火龍果組培技術(shù)研究進展

葉維雁 歐景莉 覃少麟 潘如軍 蘇展 徐有海 鄭文武 覃劍峰

摘要 火龍果集觀賞、食用和保健功能于一身，是一種新興的熱帶亞熱帶果樹，果實風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富。該研究從外植體的選擇和消毒、培養(yǎng)基的選擇、不定芽的誘導(dǎo)和增殖、愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖、愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根培養(yǎng)等方面對火龍果組織培養(yǎng)技術(shù)的研究現(xiàn)狀進行了綜述，并提出了今后的展望，旨在為火龍果組培技術(shù)的進一步發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 火龍果;組織培養(yǎng);技術(shù)

中圖分類號 Q813.1+2文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2021）05-0035-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.009

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Research Progress on Tissue Culture Technology of Pitaya

YE Wei-yan1， OU Jing-li1， QIN Shao-lin2 et al

（1. Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001; 2 Guangxi Mountainous Area Comprehensive Technology Development Center， Nanning， Guangxi 530012）

Abstract Pitaya is a new tropical and subtropical fruit tree with ornamental， edible and healthcare functions， the fruit has unique flavor and rich nutrition. In this research， the research status of pitaya tissue culture technology was reviewed including explant choice and sterilization， medium selection， adventitious bud induction and proliferation， callus induction and proliferation， callus differentiation and rooting culture. Finally the future prospect was presented， so as to provide scientific basis for the further development of pitaya tissue culture technology.

Key words Pitaya;Tissue culture;Technology

火龍果（Hylocereus undulates Britt.）又稱紅龍果、青龍果和仙蜜果等，是仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）多年生植物[1-2]，集觀賞、食用和保健功能于一身，原產(chǎn)于南美、北美及中美州熱帶地區(qū)，目前在我國的廣西、海南、廣東、云南、福建等地都有大規(guī)模種植，是一種新興的熱帶亞熱帶果樹[3-6]。果實風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，含有豐富的茶多酚、維生素、天然色素和水溶性膳食纖維，以及植物性白蛋白、植物甾醇類化合物、功能性氨基酸和多糖等物質(zhì)，經(jīng)常食用能降血壓、降血脂、潤肺、解毒、養(yǎng)顏、明目，對便秘和糖尿病也有輔助治療的作用，對人體健康非常有益[7-14]。火龍果的繁殖方式有種子繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖和組織培養(yǎng)繁殖等，其中組織培養(yǎng)不僅可在短期內(nèi)獲得大量苗木，還可快速大量地保存優(yōu)良種質(zhì)，對火龍果的快速、周年性生產(chǎn)以及大范圍推廣種植具有積極的推動作用。目前，對火龍果組織培養(yǎng)的研究較多，取得了一定成果。鑒于此，筆者從外植體的選擇、組培再生途徑、生根培養(yǎng)等方面對火龍果組織培養(yǎng)技術(shù)進行綜述，以期為相關(guān)科研工作者和生產(chǎn)者提供參考，促進火龍果組培技術(shù)的進一步發(fā)展。

1 外植體

1.1 外植體的選擇

外植體的選擇是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，外植體選擇的合適與否直接影響消毒、無菌體系建立以及整個組培流程的難易程度[15]?；瘕埞M織培養(yǎng)以莖段、花藥和無菌種胚所發(fā)幼芽等為外植體，經(jīng)合適的滅菌過程，建立無菌體系。目前火龍果組織培養(yǎng)大多采用莖段作為外植體，王云山等[16]以3 cm長的火龍果幼嫩莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率達100%。黃春華等[17]分別采集新抽嫩莖段、近成熟莖段和老熟莖段作為外植體進行組織培養(yǎng)試驗，結(jié)果表明近成熟莖段是“蜜寶”火龍果組培最佳外植體。洪青梅等[18]以火龍果近成熟莖為外植體誘導(dǎo)不定芽，誘導(dǎo)率達80%。彭綠春等[19]認為，保留刺座上小刺和絨毛的火龍果莖段更利于誘導(dǎo)不定芽萌發(fā)，提高其組培快繁效率。黃青峰[20]以火龍果帶剌座棱片切塊為外植體，直接誘導(dǎo)其剌座不定芽生長，繼而分化、增殖、生根成苗和移栽。范建新等[21]用火龍果花藥誘導(dǎo)出愈傷組織，增殖獲得大量胚性愈傷組織，再分化形成了不定芽。利用火龍果無菌種胚所發(fā)幼芽作為外植體，可避免成熟莖段作為外植體易帶菌、易污染等缺點，具有再生能力強、長勢均一等優(yōu)點[22-24]。黃紅梅等[25]確定了火龍果子葉的愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，子葉愈傷組織可以較容易誘導(dǎo)分化產(chǎn)生不定芽，印證了Infante[26]的觀點，即火龍果子葉是誘導(dǎo)愈傷組織的主要外植體來源。彭思維[27]認為，火龍果種子誘導(dǎo)萌發(fā)率高，對滅菌條件和基本培養(yǎng)基要求不高，能夠一次性誘導(dǎo)出大量無菌外植體，對于大量試驗十分有利。

