1 702例早孕絨毛細胞培養(yǎng)及細胞遺傳學分析

郝娜，田曉彤，周京，戚慶煒，蔣宇林，周希亞，劉俊濤

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)科中心，北京 100730)

絨毛取樣活檢術(Chorionic villus sampling，CVS)是一種早孕期(11～13+6周)介入性產(chǎn)前診斷技術，有助于早期診斷和早期處理，是預防出生缺陷的重要手段[1]。染色體核型分析可以有效檢出染色體數(shù)目異常，以及大片段的缺失、重復、易位、倒位等結(jié)構異常，是細胞遺傳學產(chǎn)前診斷的金標準[2]。本文回顧性分析了北京協(xié)和醫(yī)院1 702例早孕期絨毛細胞培養(yǎng)及染色體核型分析結(jié)果，對產(chǎn)前診斷指征和異常結(jié)果之間的關系進行討論，并對絨毛取樣活檢術在產(chǎn)前診斷中的應用進行總結(jié)。

資料與方法

一、研究對象

選取2002年4月至2019年9月在北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心行超聲引導下絨毛活檢術的早孕期患者。

納入標準：(1)孕11～13+6周；(2)資料完整；(3)產(chǎn)前診斷指征包括高齡妊娠、單基因病孕史、超聲異常(胎兒頸部透明層增厚、頸部水囊瘤、鼻骨缺失、全前腦，巨膀胱等)、夫妻雙方之一有易位或倒位等染色體異常、孕產(chǎn)史不良(不明原因流產(chǎn)、胎停育、畸形兒孕產(chǎn)史、21-三體等染色體病孕產(chǎn)史等)。

排除標準：孕婦存在出血、感染等產(chǎn)前診斷禁忌癥。

本研究共納入1 702例患者，根據(jù)產(chǎn)前診斷指征進行分組，當高齡合并其他指征時，以其他指征為分組標準。

二、方法

1.樣本采集：受檢者在孕11～13+6周時，在超聲引導下，經(jīng)腹部穿刺，吸取絨毛樣本15～20 mg，挑選合格組織樣本轉(zhuǎn)移送達實驗室。

2.樣本處理及組織培養(yǎng)：在超凈工作臺中將樣本清洗后移至15 ml無菌離心管中，加入胰酶溶液和膠原酶溶液，置于37℃水浴，2 000 r/min離心，棄上清，加入6 ml羊水培養(yǎng)基(CHANG，美國)，吹打混勻后，接種至兩個細胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5～7 d換液，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后，于倒置顯微鏡下觀察克隆狀態(tài)以備收獲。

3.收獲及顯帶：培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素(上海沃凱)工作液，置于37℃水浴箱中作用15 min。將培養(yǎng)基-細胞混合液倒入15 ml離心管，在原培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰酶-EDTA溶液(Gibco，美國)，置于37℃水浴箱中靜置15 min后，輕搖培養(yǎng)瓶，收集細胞，2 000 r/min離心10 min，棄上清，經(jīng)低滲、固定處理后在適宜的溫濕度(溫度25℃、濕度50%左右)條件下進行滴片。80℃恒溫干燥箱中3 h。胰酶吉姆薩分帶染色。

4.分析使用Cytovision分析系統(tǒng)(徠卡，德國)掃描并采集圖像，計數(shù)兩個獨立培養(yǎng)瓶中至少20個細胞，分析5個細胞，核型配對2個細胞[3]。依照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)進行分析。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率(%) 表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、一般情況

本研究共納入1 702例早孕期患者，年齡18～50歲，孕周11～13+6周。將染色體核型分析成功的病例按照臨床指征進行分類統(tǒng)計(表1)。

表1 早孕期患者產(chǎn)前診斷指征[n(%)]

二、絨毛細胞培養(yǎng)結(jié)果

絨毛細胞培養(yǎng)成功并獲得診斷級別及數(shù)量的共1 602例樣本，成功率94.12%，100例因細菌污染(35例)，核型數(shù)量不足、帶型欠佳(65例)等原因未得出診斷結(jié)果。后續(xù)均通過羊膜腔穿刺獲得產(chǎn)前診斷。

三、異常結(jié)果檢出情況

1 602例有診斷結(jié)果的樣本中檢出異常染色體核型161例，異常率為10.05%(161/1 602)，其中21-三體53例、18-三體39例、13-三體10例、性染色體異常31例、其他常染色體數(shù)目異常9例、染色體結(jié)構異常17例、多倍體2例。

因單基因病進行產(chǎn)前診斷的464例樣本中，檢出6例異常結(jié)果，異常率為1.29%。

超聲異常組中異常率35.14%(110/313)，包括胎兒頸部透明層(nuchal translucency，NT)增厚261例、頸部水囊瘤23例、鼻骨缺失、全前腦或巨膀胱等其他指征29例。將261例涉及NT增厚的病例分為兩組，單純NT增厚192例，檢出異常核型39例；NT增厚合并其他超聲異?；蜍浿笜?9例，檢出異常核型43例，組間差異有統(tǒng)計學意義(c2=41.57，P<0.05)。另外17例染色體結(jié)構異常包括7例平衡易位、4例倒位，其余6例在染色體斷裂和(或)重接過程中出現(xiàn)了遺傳物質(zhì)的丟失或重復。產(chǎn)前診斷指征與染色體核型分析異常結(jié)果見表2。

