鮑曼不動桿菌的致病因子和耐藥機制

陳肖 王立坤 劉衛(wèi)東 左志文

1 徐州醫(yī)科大學藥學院，江蘇徐州221004；2 臨沂市人民醫(yī)院感控病區(qū)，山東臨沂276000；3 臨沂市人民醫(yī)院藥學部，山東臨沂276000；4 臨沂市人民醫(yī)院感染管理部，山東臨沂276000

鮑曼不動桿菌（Ab）是不動桿菌屬呈單個或成對排列的需氧性革蘭陰性球桿菌，無芽孢和鞭毛，有莢膜和菌毛，乳糖發(fā)酵試驗陰性、氧化酶、動力及硝酸鹽還原實驗皆為陰性[1]，營養(yǎng)需求低，抵抗力強，可在自然環(huán)境中長期存活，具有強黏附性，容易造成危重患者的院內(nèi)感染，非發(fā)酵革蘭陰性桿菌中Ab 臨床感染僅次于假單胞菌。

多種機制導(dǎo)致細菌耐藥率和檢出率高居不下， 近年Ab對亞胺培南和美羅培南的耐藥率逐年增加。 據(jù)報道，2019 年Ab 僅多黏菌素B 和替加環(huán)素耐藥率較低， 對部分青霉素/酶抑制劑和喹諾酮類耐藥率均在70%以上[2]。CHINET 官網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，2019 年全國有11 個省市碳青霉烯類耐藥Ab 檢出率在73%以上，亟需采取措施遏制Ab 暴發(fā)流行的趨勢。本文對Ab 的致病因子和耐藥機制進行概述。

一、毒力因子

1.膜孔蛋白

外膜孔蛋白調(diào)節(jié)細胞滲透性， 其中OmpA 是β-桶狀蛋白，也是Ab 的主要孔蛋白，和纖連蛋白相互作用并通過菌毛結(jié)構(gòu)黏附并侵襲上皮細胞，釋放促凋亡分子誘導(dǎo)細胞凋亡[1]。OmpA 作用于線粒體產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)凋亡或壞死， 可通過MAPK/JNK 通路介導(dǎo)細胞自噬[3]，與宿主補體調(diào)節(jié)因子結(jié)合，阻斷補體旁路途徑， 使Ab 在血清中繁殖， 逃避免疫清除。Omp33-36 通過激活半胱天冬酶和調(diào)節(jié)自噬， 活化促凋亡蛋白，激活炎性相關(guān)蛋白表達，誘導(dǎo)多種不同細胞類型的細胞凋亡[4]；敲除Omp33-36 基因的菌株，對宿主上皮細胞粘附性和侵襲性大大降低， 也更易被免疫清除。 N1pA 作為Omp22的重要抗原因子， 擴增基因后構(gòu)建疫苗刺激機體免疫應(yīng)答，減少小鼠器官和外周血中的細菌數(shù)量， 提高小鼠存活率[5]。OprD 是可滲透性孔蛋白，蛋白下調(diào)后細菌細胞滲透性下降，OprD 和CarO 蛋白表達降低可影響細菌對碳青霉烯類產(chǎn)生耐藥。

2.莢膜多糖和磷脂酶

細菌細胞壁周圍包裹整個菌體的黏液樣物質(zhì)， 稱為莢膜，主要成分是水和多糖。 莢膜多糖位于細菌最外層保護細菌免受外部威脅，必需基因ptk 和epsA 促進其合成，保護細菌逃避免疫機制，pglC 或pglL 基因負責糖蛋白和莢膜多糖上O-五糖的合成，突變后形成異常的生物膜結(jié)構(gòu)。 莢膜多糖和脂多糖的保守基因簇“K 位點”，其表達受雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)bfmRS 基因調(diào)控[1]，利于細菌在血清和腹水中生長，在組織感染部位存活。莢膜多糖是Ab 產(chǎn)生補體抗性的主要原因，可被認為是Ab 的主要毒力因子， 因為缺失莢膜的Ab 毒性更小，易被補體殺傷[6]。

磷脂酶（PLC、PLD）裂解宿主細胞膜磷脂層，促使細菌侵入宿主細胞，PLD 基因敲除后細菌對血清抵抗力降低， 侵襲上皮細胞能力減弱，還有助于細菌傳播至其他組織部位。 有研究篩選出帶有PLC 基因的Ab 菌株，和不含有該基因的其他菌株用大蠟螟感染試驗和A549 細胞黏附-侵襲試驗測試菌株的致病性，結(jié)果顯示PLC 的存在能增強Ab 菌株的侵襲力和殺傷力[7]。