1.2 消毒處理

采取外植體后，要對外植體進行消毒，這是植物組織培養(yǎng)中一個非常重要的環(huán)節(jié)。消毒劑的種類、濃度和作用時間等對消毒的成功十分重要。選擇的消毒劑既要將外植體表面的微生物徹底殺死，又要易于清洗或能夠自行分解，還要盡可能保護外植體組織和表層細胞。目前常見的消毒劑有乙醇（濃度70%～75%）、氯化汞（濃度0.1%～02%）、次氯酸鈉（濃度2%）、次氯酸鈣（濃度5%～10%）和雙氧水（濃度3%～10%）等[28-29]。李清香等[30]使用75%乙醇消毒20 s、0.1%升汞消毒10～15 min的組合對“金都一號”火龍果新萌芽的莖段進行表面消毒，污染率為55.70%，并發(fā)現(xiàn)芽眼的刺座處一般污染比較嚴重。彭思維[27]認為火龍果莖段消毒0.1%升汞的最佳處理時間為8 min，而種子消毒則以0.1%升汞浸泡4 min以上和3%次氯酸鈉浸泡12 min以上即可達到有效的消毒作用，且種子的成活率和萌發(fā)率不受影響。王云山等[16]以火龍果母莖上的新生莖段為外植體，用0.1%升汞消毒15 min的污染率最低，但會導(dǎo)致材料大部分刺座及莖棱組織有褐化并逐漸壞死的現(xiàn)象，說明15 min的消毒時間過長，莖段組織細胞被殺死。邢玉良[31]取火龍果一年生幼嫩無病蟲害枝條，切成長2～4 cm的莖段，用自來水沖洗2 h，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡莖段并搖晃30 s，無菌水沖洗4～6次，再以0.1%升汞浸泡8 min，最后用無菌水沖洗4～6次，結(jié)果污染率低至9.2%。

2 基本培養(yǎng)基

培養(yǎng)基作為植物組織培養(yǎng)的重要材料和營養(yǎng)來源，其組成成分直接影響外植體的脫分化與再分化狀態(tài)，是起決定性作用的因素，只有配制出適宜的培養(yǎng)基，才能使組織培養(yǎng)成功。目前火龍果組織培養(yǎng)使用的基本培養(yǎng)基以MS和1/2 MS培養(yǎng)基最普遍。MS培養(yǎng)基主要特點是無機鹽濃度高，特別是硝酸鹽、K+和NH+ 4的含量高，各元素之間平衡較好，微量元素和有機物的種類較多，適用于多數(shù)營養(yǎng)需求量較大的植物，廣泛用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。

3 組織培養(yǎng)再生途徑

目前火龍果組織培養(yǎng)體系的建立主要有2種方式，即直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑。直接器官發(fā)生途徑指不經(jīng)過愈傷組織階段，直接從外植體上誘導(dǎo)產(chǎn)生腋芽或不定芽，再進行增殖培養(yǎng)，產(chǎn)生叢生芽，最后進行生根培養(yǎng);間接器官發(fā)生途徑指由外植體脫分化形成愈傷組織，再誘導(dǎo)愈傷組織分化形成不定芽，最后誘導(dǎo)不定芽生根。

