無溶媒結(jié)晶技術(shù)在維生素B12生產(chǎn)中的應(yīng)用

程俊山，李賀，楊繼宗，潘麗紅，顧曉菲，張苗靜

(華北制藥河北萊欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 052165)

維生素B12(vitamin B12)，是一類含鈷的復(fù)雜有機(jī)化合物，是目前已發(fā)現(xiàn)的最大、最復(fù)雜的維生素分子，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)非常穩(wěn)定，可溶于水、乙醇和丙酮，因其結(jié)晶為紅色，故又稱紅色維生素[1-2]。維生素B12是維持人類生命不可缺少的重要物質(zhì)，其作用主要是維持正常造血機(jī)制；參與人體細(xì)胞的代謝，影響DNA的合成與調(diào)節(jié)，參與脂肪酸的合成和能量的生成[3-6]。維生素B12已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和畜牧業(yè)，目前中國已成為全球維生素B12的主要產(chǎn)地，因此對其合成過程進(jìn)行研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

現(xiàn)階段工業(yè)制造方法均采用微生物發(fā)酵法，其生物合成過程比較復(fù)雜[7-8]。文獻(xiàn)報(bào)道的維生素B12為好氧合成路徑[9-10]，后提取過程為維生素B12發(fā)酵結(jié)束后通過加熱，將集中在胞內(nèi)的維生素B12釋放到胞外，過濾收集濾液，然后經(jīng)吸附、解吸、轉(zhuǎn)化、再吸附、再解吸、結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥等步驟得到維生素B12的成品。結(jié)晶過程是制藥行業(yè)重要的環(huán)節(jié),結(jié)晶技術(shù)直接影響成品的質(zhì)量，所以本文重點(diǎn)研究維生素B12的結(jié)晶制備技術(shù)。

目前行業(yè)內(nèi)通用的結(jié)晶生產(chǎn)工藝是溶媒結(jié)晶法，其工作原理是通過向維生素B12料液中加入特定的溶媒相，以降低維生素B12在混合相中的溶解度，使維生素B12結(jié)晶體析出的過程。溶媒結(jié)晶法技術(shù)成熟, 操作較為簡單,但主要缺點(diǎn)是生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量含溶媒廢液，企業(yè)無法自行處理廢液，“三廢”排放存在超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)。溶媒使用過程也會造成大氣污染問題，其易燃易爆的特性，也給企業(yè)生產(chǎn)增加了安全隱患。因此急需開發(fā)新的維生素B12結(jié)晶工藝，以達(dá)到生產(chǎn)、安全、環(huán)保、成本等多方面優(yōu)化的目的。

本文創(chuàng)新性地提出一種無溶媒結(jié)晶制備方法，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化結(jié)晶工藝參數(shù)，以維生素B12凈化液為原料，通過控制溫度、真空度，持續(xù)蒸發(fā)去除溶劑，再利用溫度差使結(jié)晶液溶解度下降，得到維生素B12產(chǎn)品，重點(diǎn)是控制減壓蒸發(fā)使維生素B12在不被破壞的情況下析出晶體。通過去除結(jié)晶過程中的溶媒，降低生產(chǎn)與環(huán)保成本，提高生產(chǎn)過程的安全性，同時(shí)工時(shí)、除雜效果滿足生產(chǎn)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司)。維生素B12凈化液取自華北制藥河北萊欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，其他試劑均為工業(yè)級，水為反滲透(reverses osmosis，RO)水。

1.2 無溶媒結(jié)晶工藝方法

向結(jié)晶罐中加入維生素B12凈化液，開啟攪拌。將凈化液減壓升溫蒸餾,在蒸餾過程中，分別記錄并檢測加熱至60、65、70、75 ℃，對應(yīng)真空度分別為0.06、0.07、0.08、0.09 kPa狀態(tài)時(shí)凈化液的效價(jià)及雜質(zhì)含量的變化。將濃縮的凈化液分別留樣，常壓冷卻溫度至10 ℃±1 ℃后，分別將結(jié)晶液過濾、干燥，得到的維生素B12晶體成品。