3.外膜囊泡（OMVs）和青霉素結(jié)合蛋白（CBPs）

OMVs 由肽聚糖、磷脂、脂多糖等組成，能向宿主細胞傳遞OmpA、蛋白酶、磷脂酶等多種物質(zhì)[1]，而無需細菌與宿主細胞直接接觸。 Ab 標準菌株純化的外膜囊泡以劑量依賴性誘導(dǎo)上皮細胞中促炎細胞因子基因的表達[8]。 高濃度OMVs 對DC 呈明顯的細胞毒作用， 而低濃度OMVs 能增強其提呈抗原作用。 外膜囊泡還可以誘導(dǎo)細菌耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移[9]，表明OMVs 與抗菌藥物耐藥性的傳播有關(guān)。

PBPs 參與細菌細胞壁胞質(zhì)外階段的肽聚糖生物合成，也是結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物使其失活的靶點。 低分子量PBP 7/8 的編碼基因pbpG 突變后，菌株在人血清和動物模型中生存能力降低， 電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)突變株和野生株形態(tài)不一，缺失PBP 7/8 影響肽聚糖合成[10]，PBP1A 糖基轉(zhuǎn)移酶[11]參與維持細胞壁穩(wěn)定性，有助于Ab 的正常細胞分裂。

4.鐵攝取

不動桿菌素是Ab 的毒力因子之一， 也是一種混合型鐵載體，對鐵有很高的親和力，不動桿菌素生物合成和轉(zhuǎn)運功能受損時顯著降低了Ab 標準菌株在上皮細胞的存活能力。entA 是合成不動桿菌素前體2，3-二羥基苯甲酸的重要基因，基因突變后縮短菌株細胞在人肺泡上皮細胞的生存時間，減弱菌株殺滅大蠟螟幼蟲的能力[12]。bas 和bar 基因在不動桿菌素基因簇中的位置對不動桿菌素鐵載體中鐵的獲取和吸收也有重要作用。 細菌通過鐵離子介導(dǎo)的鐵在細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著重要的保護作用。

5.其他

此外Ab 蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)（T1SS、T2SS、T6SS）分泌效應(yīng)蛋白作用于靶細胞[13-14]。 T1SS 分泌的蛋白質(zhì)不易被水解，且可以直接將蛋白質(zhì)從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外， 介導(dǎo)Ab 形成生物膜粘附宿主細胞。T2SS 依賴信號肽（sec）轉(zhuǎn)移酶，主要分泌水解酶和毒素并獲取營養(yǎng)，增強細菌毒力[14]。 T6SS 分泌多種效應(yīng)因子殺傷靶細胞和競爭細菌，包括肽聚糖水解酶、脂肪酶、溶血素-聯(lián)合調(diào)節(jié)蛋白 （hcp）、 纈氨酸-甘氨酸-精氨酸蛋白G（VgrG）等，總體使細菌黏附侵襲能力增強，提高細菌致病性，并在宿主細胞內(nèi)適應(yīng)存活[14-15]。

二、耐藥機制

1.產(chǎn)生藥物滅活酶

（1）β-內(nèi)酰胺酶

基于序列同源性可分為A～D 4 類， 其中B 類是金屬β-內(nèi)酰胺酶，主要包括VIM、IMP 等，可水解頭孢菌素、碳青霉烯類，不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制，是Ab 對碳青霉烯類耐藥的重要機制。 C 類屬于頭孢菌素酶（AmpC 酶），由染色體介導(dǎo)，是Ab 天然固有，對碳青霉烯類敏感，編碼基因blaADC-30、51、53 與AmpC 酶表達菌株耐頭孢菌素類機制相關(guān)[1]。 D 類β-內(nèi) 酰 胺 酶 屬 于 苯 唑 西 林 水 解 酶 （OXA 酶），OXA-23 和OXA-51 是D 類的主要亞型，Ab 天然攜帶blaOXA-51， 水解碳青霉烯類活性弱于B 類， 影響細菌包膜通透性和外排泵。OXA-23 存在于質(zhì)?；蛉旧w上， 經(jīng)由整合子和克隆機制在細菌間水平轉(zhuǎn)移而引起廣泛耐藥傳播[16-18]。

上游插入ISAba1 基因能上調(diào)A 類超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的表達，啟動C 類編碼基因bla-ADC[19]，使AmpC 酶水平高表達，并對D 類OXA-23 具有協(xié)同作用[20]，增強固有基因blaOXA-51 水解碳青霉烯的活性。

（2）氨基糖苷類修飾酶

Ab 通過aacC1、aacC2 和aacA4 編碼乙?；浮phA1 和APH（3''）編碼磷酸化酶或aadB、aadA1 使酶核苷化使氨基糖苷類抗生素藥物結(jié)構(gòu)鈍化失活，編碼基因一般位于Ⅰ類整合子，常見基因有aphA1、aphA6、aacC2、aacC3、aacA4、ant3n[21]；還產(chǎn)生16S rRNA 甲基化酶（ArmA），保護細菌核糖體30S 亞基結(jié)合位點16S rRNA 氨基酰-t R NA，導(dǎo)致產(chǎn)酶菌株對所有氨基糖苷類幾乎全部耐藥。

