A型塞內(nèi)卡病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

朱亭帆，錢金涵，王強(qiáng)，金文杰

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

A型塞內(nèi)卡病毒(SenecavirusA，SVA)原名Seneca Valley virus(SVV)，是一種無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于微RNA科(Picornaviridae)塞內(nèi)卡病毒屬(Senecavirus)[1]。SVA最初被確認(rèn)為是一種細(xì)胞培養(yǎng)污染物[2]，但隨后加拿大和美國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)其是豬水皰病(IVD)的病原體[1]。Knowles等[3]做了回顧性研究，發(fā)現(xiàn)SVA在美國(guó)豬群中實(shí)際存在已經(jīng)超過(guò)30年。2014年之前，僅有少數(shù)關(guān)于SVA的報(bào)道，但是2015年之后，巴西[4]、中國(guó)[5]、越南[6]和泰國(guó)[7]等國(guó)家都報(bào)道了與SVA有關(guān)的IVD病例發(fā)病率的增加。SVA感染豬的病變以水皰形成和表皮糜爛為特征，發(fā)展為冠狀血管帶、口腔和鼻平面的潰瘍，受影響的動(dòng)物出現(xiàn)發(fā)燒和跛行[8]。此外，SVA也與新生仔豬死亡率的增加呈正相關(guān)[9]。雖然本病還沒(méi)有大規(guī)模暴發(fā)，但是SVA引發(fā)的臨床癥狀與口蹄疫病毒(FMDV)、豬水皰病病毒(SVDV)、豬水皰口炎病毒(VSV)、豬皰疹病毒(VESV)引起的水皰病不易區(qū)分，并且它是一種外來(lái)疾病，一旦暴發(fā)給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的損失是不容小覷的。因此，對(duì)SVA快速有效的檢測(cè)就顯得尤為重要，本文就SVA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。

1 病原鑒定

1.1 SVA的分離與鑒定

從患豬血清、糞便、扁桃體、口腔、水皰液等病料中成功進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)和鑒定是診斷病毒感染的一般方法。可用于分離SVA的細(xì)胞系有很多種，其中包括人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER-C6)[2]、人肺癌細(xì)胞(NCI-H1299)[10]、人胚胎腎細(xì)胞(HEK293T)[11]、豬睪丸細(xì)胞(ST)[12]、幼齡倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)和豬腎細(xì)胞(PK-15)[13]。SVA感染可引起細(xì)胞病變，利用傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法分離病毒可以為基于流行病學(xué)、血清學(xué)和抗病毒敏感性試驗(yàn)的研究提供基礎(chǔ)。然而，用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒分離也有缺點(diǎn)，包括：需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)誘導(dǎo)和觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)；需要專業(yè)的技術(shù)知識(shí)；有時(shí)疑似被感染的樣本數(shù)量過(guò)于龐大，對(duì)樣本中是否有病毒存在的評(píng)估就會(huì)耗時(shí)耗力，所以通過(guò)細(xì)胞分離病毒進(jìn)行SVA臨床快速檢測(cè)不是最佳方法。

1.2 原位雜交(ISH)和免疫組化(IHC)

