Met-tRNAiMet載體蛋白在急性髓系白血病(AML)中的表達(dá)及功能

蘇鵬忠，何家驩，于 姍，王小爽，余 佳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

mRNA的翻譯起始于核糖體小亞基(真核生物中的30S核糖體或原核生物中的40S核糖體)正確識別mRNA上的起始密碼子，核糖體小亞基P位點上起始tRNA(Met-tRNAiMet)的出現(xiàn)對于起始密碼子的識別至關(guān)重要。一類被稱為起始tRNA載體的翻譯起始因子促進(jìn)Met-tRNAiMet向核糖體P位點的轉(zhuǎn)移[1]。真核生物中，eIF2是最主要的起始tRNA載體蛋白?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在多種應(yīng)激狀態(tài)下，4種蛋白激酶可磷酸化eIF2的α亞基，通過隔離eIF2B而抑制eIF2正常結(jié)合起始tRNA并啟動翻譯的功能，從而導(dǎo)致大多數(shù)真核生物mRNA的翻譯受阻[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，一些mRNA的翻譯不受到應(yīng)激條件下eIF2α磷酸化造成的翻譯抑制調(diào)控。具體而言，eIF2A、eIF2D和MCTS1等蛋白能夠在丙型肝炎病毒(HCV) mRNA的內(nèi)部核糖體位點(IRES)介導(dǎo)的翻譯中運輸tRNA。此外，eIF2α不依賴的翻譯起始能夠通過促進(jìn)腫瘤相關(guān)mRNA的翻譯，幫助腫瘤細(xì)胞獲得選擇性生長優(yōu)勢并逃避凋亡。例如，eIF2A在鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的癌基因功能，eIF2A選擇性地調(diào)控癌基因的翻譯，從而促進(jìn)了鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生[2]。MCTS1也是調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡的重要原癌基因，其在83.9%的肺癌中表達(dá)上調(diào)，并在乳腺癌和淋巴瘤模型中促進(jìn)惡性生長、血管形成、組織侵襲和抑制凋亡[3-4]。eIF2D在腫瘤發(fā)生中的功能還未見報道。除了上述在實體腫瘤中的研究報道，目前這些Met-tRNAiMet載體蛋白在成體造血分化和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)細(xì)胞中的功能尚不明確。

本研究旨在分析3個Met-tRNAiMet載體蛋白eIF2A、eIF2D和MCTS1在成體造血分化不同階段和AML細(xì)胞中的表達(dá)情況，并在AML細(xì)胞系MOLM13中初步研究這些蛋白對于AML發(fā)生發(fā)展的調(diào)控功能。

1 材料與方法

1.1 材料

高效RIPA裂解液(組織/細(xì)胞)(碧云天生物技術(shù)公司)；PG113 PAGE凝膠快速制備試劑盒、PS119 通用型抗體稀釋液、SQ101L Omni-ECLTM增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(上海雅酶生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)；293T和MOLM13細(xì)胞系(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；兔源eIF2A、eIF2D、β-actin抗體(Proteintech公司)；山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Neofect轉(zhuǎn)染試劑(北京碼音科技有限公司)；RPMI 1640 (#61870036)、DMEM(#11965092)和胎牛血清(Thermo Fisher公司)；細(xì)胞增殖檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 shRNA干擾片段設(shè)計和載體構(gòu)建：通過https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/網(wǎng)站設(shè)計針對eIF2A和eIF2D的干擾序列，eIF2A shRNA：5′-GCTACTGCTGTGTTGGTAATA-3′，eIF2D shRNA：5′-CGTCATTAACTACGCCAAGAA-3′。根據(jù)序列合成shRNA引物，將退火得到的片段構(gòu)建進(jìn)入plko.1載體，測序驗證shRNA序列的準(zhǔn)確性。

1.2.2 AML細(xì)胞系培養(yǎng)：細(xì)胞系293T培養(yǎng)于DMEM，AML細(xì)胞系MOLM13培養(yǎng)于RPMI 1640，均加入10%胎牛血清。培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃和飽和濕度。

1.2.3 慢病毒介導(dǎo)的質(zhì)粒表達(dá)：在293T細(xì)胞中使用Neofect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染shRNA載體，觀察細(xì)胞狀態(tài)，48～72 h后收集培養(yǎng)液上清。過濾上清后20 000 r/min離心3 h，收集病毒顆粒。離心得到的病毒顆粒用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸。為了在MOLM13細(xì)胞中感染shRNA載體，以濃度1×106/mL接種MOLM13細(xì)胞，每2×106/mL細(xì)胞加入100 μL慢病毒重懸液，同時加入polybrene以增加感染效率。感染14～16 h后收集細(xì)胞懸液，800 r/min離心5min，去上清后更換含有10%血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。

