藏藥韋色尼阿丸預(yù)防宮腔粘連形成的實驗研究

付振琳，陳欣，楊菁

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

宮腔粘連(Intrauterine adhesions，IUA)是由多種原因?qū)е碌淖訉m內(nèi)膜基底層損傷，形成過多成纖維組織，從而使宮腔出現(xiàn)完全或部分阻塞、粘連，與月經(jīng)異常、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、繼發(fā)性不孕和妊娠并發(fā)癥等有關(guān)[1]。目前普遍認(rèn)為機械性損傷和感染是IUA發(fā)生的主要原因。宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)(Transcervical resection of adhesion，TCRA)是IUA的主要治療方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)粘連率仍高達(dá)62.5%[2]。因此，預(yù)防粘連再次發(fā)生是醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題之一。本研究從分子機制方面探索藏藥韋色尼阿丸對大鼠子宮粘連形成的預(yù)防作用，為預(yù)防宮腔粘連形成提供藏藥方面的實驗依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物

6～8周齡SD雌性未孕大鼠20只，體重180～200 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供(合格證號：1107271911006082)。大鼠在溫度(23±2)℃、標(biāo)準(zhǔn)光照(光照12 h和黑暗12 h循環(huán))條件下自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。術(shù)前陰道細(xì)胞學(xué)涂片均有穩(wěn)定動情周期。所有實驗程序均經(jīng)湖北省武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

二、主要試劑

藏藥韋色尼阿丸(0.5 g×20粒，藏藥制字Z2)由日喀則市藏醫(yī)院制劑室制備，主要成分為：小葉蓮、藏茜草、石榴籽、藏紫草、肉桂、巴夏嘎、熊膽、喜馬拉雅紫茉莉、沙棘膏、朱砂(制)、枸杞子、紫草茸等25味藥材。按“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”折算大鼠灌胃量，最終用蒸餾水配制成72 mg/ml工作濃度的藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、研究方法

1.造模與分組：將大鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、模型組、研究組，每組5只。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，動情期造模。其中正常對照組未進(jìn)行任何處理，模型對照組切開子宮后未進(jìn)行造模，模型組和研究組采用機械損傷及酒精灼燒法進(jìn)行造模。在屏障環(huán)境內(nèi)用異氟烷實施麻醉，誘導(dǎo)濃度為3%～4%，維持濃度2.0%～2.5%，流量為 500～700 ml/min。同時檢查動物是否處于完全麻醉狀態(tài)，根據(jù)麻醉深度及時調(diào)整。麻醉成功后，常規(guī)下腹部備皮，選取仰臥位將大鼠四肢固定在無菌操作臺上。模型組和研究組大鼠術(shù)中暴露子宮，于左側(cè)子宮近宮角處剪開約0.5 cm縱切口，用小型刮匙對子宮內(nèi)膜進(jìn)行搔刮，直到子宮內(nèi)膜有粗糙感即停止。夾閉子宮遠(yuǎn)近端，用注射器向?qū)m腔內(nèi)注入95%酒精20～30 s后取出，生理鹽水沖洗溢出部分，縫合子宮并逐層關(guān)腹。從術(shù)后第1天正常對照組、模型對照組及模型組大鼠均給予1 ml生理鹽水灌胃，研究組給予配制好的藏藥韋色尼阿丸藥液1 ml灌胃，用藥14 d后取出所有大鼠子宮組織，觀察子宮形態(tài)，4%甲醛固定，24 h后制成石蠟切片。

2.子宮內(nèi)膜HE染色檢查：切片常規(guī)用HE染色。每個標(biāo)本3張HE切片，在正置光學(xué)顯微鏡(×40)下，計數(shù)每個視野中子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算子宮內(nèi)膜的厚度，均計算平均值以供統(tǒng)計分析。

3.子宮內(nèi)膜纖維化檢測：對石蠟切片進(jìn)行Masson染色，在高倍光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機選擇每個Masson染色切片的3個視野，并使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算子宮內(nèi)膜纖維化的面積百分比。纖維化面積比=每個視野中子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化的面積除以子宮內(nèi)膜的總面積×100，并記錄平均值供進(jìn)一步的統(tǒng)計分析。

4.免疫組織學(xué)(IHC)檢查：將子宮組織石蠟切片脫蠟并水合。高溫高壓抗原修復(fù)后，3%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min。以1∶200的稀釋度添加TGF-β(BA0290，博士德，美國)或MMP-9(10375-2-AP，武漢三鷹)一抗，并在4°C下孵育過夜。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗，再加入稀釋度為1∶200的HRP標(biāo)記山羊抗兔(5220-0336，SeraCare，美國)二抗常溫孵育50 min。PBS清洗后加新鮮配制DAB溶液，顯微鏡控制顯色。將樣品切片用蘇木精復(fù)染，無水乙醇脫水，用二甲苯清除，并用中性膠封固。在每個高倍光學(xué)顯微鏡(×400)下，隨機選擇3個視野。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對樣本切片進(jìn)行半定量分析，即計算出目標(biāo)區(qū)域的積分光密度值(IOD)及面積(area)，以平均光密度值(AOD，AOD=IOD/area) 作為TGF-β、MMP-9表達(dá)強度的評價參數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、子宮外觀形態(tài)