ISH和IHC這2種方法分別用來(lái)鑒定組織樣本中的特定病毒核酸和抗原。很多研究已經(jīng)成功使用這2種技術(shù)來(lái)進(jìn)行SVA相關(guān)疾病的診斷。ISH是一種在完整染色體內(nèi)對(duì)特異性DNA片段定位技術(shù)，將標(biāo)記的核酸探針與組織細(xì)胞中的待檢測(cè)核酸特異結(jié)合，再用檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)標(biāo)記探針，同時(shí)顯示核酸所在的位置。Joshi 等[8]將育肥豬經(jīng)口鼻途徑接種SVA株SD15-26，觀察與SVA感染相關(guān)的臨床癥狀和病變，并通過(guò)RT-qPCR和原位雜交(ISH)在第38天收集的組織中發(fā)現(xiàn)，所有感染了SVA的動(dòng)物的扁桃體中都存在SVA RNA。隨后，Resende 等[14]于2017年也開(kāi)發(fā)了一種新的基于RNA的原位雜交技術(shù)(ISH-RNA)來(lái)檢測(cè)感染組織中的SVA RNA。與經(jīng)典原位雜交技術(shù)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性染色相比，新的ISH-RNA技術(shù)有較高的特異性，其極大地消除了這一限制，且與qRT-PCR技術(shù)的結(jié)合將會(huì)為豬SVA的診斷提供一種高靈敏度和特異性的方法。IHC是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)和定位組織和細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)的技術(shù)。Leme 等[15]對(duì)巴西不同地理區(qū)域的7個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)中由于皮膚、腸道和神經(jīng)系統(tǒng)疾病而死亡的仔豬進(jìn)行了研究，用針對(duì)SVA的單克隆抗體進(jìn)行的IHC結(jié)果顯示大腦脈絡(luò)叢、舌頭潰瘍病變上皮、腎臟和膀胱的尿路上皮以及腸表面細(xì)胞有免疫反應(yīng)。但是這種技術(shù)必須依賴于單克隆抗體，標(biāo)記每一種特異性抗體只能檢測(cè)一種抗原，敏感性較差，同時(shí)反應(yīng)的信號(hào)也較小，特別是對(duì)于組織或細(xì)胞內(nèi)微量抗原的檢測(cè)。

1.3 病毒基因組檢測(cè)

在所有的檢測(cè)方法中，目前分子檢測(cè)法被更多的用于SVA RNA的檢測(cè)。因?yàn)檫@些方法不需要長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)，并且由于這些技術(shù)針對(duì)的是病毒的核酸，所以也不需要通過(guò)盲傳來(lái)進(jìn)行病毒的分離，最重要的是分子分析快速、特異和靈敏。因此，對(duì)一些在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系培養(yǎng)中不會(huì)增殖的病毒就可用此種方法進(jìn)行檢測(cè)。分子技術(shù)還可以分析出病毒的基因組特征或基因進(jìn)化規(guī)律，這對(duì)于在特定時(shí)期或地理區(qū)域傳播的新的野生型病毒株的識(shí)別至關(guān)重要。

1.3.1 PCR

PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用及適用性廣使其成為世界各地實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，近年來(lái)研究人員建立了多種PCR法檢測(cè)SVA，其中RT-PCR是一種快速確定動(dòng)物是否急性感染病毒或水皰是否含有病毒的方法。Leme 等[4]設(shè)計(jì)了1套引物，用于RT-PCR擴(kuò)增SVA基因組VP3/VP1區(qū)542 bp大小的產(chǎn)物。用RT-PCR對(duì)臨床上患有水皰病豬的水皰液、拭子、破裂小泡等樣品以及臨床健康動(dòng)物進(jìn)行SVA檢測(cè)。RT-PCR結(jié)果分析顯示，上述所有采集的樣本均擴(kuò)增出542 bp大小的產(chǎn)物，即全部樣品SVA呈陽(yáng)性，而臨床健康的豬均未檢出該病毒。序列分析表明，該病毒與SVV-01原型株和其他北美分離的SVA株有很高的核苷酸(87.6%～98.5%)和氨基酸(95%～99.4%)的相似性。試驗(yàn)表明該引物適用于SVA的分子鑒定，提示SVA是豬群水皰病暴發(fā)的病原。但是RT-PCR的陰性結(jié)果卻不能用來(lái)排除以前接觸過(guò)病原的豬群，因?yàn)楦腥镜呐R床癥狀通常在1～2周內(nèi)就會(huì)消失。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