2.藥物作用靶點結(jié)構(gòu)改變或被保護

除上述提到的ArmA 酶甲基化16S rRNA 使菌株不被氨基糖苷類藥物抑制， 喹諾酮類分別編碼2 個作用靶點DNA螺旋酶（GyrA2B2）和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ（ParC2E2）部分亞基的gyr A 和parC[1]突變，會引起藥物與酶結(jié)合能力減弱，并且由質(zhì)粒介導(dǎo)的qnr 基因可以保護DNA 螺旋酶，導(dǎo)致菌株對喹諾酮類的嚴重耐藥。 青霉素結(jié)合蛋白缺失或表達減少使得該細菌對β-內(nèi)酰胺類耐藥，脂多糖被修飾或缺失能降低菌株對多黏菌素的敏感性。

3.減少進入菌體內(nèi)的藥量

（1）外排泵系統(tǒng)

已知的外排泵系統(tǒng)主要包括5 大家族[1]，其中4 個家族都是依賴質(zhì)子動力勢能獲得能量。 耐藥結(jié)節(jié)細胞分化家族（RND 家族）中AdeABC、AdeFGH 和AdeIJK 能將氨基糖苷類等多種抗菌藥物泵出， 也把溴已定等消毒劑作為底物，導(dǎo)致消毒劑在常規(guī)使用濃度下不能抑制或殺滅細菌； 另外AdeFGH 和AdeIJK 分別介導(dǎo)獲得性和固有性耐藥。 劉獻清等[22]分別敲除RND 家族主要外排泵基因并對比敲除前后該菌株對抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），結(jié)果顯示adeB 基因?qū)毦退幮杂绊懽畲蟆?主要協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白超家族（MFS）特異性藥物外排泵TetA 和TetB 編碼基因引起四環(huán)素耐藥，CmlA 和CraA 介導(dǎo)氯霉素耐藥。 多藥及毒性化合物外排家族（MATE 家族） 編碼基因AbeM 介導(dǎo)亞胺培南和氟喹諾酮類，小多重耐藥家族（SMR 家族）編碼基因AbeS，還有其他家族 編 碼 基 因 EmrAB -TolC、A1S_1535、A1S_2795、ABAYE_0913 均不同程度對多種抗菌藥物耐藥，包括奈替米星、妥布霉素、氯霉素等。

（2）外膜通透性

外膜蛋白是革蘭陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，OmpA 是Ab 最主要的膜孔蛋白，也是致病因子之一，在Ab 黏附侵襲、誘導(dǎo)凋亡、形成生物被膜中扮演重要角色，也能幫助細菌免疫逃逸，OmpA 和CarO 能夠與OXA-23 碳青霉烯酶相互作用，影響細菌對藥物敏感性。 下調(diào)CarO、Omp22、Omp33-36、Omp43-44 等孔蛋白的表達和耐碳青霉烯類水平有相關(guān)性[3-4]。

（3）生物被膜

生物被膜的形成可導(dǎo)致細菌MIC 高達無被膜細菌的10～1 000 倍[23]，Ab 形成生物被膜受多種因素調(diào)控， 菌毛由csuA/BABCDE 基 因 編 碼 合 成， 同 時 也 受BfmSR、GacSA、CheA/Y 雙組分系統(tǒng)[23-25]和外排泵系統(tǒng)調(diào)控，細菌激活群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)通過Ab 自身分泌自誘導(dǎo)信號分子乙酰高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs），進而促使浮游狀態(tài)的Ab 轉(zhuǎn)化為生物被膜[26]。細胞外基質(zhì)黏附包裹細菌、外排泵部分基因[25]在生物被膜細胞中表達增多，基因缺失菌株則生物被膜形成減少、以外膜蛋白為主的外膜囊泡參與黏附上皮細胞[27]、金屬離子濃度[1]和碳青霉烯類耐藥基因[28]等均可調(diào)控生物被膜形成過程。

三、結(jié)語

近年來，Ab 耐藥株在院內(nèi)廣泛流行，體外聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果良好，但實際應(yīng)用療效有限，尤其顱內(nèi)感染用藥選擇性較少。 因此，進一步研究Ab 致病性和耐藥機制，對尋求突破有重要意義，此外，還應(yīng)加強Ab 的感控管理，制定相關(guān)干預(yù)措施控制臨床耐藥菌株的傳播，注重合理應(yīng)用抗菌藥物避免誘導(dǎo)耐藥。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突