3.1 直接器官發(fā)生

直接器官發(fā)生途徑周期短，所獲得的再生植株不易發(fā)生變異，是火龍果離體快繁的有效途徑。植物生長調(diào)節(jié)劑在培養(yǎng)基中的用量雖然微小，但其作用很大[32]，在火龍果組織培養(yǎng)不定芽的誘導(dǎo)中，細胞分裂素6-BA起著重要的調(diào)控作用，6-BA單獨使用或與其他植物生長調(diào)節(jié)劑組合可起到良好的效果。張領(lǐng)等[33]采用MS+6-BA 40 mg/L+NAA 0.5 mg/L的組合，火龍果不定芽誘導(dǎo)率達58.33%，繼代培養(yǎng)將6-BA濃度提高為9.0 mg/L時，增殖倍數(shù)達到12。黃青峰[20]以6-BA 5.00 mg/L、NAA 0.05 mg/L的組合誘導(dǎo)不定芽效果最好，誘導(dǎo)率達75%，增殖培養(yǎng)基用MS+6-BA 5.00～8.00 mg/L+NAA 0.05～0.10 mg/L，繼代周期45 d，平均繁殖系數(shù)為4.5。牟海飛等[34]認為6-BA濃度為4.0 mg/L時“桂紅龍1號”芽的誘導(dǎo)效果最佳，6-BA濃度越高，芽增殖倍數(shù)越高，但當(dāng)6-BA達到4.0 mg/L時，芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，IAA的芽增殖效果優(yōu)于NAA，當(dāng)IAA為0.1 mg/L時芽增殖效果較好，在培養(yǎng)基中添加PP 333對抑制玻璃化和促進火龍果組培苗繼代增殖的效果優(yōu)于AC。何小帆等[1]以培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L誘導(dǎo)紅心火龍果不定芽，發(fā)芽率達87.03%，以培養(yǎng)基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+AC 0.2 g/L增殖不定芽，增殖系數(shù)高達7.33。彭綠春等[19]選用培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0～4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+TDZ 0.4～0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L誘導(dǎo)不定芽，誘導(dǎo)率達80%，以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L為增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達6.4，并發(fā)現(xiàn)活性炭對火龍果莖段增殖有一定的抑制作用。劉洪章等[35]試驗得出火龍果組培快繁最好的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L，最好的伸長培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 10 mg/L，認為6-BA比KT更有利于火龍果的增殖。余慧琳等[36]發(fā)現(xiàn)，火龍果增殖培養(yǎng)中高濃度的6-BA易造成褐變，6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的激素組合用于增殖培養(yǎng)效果最好。

3.2 間接器官發(fā)生

通過間接器官發(fā)生途徑構(gòu)建火龍果高效的再生體系，可進行火龍果的遺傳轉(zhuǎn)化工作，以提高種苗質(zhì)量和改良品種。有關(guān)火龍果愈傷組織誘導(dǎo)和分化的研究已有報道，影響間接器官發(fā)生的關(guān)鍵性因素是植物生長調(diào)節(jié)劑的不同種類及濃度配比。黃紅梅等[25]以火龍果子葉為材料誘導(dǎo)愈傷組織，最適培養(yǎng)基是1/2 MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，子葉愈傷組織可以較容易誘導(dǎo)分化產(chǎn)生不定芽，最優(yōu)培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，但是發(fā)現(xiàn)來自莖段的愈傷組織是非胚性愈傷組織，未能分化出不定芽。鄧仁菊[37]以春季萌發(fā)的長10～20 cm火龍果枝條誘導(dǎo)愈傷組織效果較好，最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L，暗培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，愈傷組織為黃綠色、致密狀，外表有顆粒狀突起;愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS+TDZ0.4 mg/L+KT（或ZT）08 mg/L效果較好，增殖系數(shù)達到8以上;在愈傷組織分化過程中，添加20%～30%的椰子水對不定芽的形成具有一定的促進作用，但總體上愈傷分化率較低。邢玉良[31]以一年生火龍果幼嫩枝條為外植體，在培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.8 mg/L+NAA 01 mg/L上，愈傷組織出愈率達927%，愈傷組織塊大，呈黃綠色致密細顆粒狀，在培養(yǎng)基MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L上對愈傷組織進行不定芽誘導(dǎo)，不定芽再生率達87.2%，且芽呈綠色，莖段粗壯，長勢健壯。彭思維[27]發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)試驗中以啟動培養(yǎng)基誘導(dǎo)成熟植株的幼嫩莖段獲得“無菌莖段”作為外植體具有取材方便、污染率小且遺傳穩(wěn)定性強的優(yōu)點，得到的愈傷組織在培養(yǎng)基MS+TDZ 04 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L上培養(yǎng)，叢生芽誘導(dǎo)率高達94.0%，芽苗呈綠色、長勢好，而以子葉誘導(dǎo)的愈傷組織在培養(yǎng)過程中褐化嚴重。范建新[38]以培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖60 g/L誘導(dǎo)“紫紅龍”火龍果花藥愈傷組織，誘導(dǎo)率達37.8%，胚性愈傷組織為黃綠色、致密狀，外表有顆粒狀突起;愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS+TDZ 0.4 mg/L+KT 0.8 mg/L效果較好，增殖系數(shù)達9.1以上;愈傷組織再分化培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.4 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+NAA 0.6 mg/L時，再分化率達36.7%;經(jīng)生根和煉苗形成的完整植株用SRAP分子標(biāo)記檢測遺傳性一致，能為火龍果基因工程育種和種苗快速繁育提供新的途徑。