對無溶媒結(jié)晶過程中蒸發(fā)溫度、真空度、結(jié)晶前溶液效價(jià)等工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果比對，以提高主產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相關(guān)雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平。

1.3 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測方法

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

以w(VB12)、最大單雜為考察指標(biāo)，選取蒸發(fā)溫度為60、65、70、75 ℃，真空度為0.06、0.07、0.08、0.09 kPa，溶液效價(jià)為80 000、85 000、90 000、95 000 μg/mL，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，初步優(yōu)化制備工藝。

2.1.1 蒸發(fā)溫度的選擇

按照1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，量取維生素B12凈化液，真空度控制在0.08 kPa，溶液效價(jià)為80 000 μg/mL時(shí)，考察了蒸發(fā)溫度對w(VB12)的變化。由圖1可以看出，w(VB12)在蒸發(fā)溫度增加后先升高再降低，超過65 ℃后w(VB12)下降明顯。

圖1 蒸發(fā)溫度對w(VB12)及有關(guān)物質(zhì)指標(biāo)的影響Fig.1 The effect of evaporation temperature on w(VB12) and related substances

2.1.2 真空度的選擇

按照1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，量取維生素B12凈化液，蒸發(fā)溫度為65 ℃、溶液效價(jià)為80 000 μg/mL時(shí)，考察了真空度對w(VB12)的變化(圖2)。由圖2得到真空度的增加對有關(guān)物質(zhì)指標(biāo)的影響不大，但隨著真空度的上升，w(VB12)顯著提高。

圖2 真空度對w(VB12)及有關(guān)物質(zhì)指標(biāo)的影響Fig.2 The effect of vacuum degree on w(VB12) and related substances

2.1.3 溶液效價(jià)的選擇

按照1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，量取維生素B12凈化液，蒸發(fā)溫度至65 ℃、真空度為0.09 kPa時(shí)，考察了溶液效價(jià)對w(VB12)的變化(圖3)。由圖3可知在溶液效價(jià)考察項(xiàng)中，隨著效價(jià)的增加，w(VB12)先逐漸上升，再緩慢下降。綜合上述情況分析，選定蒸發(fā)溫度62.5～67.5 ℃、真空度為0.08～0.09 kPa、溶液效價(jià)為87 500～92 500 μg/mL。在此條件范圍內(nèi)，維生素B12的有關(guān)物質(zhì)指標(biāo)能達(dá)到內(nèi)控要求，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化波動較大，故應(yīng)用響應(yīng)面分析法對維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步展開研究。

圖3 溶液效價(jià)對w(VB12)及有關(guān)物質(zhì)指標(biāo)的影響Fig.3 The effect of concentration on w(VB12) and related substances

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化無溶媒結(jié)晶工藝參數(shù)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken數(shù)據(jù)模型，選擇蒸發(fā)溫度(A)、真空度(B)和溶液效價(jià)(C)為響應(yīng)面的3個(gè)因素，以w(VB12) (Y)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素及水平

2.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

按照表1中因素及水平，無溶媒結(jié)晶工藝的響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.2.3 模型的建立與分析

運(yùn)用Design-Expert軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到w(VB12)(Y)對蒸發(fā)溫度(A)、真空度(B)、溶液效價(jià)(C) 3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸擬合方程：

Y=98.38-0.22A+0.21B-0.037C-0.10AB+0.050AC+0.025BC-1.30A2-0.28B2-0.28C2。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

2.2.4 各因素間的交互作用

通過Design-Expert軟件分析，繪制回歸模型的響應(yīng)面和等高線，由圖4～6可以看出，等高線均為橢圓形，故A、B、C等3個(gè)因素兩兩交互作用顯著，對w(VB12)的影響程度由大到小為：AB、AC、BC，結(jié)果與回歸模型方差分析一致。

圖4 蒸發(fā)溫度和真空度的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 4 Response surface and contour map for evaporation temperature and vacuum degree

