超聲彈性成像聯(lián)合血清miR-21檢測對甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷價值

秦青秀,葉麗虹

聯(lián)勤保障部隊第909醫(yī)院超聲科，福建漳州363000

甲狀腺結(jié)節(jié)是目前最常見的甲狀腺疾病，其多見于女性，且患病率隨著年齡的增長而逐步升高[1]。由于甲狀腺結(jié)節(jié)具有良性和惡性之分。因此針對甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性進(jìn)行早期診斷，對于臨床治療策略的制定和實施非常關(guān)鍵。目前超聲檢查已廣泛用于甲狀腺結(jié)節(jié)疾病的檢測和評估，然而普通二維超聲在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的診斷上具有較大的局限性[2]。超聲彈性成像是Ophir博士于1991年首先提出的。該技術(shù)基于不同組織的彈性系數(shù)不同，通過超聲探測實體腫塊的硬度，并同正常組織進(jìn)行對比來鑒別其良惡性來達(dá)到診斷目的[3]。microRNA(miRNA)為一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的非編碼單鏈小RNA分子。目前已有大量研究證實在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)差異性表達(dá)的miRNA，且通過對這些腫瘤特異性miRNA的檢測將極大地有助于對腫瘤性質(zhì)的診斷[4-5]。miR-21是最近發(fā)現(xiàn)的一個與腫瘤相關(guān)的miRNA分子，有研究證實[6]miR-21的高表達(dá)與甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。該次研究通過超聲彈性成像技術(shù)聯(lián)合血清miR-21對2016年1月—2018年12月該院收治的180例甲狀腺結(jié)節(jié)患者進(jìn)行檢測，探討其在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷中的臨床價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇該院收治的180例甲狀腺結(jié)節(jié)患者作為研究對象。患者年齡27～53歲，平均年齡(32.7±6.5)歲；其中男性68例，女性112例。180例患者甲狀腺結(jié)節(jié)直徑0.4～5.2 cm，平均(0.86±0.42)cm。另選擇30名健康體檢者作為健康對照組。①所有受試對象術(shù)前均未進(jìn)行針對甲狀腺結(jié)節(jié)的治療；②均排除合并腦、肺、肝、腎嚴(yán)重疾?。虎劬懦喜⑵渌麗盒阅[瘤；④均排除嚴(yán)重急慢性感染性疾病。該研究術(shù)前均征得患者及家屬的知情同意并簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 超聲彈性成像

①儀器：采用TOSHIBA公司的Acuson S2000彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行檢測。超聲診斷儀器規(guī)格為線陣9L4探頭，探頭頻率4～9 MHz，具備常規(guī)超聲和彈性成像功能。②檢查操作：患者平躺仰臥于檢測床上，充分暴露檢測頸部區(qū)域。先進(jìn)行常規(guī)二維超聲檢查，對甲狀腺橫切面和縱切面進(jìn)行連續(xù)超聲掃描，觀察和記錄結(jié)節(jié)的部位、大小、形態(tài)、邊界、內(nèi)部回聲、有無鈣化、結(jié)節(jié)周邊及內(nèi)部彩色血流分布情況。根據(jù)常規(guī)二維超聲確認(rèn)目標(biāo)病灶后進(jìn)行實時組織彈性成像檢測。設(shè)置超聲彈性成像取樣框，面積大小為病灶區(qū)域的2～3倍。取樣框范圍應(yīng)包括病灶結(jié)節(jié)、結(jié)節(jié)周圍甲狀腺組織及其前方的胸鎖乳頭肌。將超聲探頭垂直置于體表病灶區(qū)，然后進(jìn)行輕按壓—解除按壓操作，待圖像穩(wěn)定后采集彈性圖像并存貯。③病灶彈性成像硬度評分：采用5分法評分標(biāo)準(zhǔn)：整體病灶區(qū)或著大部分病灶區(qū)顯示呈均勻綠色(1分)；病灶中心區(qū)顯示呈藍(lán)色，周邊區(qū)域顯示呈綠色(2分)；病灶區(qū)顯示呈現(xiàn)雜亂的藍(lán)綠相間分布，綠色和藍(lán)色所占比例相近(3分)；整體病灶區(qū)呈藍(lán)色或病灶區(qū)內(nèi)伴有少許綠色(4分)；整個病灶及周邊組織區(qū)域均顯示呈藍(lán)色(5分)。評分1～3分者為良性，；4～5分者則診斷為惡性。所有患者均由一名具有10年以上超聲臨床診斷經(jīng)驗的醫(yī)師進(jìn)行超聲彈性成像和彈性評分。