4 生根培養(yǎng)

對于生根培養(yǎng)基，由于低無機鹽濃度有利于植物根系的生長，火龍果離體生根主要采用1/2 MS添加不同濃度的生長素來誘導(dǎo)。林潤怡[39]以培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 1.0 mg/L誘導(dǎo)生根，生根率達95.19%。邢玉良[31]以1/2 MS+NAA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+AC 500 mg/L為生根培養(yǎng)基，生根率達973%，平均每株生根數(shù)為7.1條，平均根長達10.2 cm，生根苗長勢健壯。何小帆等[1]以培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AC 0.2 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂4.6 g/L誘導(dǎo)紅心火龍果不定芽生根，生根率達100%。周傳明等[40]以MS為基本培養(yǎng)基，附加IBA 1.5 mg /L進行培養(yǎng)7 d后開始生根，培養(yǎng)20 d生根率達96.7%。彭綠春等[19]以培養(yǎng)基MS+NAA 0.3 mg/L+AC 1.0 g/L進行生根培養(yǎng)，生根率達100%，發(fā)現(xiàn)添加活性炭十分有利于生根，增殖培養(yǎng)基附加活性炭可同步增殖和生根，在MS+6-BA 2～8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L培養(yǎng)基中能實現(xiàn)火龍果一次成苗，增殖系數(shù)最高可達3.55，生根率為100%。

5 煉苗移栽

組培苗移栽之前需要先對其進行煉苗，否則組培苗會因不適應(yīng)有菌環(huán)境而容易死亡[41]。黃青峰[20]移栽前先將瓶苗移出恒溫培養(yǎng)室，在室溫及較強散射光中煉苗5 d，打開瓶蓋繼續(xù)煉苗2～3 d后移栽，火龍果試管苗成活率達86%以上。張領(lǐng)等[33]認為火龍果試管苗馴化移栽前期要保持較高的空氣濕度，有利于成活。何小帆等[1]認為，紅心火龍果組培苗移栽適宜基質(zhì)配比為V（珍珠巖）∶V（紅土）∶V（腐殖土）=1∶1∶1，其成活率達98.9%。周傳明等[40]將長有2～3條根、苗高2～3 cm的火龍果試管苗移栽于菜園土和細砂中，40 d后移栽成活率均為100%，但以細砂為基質(zhì)的移栽苗木生長較好，苗較高、莖段粗壯、生長旺盛，認為火龍果組培苗的移栽需要有良好的透水、透氣條件。

6 展望

近年來，火龍果組織培養(yǎng)技術(shù)研究取得了不少進展，但也存在一些問題：一是不同學(xué)者研究得出的組培各階段最適植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比有差異，這可能與所取外植體的生長狀態(tài)以及內(nèi)源激素含量不同有關(guān);二是火龍果組培技術(shù)的研究中大多是對單一品種進行培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比的研究，但火龍果品種較多，不同品種的消毒、誘導(dǎo)、增殖和生根的方法可能都存在差異;三是目前關(guān)于火龍果組培的報道主要集中在器官組培再生體系的建立，而在遺傳改良、育種材料創(chuàng)制、種質(zhì)保存等方面的研究較少。面對火龍果廣闊的發(fā)展前景，今后可從以下4個方面展開研究，以推動火龍果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展：一是通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化、離體再生體系的改進等，建立不同火龍果品種的組培技術(shù)體系;二是探討火龍果組培過程中的一系列生理生化現(xiàn)象;三是利用組培技術(shù)進行遺傳改良、種質(zhì)創(chuàng)新，并結(jié)合基因工程技術(shù)，獲取品質(zhì)優(yōu)、抗性好的火龍果種質(zhì);四是利用組培技術(shù)進行火龍果種質(zhì)資源的長期保存，研究種質(zhì)在繼代過程中的遺傳穩(wěn)定性。

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