)出脂肪上浮。同時，脂肪被分解釋放出的游離脂肪粘合，互相碰撞的脂肪球形成脂肪球簇，也會導(dǎo)致乳中脂肪上浮[35]。Zhang等[36]研究發(fā)現(xiàn)將UHT乳進行加熱和均質(zhì)，均質(zhì)作用使天然乳脂肪球機械破碎成更小的顆粒，之后天然乳脂肪球膜不足以覆蓋較大的脂肪球表面積。因此，脂肪球的表面被吸附的牛奶蛋白所覆蓋和穩(wěn)定，主要是酪蛋白，可將其稱為脂肪表面吸附蛋白（FSAP）。而耐熱性的蛋白酶能夠水解α-酪蛋白和β-酪蛋白，破壞乳脂肪球和酪蛋白表面結(jié)構(gòu)，引起脂肪與脂肪、脂肪與酪蛋白結(jié)合并聚集，形成小的薄片浮于乳的上部[37]。

UHT乳中殘留的耐熱脂肪酶對乳脂肪的水解產(chǎn)生脂肪氧化味，特別是水解產(chǎn)生的一些游離脂肪酸具有不良風(fēng)味。因此，控制UHT乳中殘留脂肪酶和蛋白酶的含量可有效抑制UHT乳貯存期間的脂肪和蛋白水解，從而有效防止UHT乳貯存期間風(fēng)味的改變。

3 嗜冷菌及其耐熱酶的控制

牛乳中的嗜冷菌及其耐熱酶短期內(nèi)無法找到合適的方法去徹底消滅，但可以采取一些方法來適當(dāng)控制嗜冷菌的生長以降低損失。1）控制原料乳中的嗜冷菌數(shù)量。中國現(xiàn)行國標(biāo)GB 19301—2010規(guī)定生乳的微生物含量≤2×106CFU/mL。有研究發(fā)現(xiàn)，原料乳中一定數(shù)量的嗜冷菌（106CFU/mL）不適宜長期UHT乳（保質(zhì)期9個月），但在制作奶酪時對奶酪令人滿意的風(fēng)味和芳香有益[38]。在衛(wèi)生條件良好的情況下，在取自健康奶牛的新鮮生奶中，嗜冷菌的數(shù)量少于102CFU/mL，但是原料乳從分泌到加工通常需要一定時間，這段時間有利于嗜冷菌生長[39]。Dong等[40]研究發(fā)現(xiàn)，原料乳在7 ℃冷藏時嗜冷菌數(shù)量每天以10 CFU/mL增長，經(jīng)過UHT處理之后，原料乳中原始細(xì)菌數(shù)量越多，蛋白水解程度越快。因此，應(yīng)盡量縮短原料乳從分泌到加工這段時間以減少嗜冷菌的原始數(shù)量。2）深度冷藏。相同的原料乳在2 ℃儲存比在4 ℃儲存生產(chǎn)出的UHT乳保質(zhì)期更長，可采用深度冷藏的方法減少嗜冷菌及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[41]。3）低溫鈍化。將原料乳或UHT牛乳在55 ℃下熱處理60 min通常能夠使產(chǎn)品中的蛋白水解酶活性顯著降低。然而，將低溫鈍化應(yīng)用于實際生產(chǎn)中會有很多麻煩，其中最重要的是來源于不同微生物的蛋白酶表現(xiàn)出不同的鈍化溫度，從50～60 ℃不等，由于這些溫度特異性非常強，所以除非了解每一批牛奶所污的染酶的特性，否則所選擇的低溫鈍化的條件將是無效的。4）利用加壓CO2。劉美鳳等[42]研究加壓CO2對熒光假單胞菌的殺菌效果，證明加壓CO2可以有效殺滅熒光假單胞菌并抑制蛋白酶的分泌。5）高壓均質(zhì)。Oliveira等[43]研究發(fā)現(xiàn)，高壓均質(zhì)能降低熒光假單胞菌蛋白酶造成的乳蛋白水解。對于含3%脂肪的牛乳，在100 MPa高壓均質(zhì)處理下，蛋白水解程度降低29%，膠凝化出現(xiàn)的時間至少延遲23 d；在150 MPa高壓均質(zhì)處理下，蛋白水解程度降低51%，膠凝化出現(xiàn)的時間至少延遲40 d。雖然高壓均質(zhì)能減緩蛋白水解的速度，但不能鈍化嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶，也不能降低脫脂乳中的蛋白水解程度。

目前最有效的方法依舊是控制原料乳中的原始嗜冷菌數(shù)量，縮短原料乳從分泌到加工的時間，有效減少微生物數(shù)量，相應(yīng)地耐熱酶含量也降低，這能有效保證乳及乳制品的質(zhì)量。

4 結(jié)語與展望

嗜冷菌及其產(chǎn)生的耐熱酶對牛乳的品質(zhì)有很大影響，雖然對嗜冷菌及其耐熱酶進行廣泛研究并取得進展，許多學(xué)者也從牛乳中陸續(xù)分離出多種耐熱酶并對其進行酶學(xué)性質(zhì)研究，但是尚沒有方法能徹底消滅牛乳中嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱酶，并且與快速檢測牛乳中的耐熱酶及有效控制嗜冷菌耐熱酶的產(chǎn)生和活性仍有差距。