qRT-PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時(shí)快速檢測(cè)大批量樣品。Bracht 等[16]通過(guò)擴(kuò)增SVA VP1基因983 bp大小的片段，建立了一種靈敏的SYBR Green RT-qPCR檢測(cè)方法，這種方法能夠直接檢測(cè)到不同水皰標(biāo)本中的低水平SVA RNA，這些水皰標(biāo)本包括蹄部病變組織、口腔和鼻部上皮、口腔拭子、肝臟、淋巴結(jié)。Agnol 等[17]、郭振華等[18]都通過(guò)擴(kuò)增SVA VP1蛋白保守基因組區(qū)的片段，研究設(shè)計(jì)并建立了一種基于TaqMan的敏感而特異的qRT-PCR方法來(lái)檢測(cè)和定量感染豬組織中的SVA。同樣，張志等[19]以分離到的1株SVA流行病毒株GXT91作為參考毒株，設(shè)計(jì)合成了TaqMan探針和1對(duì)引物，并建立了SVA的熒光RT-PCR方法。樊曉旭等[20]針對(duì)病毒 3D基因區(qū)域分別設(shè)計(jì)引物和探針，建立的TaqMan熒光定量PCR最低檢測(cè)靈敏度為 2.8 copies/μL，高于普通 PCR，批內(nèi)、批間變異系數(shù)為1.73%～4.00%，具有良好的穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)RT-PCR相比，該方法提供了一個(gè)高通量平臺(tái)，通過(guò)將熒光標(biāo)記的目標(biāo)特異性探針與擴(kuò)增過(guò)程相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了更高的靈敏度和特異性。但是qRT-PCR需要特殊的設(shè)備、昂貴的用品和熟練的工作人員，因此，這種技術(shù)并不能被廣泛應(yīng)用。

1.3.3 套式PCR

套式PCR是指利用2套PCR引物(套式引物)進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。Feronato等[21]通過(guò)擴(kuò)增SVA基因組中316 bp的VP1片段，建立1套套式PCR 方法。在37頭仔豬中，RT-PCR和套式PCR 檢測(cè)SVA的陽(yáng)性率分別為15頭(40.5%)和23頭(62.2%)。結(jié)果表明，與常規(guī)RT-PCR相比，套式PCR 具有更高的靈敏度，反應(yīng)效率更高、操作簡(jiǎn)單，是一種經(jīng)濟(jì)有效的診斷方法，特別是在常規(guī)RT-PCR中目標(biāo)感染源的樣本為陰性的情況下，或者是當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒分離不可用以及當(dāng)必須對(duì)大量樣本進(jìn)行病毒檢查時(shí)。由于套式PCR 反應(yīng)有2次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，增加了檢測(cè)的敏感性；又有2對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性。該技術(shù)被建議用于流行病學(xué)研究中的病毒調(diào)查以及通過(guò)對(duì)豬群進(jìn)行SVA的常規(guī)調(diào)查來(lái)進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)。

1.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)

LAMP被認(rèn)為是檢測(cè)和鑒定病毒病原體的一種替代方法，特別是在那些實(shí)驗(yàn)室資源有限的地區(qū)。LAMP利用6個(gè)靶標(biāo)特異性引物來(lái)擴(kuò)增靶標(biāo)中的8個(gè)區(qū)域病毒基因組，整個(gè)過(guò)程在60～65°C的恒溫范圍內(nèi)一步完成，密閉管的性能還有助于防止污染，并滿足簡(jiǎn)單性要求。楊鈺楚等[22]根據(jù)SVA VP1基因序列，設(shè)計(jì)1套對(duì)應(yīng)目的片段6個(gè)區(qū)域的4條特異性引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，建立RT-LAMP檢測(cè)方法，該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)有效，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)和基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)SVA的快速診斷。Zeng等[23]根據(jù)GenBank中已有的序列比對(duì)，選擇針對(duì)VP2保守編碼區(qū)的引物，建立實(shí)時(shí)RT-LAMP檢測(cè)方法并與實(shí)時(shí)RT-PCR、常規(guī)RT-PCR的方法進(jìn)行對(duì)比。實(shí)時(shí)RT-PCR和實(shí)時(shí)RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果證實(shí)SVA的患病率較高，分別為64.4%和71.2%，而常規(guī)RT-PCR檢測(cè)SVA陽(yáng)性率僅為34.7%，說(shuō)明實(shí)時(shí)RT-LAMP和實(shí)時(shí)RT-PCR方法更優(yōu)越，為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SVA提供了一種不依賴昂貴設(shè)備和儀器的新方法。