用藥14 d后取出所有SD大鼠子宮組織，觀察子宮形態(tài)。正常對照組和模型對照組的子宮形態(tài)未發(fā)生明顯異常，宮腔大小均勻；而模型組中大鼠子宮左側(cè)(造模側(cè))與周圍組織發(fā)生明顯粘連，剝離后如圖所示，近宮角部位明顯充血，略有狹小，近卵巢端明顯膨大伴有積水表現(xiàn)；相反研究組中大鼠左側(cè)子宮與周圍組織有少許粘連，宮腔未發(fā)現(xiàn)狹小變形，形態(tài)飽滿，無積水充血改變(圖1)。

圖1 各組大鼠子宮外觀形態(tài)

二、子宮內(nèi)膜形態(tài)觀察及腺體數(shù)目變化

HE染色后，子宮內(nèi)膜鏡下可見(圖2A～D)。正常對照組的大鼠子宮腔清晰可見，內(nèi)膜表面覆蓋柱狀上皮，排列均勻且完整；粘膜下層和基底層可見大量呈橢圓形或長橢圓形的腺體。模型對照組與正常對照組差異不大，而模型組的大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)失常，內(nèi)膜表面排列紊亂且不連續(xù)，粘膜下層及基底層破損，腺體數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則。研究組的大鼠子宮腔增大，內(nèi)膜連續(xù)完整，厚度均勻，粘膜層下可見較多腺體，多呈圓形或橢圓形。

各組子宮內(nèi)膜厚度比較，模型組的子宮內(nèi)膜厚度[(13.392 0±0.204 4)μm]顯著薄于正常對照組[(19.968 1±0.325 4)μm]和模型對照組[(18.645 3±0.866 3)μm](P<0.05)；研究組的子宮內(nèi)膜厚度[(17.764 8±0.579 6)μm與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，與模型組相比顯著增厚(P<0.05)(圖2E)。

各組大鼠子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)目比較，正常對照組(44.222 0±3.091 2)、模型對照組(42.875 6±3.266 0)及研究組(38.226 7±2.867 4)的腺體數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但與模型組(25.303 0±1.247 2)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2F)。

三、子宮內(nèi)膜纖維化程度分析

子宮內(nèi)膜切片Masson染色后，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。鏡下可見：正常對照組的大鼠子宮內(nèi)膜、肌層、漿膜層結(jié)構(gòu)層次清晰，均勻完整，內(nèi)膜間質(zhì)少量藍(lán)色膠原纖維，肌纖維呈索形，排列整齊，暗紅色；模型組的大鼠子宮腔變小，可見炎性滲出物，子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維組織增加，可見大量藍(lán)染的膠原纖維聚集，成纖維樣改變，排列緊密，腺體個數(shù)減少；研究組子宮內(nèi)膜、肌層、漿膜層結(jié)構(gòu)層次清晰，內(nèi)膜淺表層均勻連續(xù)，基底層成條索狀藍(lán)染的的膠原纖維相較于模型組明顯減少(圖3A～D)。

各組子宮內(nèi)膜纖維化程度比較，模型組的纖維化面積百分比[(53.250 3±0.422 9)%]顯著高于正常對照組[(14.357 3±0.182 3)%]、模型對照組[(18.169 6±0.388 3)%](P<0.001)以及研究組[(20.339 8±3.501 3)%](P<0.05)；而研究組與正常對照組、模型對照組比較，均無顯著差異(P>0.05)(圖3E)。

A：正常對照組；B：模型對照組；C：模型組；D：研究組；E：各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度比較；F：各組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目比較；組間比較，*P<0.01，#P<0.05圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織的HE染色結(jié)果(×40)

A：正常對照組；B：模型對照組；C：模型組；D：研究組；E：各組大鼠子宮內(nèi)膜纖維化程度比較；組間比較，*P<0.001，#P<0.05圖3 各組大鼠子宮組織的Masson染色結(jié)果(×400)

四、藏藥韋色尼阿丸對TGF-β表達(dá)的影響

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測各組SD大鼠子宮內(nèi)膜中TGF-β的蛋白表達(dá)情況，并將用圖像分析軟件測定的各個視野中陽性染色的AOD作為蛋白的相對表達(dá)量。染色結(jié)果顯示：TGF-β蛋白染色后呈現(xiàn)棕黃色，4組子宮樣本中均有不同程度的表達(dá)，其中模型組表達(dá)最強，染色部位主要是上皮及間質(zhì)部分，正常對照組、模型對照組及研究組表達(dá)較低，染色部位主要是上皮，而間質(zhì)較少(圖4A～D)。模型組的AOD(3.649 8±0.286 56)顯著高于正常對照組(0.979 5±0.069 6)、模型對照組(0.823 8±0.036 1)及研究組(1.114 4±0.061 9)(P<0.05)；而研究組與正常對照組、模型對照組比較，均無顯著差異(P>0.05)(圖4E)。