1.2.4 免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá)：在處理后的相應(yīng)時間點收集細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液提取總蛋白并測定蛋白濃度(BCA法)。每孔上樣20～30 μg總蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品。利用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入eIF2A、eIF2D一抗(1∶1 000稀釋)，β-actin一抗(1∶10 000稀釋)4 ℃孵育12～16 h后，加入山羊抗兔IgG室溫孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯影，分析蛋白表達(dá)。

1.2.5 細(xì)胞增殖和周期檢測：采用CCK8試劑盒以及酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞增殖，具體方法參考試劑盒說明。以5 000個細(xì)胞/100 μL完全培養(yǎng)基的濃度，將慢病毒感染的MOLM13細(xì)胞接種至96孔板中。將96孔板在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24、48、72和96 h后，向每個孔中加入10 μL CCK8試劑，孵育2 h。利用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值，觀察統(tǒng)計細(xì)胞的增殖水平。

采用細(xì)胞周期檢測試劑盒以及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期情況，具體方法參考試劑盒說明。收集慢病毒感染的MOLM13細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106/mL，并用PBS洗滌2次，之后用100 μL PBS重懸，并加入5 μL PI試劑，混勻后4 ℃染色30 min，補充PBS至總體積500 μL。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行PI信號的檢測。得到的流式結(jié)果使用modfit軟件進(jìn)行周期分析，記錄G1、S和G2/M期細(xì)胞所占的比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Met-tRNAiMet載體蛋白在小鼠造血干細(xì)胞分化不同階段的表達(dá)

首先檢測了Met-tRNAiMet蛋白在小鼠造血分化不同階段的表達(dá)變化(GSE142216)[5]。其中髓系分化包含12種類型的細(xì)胞，淋系分化包含8種類型的細(xì)胞。在髓系和淋系不同分化階段分別對3個替代蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計，并按照分化的過程進(jìn)行排序，發(fā)現(xiàn)在髓系和淋系分化過程中eIF2A和eIF2D的表達(dá)水平在干細(xì)胞和祖細(xì)胞階段較高，而在成熟血液細(xì)胞中均呈降低趨勢(P<0.01)(圖1A～B, D～E)，而MCTS1在干祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞中的表達(dá)沒有明顯的變化趨勢(P<0.05)(圖1C, F)。綜上，eIF2A和eIF2D在小鼠造血干祖細(xì)胞(HSPCs)中表達(dá)水平較高。

2.2 Met-tRNAiMet載體蛋白在健康人造血干細(xì)胞分化不同階段的表達(dá)

進(jìn)一步利用健康人造血細(xì)胞的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)(GSE139369)[6]，分析不同階段造血細(xì)胞中Met-tRNAiMet載體蛋白的表達(dá)變化。用LSI(latent semantic indexing)[7]及UMAP(uniform manifold approximation and projection)[8]方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)eIF2A和eIF2D在HSPCs(包括HSC、CMP和LMPP)和紅系祖細(xì)胞(Early.Eryth)中表達(dá)水平較高(P<0.001)(圖2A～C,E～F)，而MCTS1在多種細(xì)胞群體中無明顯表達(dá)差異(圖2D, G)。

2.3 eIF2A和eIF2D在健康人和AML患者中具有表達(dá)差異

進(jìn)一步探索上述Met-tRNAiMet載體蛋白在AML中的表達(dá)變化情況。利用參考文獻(xiàn)[9-10]中的數(shù)據(jù)集GSE13159分析健康人和AML患者單個核細(xì)胞中3個替代蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)eIF2A和eIF2D在AML患者中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)(圖3A，B)，但MCTS1在健康人和AML患者中的表達(dá)無顯著差異(圖3C)。

eIF2A(A, D), eIF2D(B, E) and MCTS1(C, F) expression analyzed in RNA-seq data of mouse blood cells; Lt-HSC.long-term hematopoietic stem cell; St-HSC.short-term hematopoietic cell; MPP.multiple potential progenitor; CMP.common myeloid progenitor; MEP.megakaryocyte erythrocyte progenitor; GMP.granulocyte-macrophage progenitor; Erya and Eryb.erythrocyte A and erythrocyte B; mono.monocyte; CLP.common lymphoid progenitor; CD4.CD4+T cell; CD8.CD8+T cell; B.B cells; NK.natural killer;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with HSPCs group