1.3.5 數(shù)字PCR(RT-ddPCR)

數(shù)字PCR(也可稱單分子PCR)是繼實(shí)時(shí)定量PCR之后新興發(fā)展起來(lái)的一種絕對(duì)定量分析技術(shù)。通過(guò)將單個(gè)DNA分子轉(zhuǎn)移入獨(dú)立的反應(yīng)室，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)后，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析，實(shí)現(xiàn)單分子的絕對(duì)定量。Pinheiro-de-Oliveira等[24]基于RNA逆轉(zhuǎn)錄酶微滴數(shù)字PCR的診斷工具標(biāo)準(zhǔn)化，采用一步法和兩步法，與RT- PCR、RT-qPCR(一步法和兩步法)同時(shí)進(jìn)行對(duì)生物樣品中的SVA病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，一步法不管是檢測(cè)還是分析的特異性方面都優(yōu)于兩步法。此外，用單步分析方法對(duì)巴西SVA的生物學(xué)樣本進(jìn)行RT-ddPCR和RT-qPCR結(jié)果的一致性為94.2%。相較于RT-qPCR定量目標(biāo)分子時(shí)需要高效的標(biāo)準(zhǔn)曲線，RT-ddPCR不需要參考曲線，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。所以RT-ddPCR可以作為一種輔助診斷工具為隨后SVA RNA的絕對(duì)定量分析打下良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也可以通過(guò)這種方法對(duì)豬水皰病進(jìn)行有效的控制。

2 血清學(xué)檢測(cè)方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

血清中特異性抗體水平是鑒別病毒感染的有效指標(biāo)。血清抗體測(cè)定在流行病學(xué)研究中對(duì)動(dòng)物或人群免疫狀態(tài)的確定具有重要意義。有研究表明，抗SVA VP1 蛋白抗體的測(cè)定可以作為檢測(cè)SVA感染細(xì)胞的方法[13]。范慧等[25]以純化的重組VP1蛋白作為包被抗原，建立了SVA VP1間接ELISA抗體檢測(cè)方法，且該方法批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于13%，表明該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好。Gimenez-Lirola等[26]通過(guò)每周對(duì)母豬和仔豬血清樣本進(jìn)行SVA VP1重組蛋白(rVP1)間接ELISA，評(píng)估其對(duì)SVA的血清學(xué)應(yīng)答(IgG)。農(nóng)作榮等[27]通過(guò)對(duì)SVA的衣殼蛋白VP1進(jìn)行原核表達(dá)，并制備其多克隆抗體，結(jié)果表明，該多克隆抗體能跟SVA抗原特異性結(jié)合，為豬塞內(nèi)卡病毒ELISA檢測(cè)等其他方法的建立提供了良好的生物材料。Dvorak等[28]、申珊等[29]都曾以SVA的VP2蛋白建立一種間接ELISA方法，以此來(lái)鑒定血清中的SVA抗體，用來(lái)檢測(cè)感染后一段時(shí)間內(nèi)SVA抗體的存在和水平。但是SVA VP1 ELISA這種檢測(cè)方法沒(méi)有得到全面的驗(yàn)證，而基于SVA VP2的間接ELISA能快速、可靠地檢測(cè)豬體內(nèi)存在的SVA抗體。申水瑩等[30]通過(guò)克隆SVA的VP3基因，將其與pQE-30表達(dá)載體連接，并進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化和鑒定，用純化的重組VP3蛋白(rVP3)作為包被抗原，通過(guò)矩陣法優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立檢測(cè)SVA抗體的間接ELISA方法，經(jīng)檢測(cè)評(píng)估，該方法具有較好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。