五、藏藥韋色尼阿丸對MMP-9表達(dá)的影響

染色結(jié)果顯示：MMP-9 蛋白染色后呈現(xiàn)棕黃色，主要表現(xiàn)在子宮內(nèi)膜基底層及漿膜層；4組子宮樣本中MMP-9均有不同程度的表達(dá)，其中模型組表達(dá)最弱，正常對照組、模型對照組及研究組均有較高表達(dá)(圖5A～D)。模型組的AOD(0.650 0±0.083 8)低于正常對照組(2.693 8±0.343 5)及模型對照組(2.832 8±0.331 7)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；研究組的AOD(2.381 0±0.200 0)高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5E)。

A：正常對照組；B：模型對照組；C：模型組；D：研究組；E：各組大鼠子宮內(nèi)膜中TGF-β表達(dá)水平比較；組間比較，*P<0.05圖4 各組大鼠子宮內(nèi)膜的TGF-β表達(dá)情況(免疫組化染色 ×400)

A：正常對照組；B：模型對照組；C：模型組；D：研究組；E：各組大鼠子宮內(nèi)膜中MMP-9表達(dá)水平；組間比較，*P<0.05圖5 各組大鼠子宮內(nèi)膜的MMP-9表達(dá)情況(免疫組化染色 ×400)

討 論

在藏醫(yī)中沒有宮腔粘連的記載，《四部醫(yī)典》中有關(guān)婦女不孕癥的介紹中講到，疾病的原因是由于身體違和，經(jīng)脈紊亂，是隆、赤巴和培根三者紊亂失調(diào)所致。藏藥韋色尼阿丸主要由小葉蓮、藏茜草、石榴籽、藏紫草、肉桂、巴夏嘎、熊膽、喜馬拉雅紫茉莉、沙棘膏、朱砂(制)、枸杞子、紫草茸等二十五味藥材組成?！毒е楸静荨分杏涊d紫草茸涼血、解毒，治療血熱癥；熊膽止血，治療外傷、赤巴病等；石榴升胃溫，治隆病等；喜馬拉雅紫茉莉性溫，溫胃、暖腎，治療腎寒、下身寒證等；小葉蓮治脈病、子宮病等；藏紫草解毒、清血熱等；沙棘果熬膏入藥，活血散瘀，治療培根病等；枸杞子清心熱，治婦科病。藏茜草清熱、活血，治血分病、血熱病、腎熱等?？傊?，藏藥韋色尼阿丸的主要功效為調(diào)經(jīng)血、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛，用于婦女血癥、風(fēng)癥、子宮蟲病及月經(jīng)不調(diào)等，契合宮腔粘連的臨床表現(xiàn)。

Sun等[3]通過乙醇滴注、熱剝離、機械損傷或感染引起的機械損傷(雙重?fù)p傷)在每只大鼠子宮的一側(cè)誘導(dǎo)IUA，觀察到子宮內(nèi)膜變薄、腺體減少和纖維化增生的形成。本研究通過機械損傷和乙醇灌注的方法誘導(dǎo)IUA，模型組也發(fā)現(xiàn)大鼠的子宮內(nèi)膜變薄、腺體減少和纖維化形成，同時研究組應(yīng)用藥物后發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜增厚，腺體增多，提示藏藥韋色尼阿丸在恢復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)上有一定療效。

子宮內(nèi)膜纖維化被認(rèn)為是IUA發(fā)展中的重要病理變化[4]。TGF-β是纖維化形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)纖維化進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞，并使細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)沉積異常增加，從而促進(jìn)宮腔粘連的形成[5]。相關(guān)研究表明，與正常子宮內(nèi)膜相比，IUA患者子宮內(nèi)膜中的TGF-β蛋白水平表達(dá)明顯增加[6-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在IUA大鼠模型中，TGF-β蛋白的表達(dá)水平顯著增高，而正常對照組、模型對照組中表達(dá)水平較低，其中研究組與正常對照組相比也顯著降低，這與已有研究結(jié)果相符。

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)家族的成員，可以降解絕大多數(shù)ECM的沉積，并減少血纖蛋白的沉積，這是維持纖維化動態(tài)平衡的重要標(biāo)志[11]。相關(guān)研究表明，下調(diào)MMP-9的表達(dá)水平可引起IUA的發(fā)生和發(fā)展，在IUA患者子宮內(nèi)膜中MMP-9的蛋白表達(dá)水平相對正常者較低[12-16]。本研究結(jié)果顯示，在正常對照組和模型對照組中MMP-9的表達(dá)水平顯著高于模型組，研究組的表達(dá)水平也高于模型組，這與已知的研究結(jié)果相符。

綜上所述，本研究表明藏藥韋色尼阿丸在預(yù)防宮腔粘連形成中具有一定作用，可通過抑制子宮內(nèi)膜TGF-β的表達(dá)、上調(diào)MMP-9的表達(dá)水平來發(fā)揮抗纖維化作用，從而達(dá)到預(yù)防大鼠IUA的形成。