圖5 蒸發(fā)溫度和溶液效價(jià)的響應(yīng)曲面及等高線Fig. 5 Response surface and contour map for evaporation temperature and concentration

圖6 真空度和溶液效價(jià)的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface and contour map for vacuum degree and concentration

2.2.5 最佳工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)二次多項(xiàng)式回歸方程得到最佳工藝參數(shù)：蒸發(fā)溫度64.743 ℃、真空度0.087 kPa、溶液效價(jià)89 851 μg/mL，在此結(jié)晶工藝條件下(具體數(shù)據(jù)見表4)，w(VB12)的理論值為98.44%。

結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際可操作性，并進(jìn)一步驗(yàn)證模型方程的適用性與可靠性，最終采用蒸發(fā)溫度65.0 ℃、真空度0.090 kPa、溶液效價(jià)90 000 μg/mL，進(jìn)行制備維生素B12的無溶媒結(jié)晶試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次，結(jié)果平均w(VB12)達(dá)到98.50%，與理論值誤差0.06%，表明響應(yīng)面分析法所得w(VB12)驗(yàn)證值與回歸方程預(yù)測值較為吻合，調(diào)整后得到的條件依然可靠可行。

表4 驗(yàn)證w(VB12)結(jié)果

2.2.6 質(zhì)量指標(biāo)

驗(yàn)證應(yīng)用無溶媒結(jié)晶工藝制備的樣品(A1～A3)與溶媒結(jié)晶工藝制備的樣品(B1～B3)進(jìn)行質(zhì)量指標(biāo)對比，具體結(jié)果見表5。由數(shù)據(jù)可以看出，應(yīng)用無溶媒結(jié)晶工藝制備的產(chǎn)品，質(zhì)量符合生產(chǎn)要求，相較之前溶媒結(jié)晶工藝，制備產(chǎn)品的雜質(zhì)水平略有優(yōu)勢。通過表5各檢測項(xiàng)目的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值對比，說明新工藝穩(wěn)定可靠。

表5 不同工藝樣品質(zhì)量檢測結(jié)果

選取樣品A1和B1進(jìn)一步做穩(wěn)定性考察試驗(yàn)，設(shè)置條件：40 ℃±2 ℃、RH 75%±5%，放置3個(gè)月，質(zhì)量指標(biāo)結(jié)果見表6。由數(shù)據(jù)可以看出，應(yīng)用無溶媒結(jié)晶工藝制備的產(chǎn)品，相較之前溶媒結(jié)晶工藝制備產(chǎn)品的穩(wěn)定性略好。

表6 不同工藝樣品加速試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 工業(yè)化研究

經(jīng)穩(wěn)定性考察試驗(yàn)及風(fēng)險(xiǎn)評估分析后，應(yīng)用無溶媒結(jié)晶工藝進(jìn)行3批試生產(chǎn)(批重量80～100 kg)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)各質(zhì)量指標(biāo)均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求(表7)，因此，本文對產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

表7 試生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用維生素B12的溶解性的特點(diǎn)，將溶媒析晶改為降溫析晶，通過單因素試驗(yàn)，考察蒸發(fā)溫度、真空度、溶液效價(jià)等參數(shù)對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，并進(jìn)一步應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化無溶媒結(jié)晶工藝，優(yōu)化后工藝條件穩(wěn)定，制出的成品維生素B12含量高、質(zhì)量指標(biāo)較好。無溶媒結(jié)晶工藝質(zhì)量穩(wěn)定性優(yōu)于溶媒結(jié)晶工藝，經(jīng)試生產(chǎn)放大后，各質(zhì)量指標(biāo)滿足企業(yè)內(nèi)控要求，在提高生產(chǎn)安全性的同時(shí)，大幅減少了對環(huán)境的污染，同時(shí)減少了相關(guān)工序，有效地降低了生產(chǎn)成本，操作簡單，效果明顯。該方法為國內(nèi)首創(chuàng)，技術(shù)處行業(yè)領(lǐng)先水平，具有極高的工業(yè)推廣價(jià)值。