競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)被廣泛用于血清抗體的檢測(cè)。該方法測(cè)定了在臨床樣本中存在的具有良好特征的單克隆抗體(mAb)之間的特異性抗原競(jìng)爭(zhēng)。Yang等[31]在2012年率先使用純化的病毒作為抗原制作出了單克隆抗體，使用點(diǎn)雜交試驗(yàn)，單克隆抗體的反應(yīng)性被證實(shí)是特異性的。采用滅活的病毒抗原和單抗進(jìn)行血清診斷，該試驗(yàn)建立了一種SVA特異性cELISA。與間接ELISA相比，cELISA很容易操作，并且可以進(jìn)行放大以適應(yīng)大量血清的篩選。

對(duì)于SVA的檢測(cè)，OIE參考的cELISA具有0.45%的假陽(yáng)性率，而在病毒中和試驗(yàn)(VNT)重新檢測(cè)假陽(yáng)性血清后可以進(jìn)一步降低到0.1%～0.2%，雖然VNT法可以降低陽(yáng)性率，但VNT法需要活病毒、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施，至少需要3～4 d才能取得結(jié)果，這大大增加了控制疾病的成本，延緩了檢測(cè)進(jìn)度。所以Yang等[32]利用重組SVA病毒樣顆粒(VLP)和SVA特異性mAb建立了一種ELISA方法，其與cELISA聯(lián)合使用，為一種輔助診斷工具，減少陽(yáng)性率。

2.2 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)SVA

除了ELISA，IFA檢測(cè)SVA IgG抗體已被廣泛報(bào)道。 Houston等[33]為了確定SVA在美國(guó)非臨床感染畜群中的血清效價(jià)，采用SVA rVP1 ELISA和SVA IFA檢測(cè)SVA血清效價(jià)。結(jié)果表明這2種方法在畜群水平上表現(xiàn)出一致性，且發(fā)現(xiàn)SVA在美國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)是亞臨床循環(huán)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng) ELISA 檢測(cè)結(jié)果不確定或制備抗原困難或復(fù)雜時(shí)，可選用此法，即SVA rVP1的ELISA法和IFA的聯(lián)合使用有助于豬場(chǎng)陽(yáng)性豬的檢出。

3 小結(jié)

2015年，由SVA引起的水皰病在我國(guó)廣東省首次報(bào)告[34]。此后，黑龍江[10]、吉林[35]、福建[36]、河南[37]、海南[38]等省份都有此病毒的發(fā)現(xiàn)，這是一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害的新發(fā)傳染病。雖然在中國(guó)SVA的暴發(fā)只是零星發(fā)生，但是其極有可能通過(guò)商業(yè)活動(dòng)等傳播到其他無(wú)SVA地區(qū)。如果不采取預(yù)防措施，就可能在不同區(qū)域之間快速傳播。而眾多研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種 SVA實(shí)驗(yàn)室診斷方法，以便在現(xiàn)場(chǎng)條件下進(jìn)行早期診斷。對(duì)于病原檢測(cè)，SVA病原的分離與鑒定、免疫組化和原位雜交、病毒基因組檢測(cè)方法(RT-PCR、qRT-PCR、套式PCR、RT-LAMP、RT-ddPCR)在診斷中發(fā)揮重要作用，尤其是PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、LAMP 等分子生物學(xué)技術(shù)更在豬感染SVA的早期即可檢測(cè)到病毒核酸，在SVA的早期檢測(cè)中具有重要作用；血清學(xué)方面，用免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體可以了解 SVA感染、發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，即有多種ELISA以及IFA的方法用于SVA檢測(cè)?？傊?，SVA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法多種多樣，各有優(yōu)缺點(diǎn)，但是隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將開(kāi)發(fā)出更多簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于SVA的防控。