1.3 血清miR-21檢測

①血清樣本采集。所有受試者均凌晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周靜脈血5 mL，室溫下靜置1 h，置于4℃，3 000 rpm/min條件下離心15 min，抽取上層血清置于新的EP管，集中統(tǒng)一編號后置于-80℃冰箱待下一步實驗。②血清總RNA提取。采用Trizol試劑(購自Invitrogen公司)對提取血清總RNA。經(jīng)過RNA分相、沉淀、洗滌、溶解后。RNA電泳檢測提取RNA分子的完整性，NanodropRND-1000測定提取RNA的濃度。③逆轉(zhuǎn)錄(RT)。采用miScript Reverse Transcription Kit(天根生化科技有限公司)構(gòu)建10μL反應(yīng)體系：RNA 3μL，1×mirVana RT Primer 1μL，Array script Enzyme Mix 0.4μL，mirVana RT Buffer(5×)2μL，加RNase-free water至總體積10μL。反應(yīng)條件：16℃，30 min；42℃，30 min；84℃，5 min。④實時熒光定量PCR反應(yīng)：按照miRNA SYBR Green PCR Kit(天根生化科技有限公司)操作步驟構(gòu)建20μL反應(yīng)體系：1×cDNA模板1～2.5μL，5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4μL，PCRForward Primer(20×)1 μL，PCR Reverse Primer(20×)1μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，加入Nuclease-free H2O至總體積20μL。反應(yīng)條件：95℃變性15 s；60℃退火1 min，共45個PCR循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析miR-21表達(dá)的相對定量值。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

納入研究的180例甲狀腺結(jié)節(jié)患者術(shù)后病理檢測證實良性結(jié)節(jié)96例，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫69例、甲狀腺腺瘤20例、橋本甲狀腺炎7例；甲狀腺癌84例，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)72例，濾泡狀甲狀腺癌(FTC)8例，甲狀腺髓樣癌(MTC)4例。

2.2 超聲彈性評分

良性結(jié)節(jié)組超聲彈性評分明顯低于甲狀腺癌組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.847,P＜0.05)。超聲彈性評分1～3分的結(jié)節(jié)患者有94例，其中12例為惡性，82例為良性；4～5分者有86例，其中72例為惡性，14例為良性。見表1。

表1 超聲彈性評分與病理診斷結(jié)果比較[(±s)，分]

表1 超聲彈性評分與病理診斷結(jié)果比較[(±s)，分]

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2.3 血清miR-21檢測結(jié)果比較

良性甲狀腺結(jié)節(jié)組患者血清miR-21相對表達(dá)水平為(0.73±0.21)，甲狀腺癌組患者血清miR-21相對表達(dá)水平為(1.78±0.43)，甲狀腺癌組患者血清miR-21表達(dá)水平明顯高于良性甲狀腺結(jié)節(jié)組患者(t=5.273,P＜0.05)。健康對照組人群血清miR-21相對表達(dá)水平為(0.49±0.13)，明顯低于良性甲狀腺結(jié)節(jié)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.549,P＜0.05)，和甲狀腺癌組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.476,P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組血清miR-21表達(dá)

2.4 超聲彈性成像和血清miR-21水平對甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的診斷效能

ROC曲線分析結(jié)果，超聲彈性成像診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的受試者工作特性曲線(ROC)下AUC為0.729，血清miR-21水平的ROC曲線下AUC為0.771，而聯(lián)合超聲彈性成像和血清miR-21診斷的ROC曲線下AUC為0.868，明顯高于超聲彈性成像(Z=3.477,P＜0.05)和血清miR-21(Z=3.762,P＜0.05)單個指標(biāo)對甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的診斷價值，見圖2。

3 討論

普通二維超聲是目前臨床上首選的甲狀腺病灶的檢測技術(shù)。由于甲狀腺結(jié)節(jié)性疾病存在的多源性，其病理類型比較復(fù)雜；因而良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)在二維超聲檢測聲像圖上的表現(xiàn)也呈多樣性，且常有重疊交叉，因此普通二維超聲在對甲狀腺病灶良惡性的診斷效能上尚存在較大的局限性。有研究顯示[7]，普通二維超聲對甲狀腺癌的診斷準(zhǔn)確性僅在50%左右。