表2 產(chǎn)前診斷指征與染色體核型分析異常結(jié)果

四、嵌合發(fā)生結(jié)果

161例異常病例中，純合型異常核型153例，嵌合型異常核型8例，具體分為1例[47，XY，+7/46，XY]、1例[47，XY，+15/46，XY]、1例[47，XY，+21/46，XY]、1例[69，XXY/46，XY]、1例[45，X/46，XY]、3例[45，X/46，XX]，嵌合發(fā)生率為0.50%(8/1 602)。8例嵌合病例均進行了羊膜腔穿刺并進行羊水細胞染色體核型分析，除7號染色體嵌合在羊水中未出現(xiàn)外，其余7例均與絨毛結(jié)果相符。

五、穿刺后流產(chǎn)情況

1 702例樣本中，穿刺后2周內(nèi)胎兒出現(xiàn)停育的病例共計5例，流產(chǎn)率為0.29%。

討 論

一、早孕期CVS指征及與異常結(jié)果的關系

目前我國介入性產(chǎn)前診斷方式以中孕期羊膜腔穿刺為主，而早孕期CVS可以在孕11～13+6周獲得胎兒樣本進行產(chǎn)前檢測，提前了產(chǎn)前診斷時間，異常結(jié)果終止妊娠相對安全[4]。CVS的指征與中孕期羊膜腔穿刺有所不同。我院中孕期羊膜腔穿刺的指征前三位為高齡妊娠、唐氏篩查或無創(chuàng)產(chǎn)前檢測高風險、孕產(chǎn)史不良，而CVS的指征前三位分別為高齡妊娠、單基因病孕史及早孕期超聲異常。

由于我國開展早孕期一站式唐氏綜合征篩查的機構較少，中孕期唐氏篩查高危的孕婦只能進行中孕期產(chǎn)前診斷。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測于孕12周開始采血，獲得結(jié)果往往已超過CVS孕周，加之絨毛滋養(yǎng)細胞染色體可能與胎兒不一致[5]，因此無創(chuàng)產(chǎn)前檢測高風險孕婦往往也只能接受中孕期產(chǎn)前診斷[6]。高齡孕婦則可以根據(jù)自己的意愿，在早孕超聲正常的情況下，自主選擇CVS或羊膜腔穿刺。

在我院CVS的指征中，單基因病孕史占到29.14%。我國單基因病診斷水平近年來提高迅速，單基因病先證者家庭再次妊娠時尋求盡可能早期進行產(chǎn)前診斷。在本研究單基因病進行產(chǎn)前診斷的464例樣本中，除一例合并高齡外，其余均<35歲。經(jīng)產(chǎn)前遺傳咨詢后，孕婦均要求平行檢測單基因病和染色體病，檢出6例染色體核型異常結(jié)果(異常率1.29%)，并且染色體異常形式多樣。使用MLPA和/或測序技術可以檢測出單基因病突變位點，但通過針對目標基因的MLPA或測序無法進行核型診斷。因此，對于此類病人，除了對目標單基因病外，可以在檢測前咨詢時說明染色體核型分析的必要性，建議同時排除常見染色體疾病[7]。

早孕期超聲異?；蜍浿笜水惓Ｊ俏以篊VS的第三順位指征。早孕期超聲在我國已得到廣泛開展，超聲異?？赡芴崾咎喝旧w異常，胎兒染色體核型異常發(fā)生率也隨著軟指標數(shù)量的增多而上升。本研究中超聲異常組染色體總異常率高達35.14%(110/313)，臨床指征中83.39%(261/313)為NT增厚。在NT增厚的261例病例中，69例合并其他軟指標異常，染色體異常檢出率為62.31%(43/69)，高于單純NT增厚的病例(39/192，20.31%)。因此對于NT增厚的病例，尤其是合并高齡妊娠或其他軟指標異常時，建議早孕期CVS檢測[8]。另據(jù)文獻報道，頸部水囊瘤是性染色體異常的常見表現(xiàn)形式[9]。本次分析中23例頸部水囊瘤病例中檢出15例染色體異常，其中9例為性染色體異常，均為45，X，與文獻報告符合。

在CVS指征中，夫妻雙方之一染色體平衡易位攜帶雖然僅占1.53%，但絨毛染色體異常比例最高(9/23，39.13%)。夫妻雙方之一的染色體異常均為染色體平衡易位，包括羅伯遜易位。染色體平衡易位在新生兒的發(fā)生率為1/500～1/650[10]，其中羅伯遜易位在一般人群中的發(fā)生率為1/900～1/1 000，子代獲得的幾率較高，及時發(fā)現(xiàn)并診斷，對胎兒出生后成長發(fā)育及婚育有指導作用。絨毛染色體核型分析能夠發(fā)現(xiàn)5～10 M以上的缺失或重復，而染色體易位造成的微缺失、微重復需要進行全基因組芯片檢測或測序方能獲得診斷[11]。隨著分子檢測技術的發(fā)展，夫妻雙方之一染色體平衡易位的患者應建議CVS時進行染色體微陣列分析[12]。

