cGAS-STING通路的調(diào)控機制及其相關藥物研究進展

張旭飛，吳秀文綜述，任建安審校

0 引 言

病原微生物感染宿主釋放的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和細胞損傷釋放的損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)一直是固有免疫研究中的熱點[1-2]。模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)是固有免疫中不可或缺的成分，可識別PAMPs和DAMPs，激活固有免疫，誘導炎癥因子或趨化因子的分泌，故PRRs在監(jiān)測病原微生物的入侵和組織細胞的損傷中起到關鍵作用[3]。早期的研究已對細胞表面的PRRs進行了詳細闡述。然而，近年來細胞內(nèi)PRRs在病原微生物識別系統(tǒng)中的作用越來越受到重視。

鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)、干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)均是細胞內(nèi)PRRs。cGAS可識別并結合細胞質(zhì)內(nèi)的雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)，激活狀態(tài)的cGAS可將三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)合成2′3′-環(huán)化鳥苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP，cGAMP)。2′3′-cGAMP可直接激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING蛋白，STING激活后由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體上轉移[4]。激活的STING在高爾基體上招募并激活TANK結合激酶1 (TANK binding kinase 1，TBK-1)。一方面，TBK-1可直接激活NF-κB信號通路，誘導炎癥因子的產(chǎn)生；另一方面，TBK-1招募并磷酸化下游干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)，磷酸化的IRF3可入核啟動干擾素相關基因的表達，促進Ⅰ型干擾素的合成，從而增強免疫反應[5]，見圖1。此外，cGAS-STING通路還參與調(diào)控細胞代謝、自噬、死亡，在腸道炎癥、非酒精性脂肪肝、胰腺、腎纖維化等損傷中發(fā)揮著作用[6]。故調(diào)控cGAS-STING通路對于組織細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持、相關疾病的治療具有重要意義。本文針對cGAS-STING通路中各環(huán)節(jié)的干預機制及相關藥物作一綜述。

圖 1 STING通路及其調(diào)控機制和藥物

1 cGAS的調(diào)控

cGAS是細胞質(zhì)內(nèi)dsDNA的感受器，cGAS與dsDNA結合后，cGAS催化位點的構象由無序變?yōu)橛行颉Ｗ钚碌难芯堪l(fā)現(xiàn)，cGAS激活后會形成二聚體，cGAS二聚體與外側兩條dsDNA形成梯形結構，并促進后續(xù)cGAS二聚體與兩條dsDNA結合，dsDNA的鏈越長，結合的cGAS二聚體則越多，故cGAS的激活數(shù)量是取決于dsDNA的長度[7]。我們發(fā)現(xiàn)，給予盲腸結扎穿孔的小鼠腹腔注射脫氧核糖核酸酶Ⅰ，會明顯減少造模小鼠血循環(huán)線粒體DNA和炎癥因子含量，改善膿毒癥介導的腸道損傷[8]。此外，線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)或高遷移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)參與裝配cGAS-dsDNA形成的梯形結構，促進cGAS的激活[7]。所以促進細胞質(zhì)內(nèi)dsDNA的降解，減少細胞質(zhì)內(nèi)TFAM、HMGB1的釋放可從根本上抑制cGAS-STING通路的始動環(huán)節(jié)。

1.1cGAS的抑制劑Hall等[9]發(fā)現(xiàn)一種具有生物活性的小分子PF-06928215可抑制cGAS活性，并且這種試劑本身對細胞活性影響很小。深入研究發(fā)現(xiàn)，PF-06928215可結合于cGAS的活性位點，這種結合可能會影響ATP與cGAS的結合以及下游cGAMP的合成。既往已發(fā)現(xiàn)羥化氯喹、奎納克林等抗瘧疾藥物具有抑制cGAMP合成的作用，但深入研究發(fā)現(xiàn)這些藥物作用機制并不是與cGAS活性位點結合，而是與細胞質(zhì)內(nèi)DNA結合，從而阻止了DNA與cGAS的結合[10]。據(jù)此，An等[11]設計、合成了一種類抗瘧疾藥物，命名為“X6”，能夠阻止DNA與cGAS的結合，并且X6對cGAS-STING通路的抑制作用要強于羥化氯喹。suramin是WHO推薦治療河盲癥和非洲昏睡病藥物清單上的基本藥物。最近，Sintim團隊通過篩選分析發(fā)現(xiàn)suramin是潛在的cGAS抑制劑，其作用機制較為獨特，能夠?qū)sDNA從cGAS解離下來，減少cGAMP的生成，緩解cGAS-STING通路的激活，降低Ⅰ型干擾素的合成[12]。