2.4 eIF2A和eIF2D對AML細(xì)胞系增殖的影響

利用AML細(xì)胞系MOLM13進(jìn)行eIF2A和eIF2D的功能研究。在MOLM13細(xì)胞系中，構(gòu)建的兩條位點特異的shRNA均能顯著地在蛋白水平抑制eIF2A或eIF2D的表達(dá)(圖4A左，B左)，可用于后續(xù)功能實驗。抑制eIF2A或eIF2D的表達(dá)均導(dǎo)致MOLM13細(xì)胞增殖受阻(P<0.001)(圖4A右, B右)。

2.5 eIF2A和eIF2D對AML細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響

抑制eIF2A或eIF2D的表達(dá)導(dǎo)致MOLM13細(xì)胞周期中處于G1期的細(xì)胞減少(P<0.01)，G2/M期的細(xì)胞增多(P<0.01)(圖4C,D)，即細(xì)胞在G2/M期發(fā)生阻滯。

2.6 AML細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下eIF2A和eIF2D表達(dá)上調(diào)

分別用salubrinal(10 μmol/L)處理和血清饑餓的方式處理細(xì)胞系MOLM13使細(xì)胞進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)。兩個應(yīng)激組eIF2A和eIF2D的蛋白表達(dá)均上調(diào)(圖5)。

A.scRNA-seq LSI UMAP projection of 35882 single cells across healthy hematopoiesis;eIF2A(B,E), eIF2D(C,F) and MCTS1(D,G) expression analyzed in the biological classifications for the scRNA-seqclusters; *P<0.001 compared with mature group

3 討論

血細(xì)胞的生成依賴于HSCs獨一無二的自我更新能力和多譜系分化潛能，HSCs可分化生成所有血細(xì)胞[11]。AML是HSPCs發(fā)生的一種侵襲性克隆障礙，其具體表現(xiàn)為髓系干祖細(xì)胞分化受阻，并自我更新產(chǎn)生LSCs[12]。由于LSCs具有耐藥性，所以AML患者復(fù)發(fā)率高，5年存活率低。目前已報道的AML關(guān)鍵作用分子有很多，比如NPM1c[13]、RBM39[14]等，但尚未證實具有臨床治療效果，AML的研究成果仍然處于基礎(chǔ)研究水平，急需適用性更強(qiáng)的作用機(jī)制，找到AML治療的關(guān)鍵靶向分子。

eIF2A(A), eIF2D(B) and MCTS1(C) expression analyzed in GSE13159; *P<0.001 compared with normal group

cell proliferation(A, B right) and cell cycle(C)in MOLM13 cell line was analyzed after eIF2A(A left) or eIF2D(B left)knocked down; D.significant difference analysis of cell cycle; *P<0.01, **P<0.001 compared with plko.1 group

圖5 應(yīng)激狀態(tài)下MOLM13細(xì)胞中eIF2A和 eIF2D的表達(dá)變化Fig 5 The changes of eIF2A and eIF2D expression in MOLM13 in stress

本研究證明，eIF2A和eIF2D在AML患者和正常HSPCs中高表達(dá)，提示eIF2A和eIF2D可能作為原癌基因在AML中發(fā)揮促癌作用。eIF2A和eIF2D的功能研究發(fā)現(xiàn)，eIF2A和eIF2D能夠促進(jìn)MOLM13的增殖，并且能夠維持MOLM13細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。值得注意的是，本研究證實eIF2A和eIF2D能夠使MOLM13細(xì)胞正常經(jīng)過細(xì)胞周期中的G2/M期，靶向抑制eIF2A或eIF2D表達(dá)后可使MOLM13阻滯在G2/M期。靶向G2/M期檢查點使腫瘤細(xì)胞長期阻滯在G2/M期可以作為腫瘤治療策略[15]。細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下eIF2A和eIF2D表達(dá)水平上調(diào)，提示eIF2A和eIF2D可能在eIF2不足的情況下通過轉(zhuǎn)運Met-tRNAiMet促進(jìn)特定mRNA分子的翻譯。

綜上，eIF2A和eIF2D可能通過促使正常細(xì)胞周期的進(jìn)行而增加MOLM13細(xì)胞的增殖能力，從而發(fā)揮原癌基因的功能；eIF2A和eIF2D有作為AML治療靶向分子的可能。