二、CVS取材與絨毛培養(yǎng)

由于CVS取材操作及組織培養(yǎng)的難度遠遠高于羊膜腔穿刺及羊水細胞培養(yǎng)，存在胎盤嵌合、母體污染、組織培養(yǎng)生長緩慢等問題，在我國未能得到廣泛使用。我院自2003年開始進行絨毛培養(yǎng)及細胞遺傳學分析，已形成相對成熟的操作流程及質(zhì)量控制體系，可以獲得較高的培養(yǎng)成功率[13]。

本研究中絨毛組織培養(yǎng)成功率為94.12%，100例培養(yǎng)失敗的病例中，35例為被污染的病例，多發(fā)生在實驗室開展絨毛培養(yǎng)的初期?？赡茉颍?1)不能除外孕婦存在宮內(nèi)感染，盡管穿刺前病史采集、測量體溫、血常規(guī)檢測可能有助于識別感染，但不能完全排除感染；(2)接種及培養(yǎng)環(huán)節(jié)的操作問題，絨毛接種前增加了消化細胞環(huán)節(jié)，處理過程中更需要注意無菌操作。65例核型少的病例多發(fā)生于單基因病組，考慮原因可能與樣本取材量相關。因樣本需要同時做基因及染色體分析2項檢測，對標本量需求相對大，此外絨毛取材樣本量還與孕周、胎盤位置、穿刺部位以及操作者的熟練程度有關。

我院CVS相關流產(chǎn)率為0.29%，與國內(nèi)外文獻報告的數(shù)字接近[14]。

三、絨毛樣本細胞遺傳學分析中的特殊問題

絨毛染色體出現(xiàn)嵌合時，既可能同時存在胎兒染色體異常，也可能與胎兒不一致。這與絨毛組織的發(fā)育來源有關。CVS所獲得的樣本為早孕期胎盤絨毛，主要為細胞滋養(yǎng)細胞及絨毛間質(zhì)，并非真正的胎兒組織[15]。絨毛表面和絨毛間質(zhì)來源于不同的細胞群，前者由滋養(yǎng)層細胞發(fā)育而來，后者則由內(nèi)細胞團分化后的胚外中胚層進一步發(fā)育而來。由于來源不同，可能出現(xiàn)絨毛核型與胎兒不符的情況，出現(xiàn)的嵌合現(xiàn)象稱為限制性胎盤嵌合(confined placenta mosaicism，CPM)。按照所累及的絨毛細胞，CPM可以分為3種類型：Ⅰ型CPM，異常的染色體只存在于細胞滋養(yǎng)層細胞中，僅可以在短期培養(yǎng)后見到；Ⅱ型CPM，異常的染色體局限存在于絨毛的間質(zhì)核心層細胞中，需要經(jīng)過長期培養(yǎng)后才能見到；Ⅲ型CPM，異常的染色體既存在于細胞滋養(yǎng)層細胞中，也存在于間質(zhì)核心層細胞中，在短期培養(yǎng)后和長期培養(yǎng)后均可見到[16]。文獻報道中，CVS檢查發(fā)現(xiàn)2、3、5、7、10、11、14、16、17-三體嵌合時，胎兒核型往往并無異常[17]。

絨毛嵌合體的另一種可能是胎兒真性嵌合體，即胎兒本身存在兩種或以上的細胞系[18-19]。本研究中8例嵌合病例均進行了羊膜腔穿刺及染色體核型分析，除7號染色體嵌合在羊水中未出現(xiàn)外，其余7例均與絨毛結(jié)果相符。

另外，母體細胞污染(Maternal cell contamination，MCC)也是造成嵌合體出現(xiàn)的原因，胎盤結(jié)構中羊膜和葉狀絨毛膜構成胎盤的胎兒部分，蛻膜構成胎盤的母體部分，取材時應盡量躲避蛻膜部位，改善進針角度和部位，并在處理絨毛組織之前盡可能剔除蛻膜以避免干擾結(jié)果。本研究中嵌合體檢出率低于文獻報道的1%～2%[20]，可能與穿刺指征構成有關。

四、總結(jié)

近年來，CVS已經(jīng)是早孕期介入性產(chǎn)前診斷的常用方法，我院在孕11～13+6周超聲引導下經(jīng)腹絨毛取材具有較高的成功率，極低的穿刺流產(chǎn)率(2～3/1 000)。絨毛染色體核型制備方法成熟，分析原則有嚴格的質(zhì)量控制?，F(xiàn)階段的產(chǎn)前診斷工作中細胞遺傳學仍為主流檢測方法，可以發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目和結(jié)構異常，對當次妊娠診斷及后續(xù)生育指導有顯著臨床意義。CVS尤其適用于單基因病孕史及早孕期超聲異常的產(chǎn)前診斷，當絨毛染色體出現(xiàn)嵌合時，要警惕胎兒與胎盤染色體不一致的情況。