1.2cGAS的轉錄后修飾cGAS轉錄后修飾可調(diào)控cGAS的活性。2015年，Seo等[13]發(fā)現(xiàn)Akt激酶可通過磷酸化cGAS的Ser291或Ser305位點抑制cGAS的酶活性，給予Akt1/2特異性抑制劑Ⅷ或突變該磷酸化位點可促進dsDNA誘導的干擾素合成釋放。此外，cGAS的泛素化修飾亦可調(diào)控cGAS的活性。RNF185是一種E3泛素化連接酶，在單純皰疹病毒-1感染細胞期間，RNF185可于cGAS的K173和K384位點上介導K27泛素鏈形成，促進cGAS的酶活性；而沉默RNF185可抑制cGAS的酶活性，限制干擾素應答效應[14]。TRIM56也是一種E3泛素化連接酶，早期研究認為TRIM56是通過泛素化STING蛋白促進STING通路激活，然而后期發(fā)現(xiàn)TRIM56的敲除并不影響cGAMP直接激活STING。有研究深入探索，發(fā)現(xiàn)TRIM56是通過介導cGAS的K335位點泛素化，促進cGAS二聚化以及cGAMP的產(chǎn)生，加強cGAS-STING通路[15]。盡管如此，cGAS的活性是否受泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的其他成分動態(tài)調(diào)控仍是一個有待解決的問題。

2 STING的激動劑和抑制劑

STING是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白。在人STING蛋白結構中，其N末端有5個跨膜結構域，C末端是TBK1/IRF3連接結構域，此外還有一段CDNs連接結構域[16]。雖然STING激活后通過NF-κB、IRF3通路誘導炎癥反應，損傷組織器官，但這種免疫應答亦可介導免疫防御，抵抗病原微生物感染，或監(jiān)測腫瘤來源的dsDNA，產(chǎn)生固有的抗腫瘤免疫。除了經(jīng)典通路，STING也有許多非經(jīng)典通路。最新的研究發(fā)現(xiàn)，STING被激活后，其TM5、TM2結構域負責招募并激活NLRP3炎性小體，促進抗病毒反應[17]。

2.1STING的核苷酸類激動劑環(huán)化二核苷酸(cyclic dinucleotides，CDNs)是STING的直接激動劑。在經(jīng)典通路中，cGAS產(chǎn)生的是2′3′-cGAMP，2′3′-cGAMP也是CDNs的一種。而在細菌感染宿主細胞過程中，會釋放其他種類的CDNs，如2′2′-cGAMP、3′3′-cGAMP、c-diAMP以及c-diGMP[5]。這些環(huán)化二核苷酸可直接激活STING，誘導STING相關免疫應答。盡管CDNs種類眾多，但既往研究發(fā)現(xiàn)cGAMP激活STING誘導Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的能力高于c-diAMP和c-diGMP[18-19]；但在cGAMP中，2′3′-cGAMP結合STING的能力更強，誘導干擾素產(chǎn)生的能力也更強[18-19]。為對抗STING的激活，細胞內(nèi)存在水解2′3′-cGAMP的固有機制。核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1)是一種跨膜糖蛋白，位于細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，在人體中廣泛表達，包括胃腸道、肺、肝、脂肪組織等。研究發(fā)現(xiàn)ENPP1可將細胞外和細胞內(nèi)2′3′-cGAMP水解成AMP和GMP，從而抑制2′3′-cGAMP激活STING[20]。此外，ENPP1的催化結構域中含兩個鋅離子結合位點，并且鋅離子與ENPP1的水解活性密切相關[21]。