超聲彈性成像技術(shù)檢測腫瘤的基本原理是利用腫瘤組織與周圍正常組織之間存在的彈性系數(shù)的差異，通過超聲探頭對檢查腫塊組織施加壓力后，根據(jù)相應(yīng)產(chǎn)生應(yīng)變大小的不同，從而間接或直接反映被檢查腫塊組織內(nèi)部的彈性大小，從而推斷腫塊組織的良惡性性[8]。目前臨床上超聲彈性成像檢測技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于乳腺、甲狀腺和淋巴結(jié)等表淺部位組織病變的診斷[9-10]。Lv等[11]采用內(nèi)鏡超聲實時組織彈性成像檢測42例消化系統(tǒng)實體瘤，結(jié)果顯示其診斷消化系統(tǒng)惡性腫瘤的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為91.4%、88.9%和87.5%，AUC值為0.80。提示內(nèi)鏡超聲實時組織彈性成像能有效地鑒別消化道腫瘤的良惡性，提高診斷準(zhǔn)確率，是鑒別診斷消化道腫瘤的有效方法。Kyriakidou等[12]采用超聲組織彈性成像技術(shù)分析62例甲狀腺結(jié)節(jié)患者(84個結(jié)節(jié)中良性73個，惡性11個)。其對甲狀腺癌診斷的敏感性為73%，特異性為70%，陰性預(yù)測值為94%，診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的AUC值為0.71；較普通二維超聲更有助于對甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性進(jìn)行診斷篩查。該研究采用超聲組織彈性成像技術(shù)對180例甲狀腺結(jié)節(jié)患者進(jìn)行檢測分析，并以病理檢測結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果顯示，甲狀腺良性結(jié)節(jié)組超聲彈性評分明顯低于甲狀腺癌組，即甲狀腺癌組織的硬度要顯著高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)。AUC值是反映ROC曲線診斷試驗的敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，AUC值越高，其診斷價值也越高。通過構(gòu)建ROC曲線，超聲組織彈性成像診斷甲狀腺腫塊良惡性的AUC值為0.795，提示超聲彈性成像對甲狀腺癌的診斷具有較高的準(zhǔn)確性。然而，通過超聲彈性成像技術(shù)在診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性上尚存在一定的誤診率。研究中超聲彈性評分1～3分的結(jié)節(jié)中有12例為惡性，4～5分者則有14例為良性，因此存在一定假陽性和假陰性情況。分析其誤診的原因可能在于[13-14]：①甲狀腺良性腫瘤發(fā)生纖維化和鈣化引起甲狀腺組織硬度增大；②甲狀腺惡性腫瘤病灶很??；或者發(fā)生液化壞死導(dǎo)致其組織硬度減小；③操作過程中操作者施力度的大小、振動頻率等主觀因素的影響。以上因素都能對成像效果造成干擾，進(jìn)而影響檢測結(jié)果。

圖2 超聲彈性成像和血清miR-21診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的ROC曲線

MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼的短鏈小RNA分子。研究證實[15-16]，miRNA在人血液循環(huán)中穩(wěn)定表達(dá)，且具有生物遺傳和種屬表達(dá)保守性的特點。因此，miRNA具有成為新的疾病監(jiān)測標(biāo)志物的潛能。miR-21是目前已知的具有癌基因特性的miRNA。趙等[17]研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者腫瘤組織和血清中miR-21的表達(dá)明顯升高，且其表達(dá)水平與甲狀腺癌的臨床病理特征有關(guān)，因而miR-21檢測對甲狀腺癌的診斷和判斷預(yù)后上存在較高的臨床價值。該研究中，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示miR-21在甲狀腺癌組患者血清中的相對表達(dá)水平要明顯高于良性甲狀腺結(jié)節(jié)組患者和健康對照組。ROC曲線結(jié)果顯示血清miR-21水平的ROC曲線下AUC為0.814。提示血清miR-21對于臨床輔助診斷甲狀腺癌具有積極的參考價值。然而，由于miR-21并非在甲狀腺癌組織中特異性表達(dá)，惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌等惡性腫瘤也會導(dǎo)致患者血清中miR-21的表達(dá)增高[18]。因此在特異性尚不夠高，尚需要聯(lián)合檢測來彌補(bǔ)。進(jìn)一步，該研究將超聲彈性成像和血清miR-21聯(lián)合起來對甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性進(jìn)行評估診斷。結(jié)果顯示兩者聯(lián)合診斷甲狀腺癌的ROC曲線下AUC為0.868，明顯高于單個指標(biāo)對甲狀腺癌的診斷價值。提示超聲彈性成像技術(shù)聯(lián)合血清miR-21檢測有助于對甲狀腺癌的早期鑒別和診斷。

綜上所述，彈性成像和血清miR-21聯(lián)合檢測能夠從不同角度對甲狀腺癌患者提供較為準(zhǔn)確診斷，二者能夠互補(bǔ)，減少誤診。但尚需開展大樣本量的多中心的進(jìn)一步研究和臨床論證。進(jìn)而為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別提供了更加簡便、準(zhǔn)確的診斷方法。