盡管CDNs是STING的直接激動劑，但單純的CDNs實際利用起來有諸多缺點，如：穩(wěn)定性差、細胞膜穿透性較差等。鑒于此，許多研究致力于CDNs的修飾，從而改善CDNs的性能。CDNs修飾的方法有很多，如為對抗磷酸酶可進行硫代磷酸化修飾、為增加膜穿透性可進行脂肪酸/氟修飾、為改善與STING的結合能力可進行核苷酸替換等，修飾的位點常在于磷酸二酯鍵的部位以及2′3′-OH部位[22-24]。盡管修飾可改善CDNs部分性能，但也可能會影響CDNs對STING的激活能力。

2.2STING的非核苷酸類激動劑為克服CDNs的缺點，也為適合工業(yè)化生產(chǎn)和低成本保存的需求，許多團隊試圖尋找取代CDNs的分子。當前，主要有6種STING的非核苷酸類激動劑：5,6-二甲基黃體酮-4-乙酸(5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA)、黃酮乙酸(flavone acetic acid，F(xiàn)AA)、10-羧甲基-9-吖啶酮(10-carboxymethyl-9-acridanone，CMA)、α-倒捻子素(α-Mangostin)、BNBC以及[25-30]。在以上6種分子中，并不是全部都對人類STING蛋白有效，只有α-倒捻子素、BNBC、diABZ能夠激活人類STING蛋白；此外，只有BNBC對鼠STING無效，其余5種都對鼠STING有效。

DMXAA和FAA是黃酮類化合物，它們被發(fā)現(xiàn)可通過破壞腫瘤血管系統(tǒng)和誘導細胞因子分泌來抑制小鼠模型下的黑素瘤、膠質(zhì)瘤以及非小細胞肺癌[26,31-32]。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)α-倒捻子素對人類STING的激活能力要強于鼠STING。此外，α-倒捻子素干預后，能促進巨噬細胞向M1型轉變，而M1型巨噬細胞可參與抗腫瘤免疫[29]。Ramanjulu等[25]通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)diABZI能夠與cGAMP競爭結合于STING上，并且diABZI與STING的結合親合力是2′3′-cGAMP的18倍，同時diABZI激活STING誘導干擾素產(chǎn)生的效果亦強于2′3′-cGAMP。改良后的diABZI在靜脈注射后對CT26結直腸腫瘤有顯著的抑制作用作用[25]。盡管上述6種STING激動劑相比于CDNs，具有較強的穩(wěn)定性、適合商業(yè)化生產(chǎn)，但細胞膜穿透性仍較差。

2.3STING的抑制劑近年來，關于STING抑制劑的研究主要圍繞STING的棕櫚?；Ｔ?016年，Mukai等[33]發(fā)現(xiàn)STING激活后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉移到高爾基體上，并在高爾基體上發(fā)生棕櫚?；渥貦磅；稽c是位于STING半胱氨酸88/91上。STING發(fā)生棕櫚酰后，能夠促進STING的二聚化形成，招募下游TBK1。故STING的棕櫚酰化修飾對于STING下游的激活至關重要。2018年，Haag等[34]通過篩選發(fā)現(xiàn)兩種硝基呋喃衍生物(C-176、 C-178)能夠明顯抑制干擾素的應答，其機制是抑制STING半胱氨酸91位點的棕櫚酰化；但C-176、 C-178只能抑制鼠STING，對人STING無效。研究者又根據(jù)C-176、C-178結構，得到另兩種衍生物——C-170、C-171。C-170和C-171亦可抑制STING半胱氨酸91位點的棕櫚?；?，并且C-170和C-171可同時抑制人STING和鼠STING。此外，研究者也篩選出另一種衍生物H-151，通過同樣機制負調(diào)控人STING和鼠STING。同年，Hansen等[35]發(fā)現(xiàn)3種硝基脂肪酸——硝基共軛亞油酸、9-硝基油酸和10-NO2-OA，這3種硝基脂肪酸可抑制STING半胱氨酸88/91位點的棕櫚?；?，同時抑制人STING和鼠STING。

STING也存在一些競爭性抑制劑。2018年，Li等[36]從環(huán)肽數(shù)據(jù)庫里篩選出了能抑制cGAS-STING通路的Astin C，其為從藥用植物紫菀中提取的環(huán)肽。研究發(fā)現(xiàn)Astin C可結合于STING的C末端結構域，從而抑制IRF3的招募[36]。并且給予Astin C可顯著緩解小鼠Trex1敲除所誘導的自發(fā)性炎癥反應[36]。2019年，Siu等[37]通過自動配體識別系統(tǒng)，篩選出Compound 18。Compound 18可連接STING結構域上cGAMP結合的位點，抑制STING的激活；并且Compound 18具有較好的口服生物利用度。

2.4STING的轉錄后修飾2013年，Konno等[38]發(fā)現(xiàn)cGAS產(chǎn)生的2′3′-cGAMP除可直接激活STING外，也可通過負反饋軸介導STING的磷酸化，抑制干擾素應答。具體機制而言，cGAMP可使腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)去磷酸化，去磷酸化的AMPK喪失了對UNC-51樣激酶(UNC-51-like kinase，ULK1)的抑制作用?；罨腢LK1可磷酸化STING的S366位點，從而抑制STING介導的干擾素應答效應。值得注意的是，活性抑制的STING將通過自噬途徑被細胞降解。

STING的泛素化修飾也參與調(diào)控下游的活性。線粒體E3泛素蛋白連接酶(mitochondrial E3 ubiquitin protein ligase 1，MUL1)可催化STING的K224位點發(fā)生泛素化，STING的泛素化參與調(diào)控IRF3的招募與激活[39]。而阻斷K224位點的泛素化可明顯抑制IRF3介導的干擾素表達，但不影響NF-κB通路的激活[39]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)使用泛素蛋白特異性蛋白酶13(ubiquitin-specific protease 13，USP13)可使STING去泛素化[40]。去泛素化的STING 招募TBK1的能力大大減弱，從而抑制了炎癥反應[40]

3 TBK1的調(diào)控

TBK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并且是STING的關鍵下游，STING通過招募TBK1可介導NF-κB、IRF3激活。在經(jīng)典通路中，cGAS-STING-TBK1介導的下游激活更偏重于IRF3通路[41]。但在依托泊苷誘導的核損傷中，共濟失調(diào)-毛細血管擴張突變蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM) 和干擾素γ誘導因子16(interferon-g-inducible factor 16，IFI16)共同介導STING-TBK-1的激活，此時的TBK1主要激活的是NF-κB通路[42]。目前，TBK1對兩種下游的選擇機制尚不清楚。故在不同方式激活STING的過程中，抑制TBK1可能會有不同的效應。

據(jù)報道，BX795是TBK1/IKKε通路強力的抑制劑[43]。也有研究發(fā)現(xiàn)，使用BX795治療原代外周血單核細胞(來源于STING基因突變、干擾素效應陽性的兒童患者)，治療后可明顯抑制IRF3的磷酸化以及干擾素的產(chǎn)生[44]。Mclever等[45]設計合成了4-二氨基-5-環(huán)丙基嘧啶，這種分子能夠彌補BX795的部分性能以及激酶選擇性。2019年，Thomson等[46]發(fā)現(xiàn)了GSK8612是一種強效、高選擇性TBK1抑制劑，并且具有較好的細胞膜穿透性。研究者使用dsDNA或cGAMP刺激THP1細胞，給予GSK8612治療后可明顯抑制干擾素的產(chǎn)生。值得注意的是，如果長期使用TBK1抑制劑，可能會導致抗病毒免疫缺陷，增加感染病毒的風險。

4 結 語

cGAS-STING通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，阻斷cGAS-STING通路可抑制炎癥反應、減輕組織損傷，而激活cGAS-STING通路可促進抗病毒、抗腫瘤效應。了解cGAS-STING通路各環(huán)節(jié)的調(diào)控機制，可利用現(xiàn)有的藥物或研發(fā)新藥物干預cGAS-STING通路，為臨床相關疾病治療提供新的思路和方法。隨著研究的深入，cGAS下游不依賴STING、STING上游不依賴cGAS以及STING下游不依賴IRF3等非經(jīng)典cGAS-STING通路逐步被發(fā)現(xiàn)，使得關于該通路的調(diào)控位點的研究更引人入勝。