UPLC法同時測定蒲地藍消炎口服液中9種成分的含量

阮仁余，鄧祥敏，王 朝，朱星宇，陳廣云

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術學院，淮安 223003；2.江蘇護理職業(yè)學院，淮安 223005；3.淮安市食品藥品檢驗所，淮安 223300)

蒲地藍消炎口服液由蒲公英、苦地丁、板藍根和黃芩4種中藥制成，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，主治癤腫、腮腺炎、咽炎和扁桃體等疾病[1-2]，在兒科臨床應用廣泛，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗菌、抗病毒和免疫調節(jié)等藥理作用[3-5]，方中蒲公英味苦、甘，性寒，清熱解毒，消腫散結，利尿通淋；苦地丁味苦，性寒，清熱解毒，散結消腫；板藍根味苦，性寒，清熱解毒，涼血利咽；黃芩味苦，性寒，清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎[1]。4藥均苦寒，共奏清熱解毒之效，對熱毒引起的咽喉腫痛、瘡癰腫痛具有顯著療效。

《中國藥典》2015年版一部在蒲地藍消炎口服液含量測定項下收載了黃芩苷和菊苣糖的含量測定，并未對苦地丁及板藍根所含成分進行含量測定，記載的方法存在耗時長、效率低等缺點，因此有必要探索更加快捷、高效的多指標含量測定方法[1]。由于蒲地藍消炎口服液臨床應用極為廣泛且療效確切，近年來越來越多的學者關注到其多指標質量控制的重要性。董自波等[6]建立了能同時測定蒲地藍消炎口服液中黃芩苷、漢黃芩素、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、紫堇靈和腺苷含量的HPLC法，為其多指標含量測定提供了參考，但該方法存在耗時長的缺點。吳婷等[7]利用UPLC-MS-MS法測定了蒲地藍消炎口服液中菊苣酸、黃芩苷、綠原酸、漢黃芩素、黃芩素和咖啡酸的含量，該方法具有快速、高效的優(yōu)點。高文雅等[8]利用高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法同時測定蒲地藍消炎口服液中12種成分含量的方法，實現(xiàn)了對核苷類、黃酮類和有機酸類成分的同時測定，具有靈敏度高、分離度好、選擇性強的優(yōu)點，為其質量控制的提升提供了實驗依據(jù)，但液質聯(lián)用法存在儀器成本高、不易推廣的缺點。UPLC法可用于中藥復方復雜體系的含量測定，可以對多成分、多指標進行同時測定，符合中藥復方整體質量控制的特點，且具有成本低廉、操作簡便、快捷的優(yōu)點[9-12]。

本文在文獻已有方法的基礎上，建立了能同時測定蒲地藍消炎口服液中9種成分含量的UPLC法，該方法快速、準確、穩(wěn)定，可為蒲地藍消炎口服液的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Waters公司)，包括二元高壓梯度泵、真空在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器和Empower 3色譜工作站；超聲波清洗器(天津市泰斯特儀器有限公司)；BT25S型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；明澈TM-D 24UV純水/超純水系統(tǒng)(濟南博美歐科技有限公司)，包括Progard預處理柱和Q-Gard超純水柱。

1.2試藥 對照品：綠原酸(批號110753-201715)、咖啡酸(批號110885-201702)、菊苣酸(批號111752-201601)、紫堇靈(批號111734-201802)、黃芩苷(批號110715-201718)、木犀草素(批號111520-201504)、漢黃芩苷(批號111728-201607)、黃芩素(批號111728-201607)和漢黃芩素(批號111514-201706)，均購自中國食品藥品檢定研究院；蒲地藍消炎口服液(批號分別為1808121、1808124、1808127)，濟川藥業(yè)集團有限公司；三氟乙酸(色譜純)，其余試劑均為分析純，均購自南京化學試劑股份有限公司;水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 Waters BEH C18色譜柱(30 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流動相：1 mL·L-1三氟乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫：0～1 min，95%A～85%A；1～2 min，85%A～81%A；2～6 min，81%A～78%A；6～9 min，78%A～65%A；9～12 min，65%A～52%A；12～14 min，52%A～48%A；14～18 min，48%A～5%A。流速：0.3 mL·min-1；進樣量：3 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm[13-20]。色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取9種成分對照品適量，加甲醇配制成單一對照品儲備液。精密移取上述單一對照品儲備液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到9種成分質量濃度分別為0.342、0.164、0.691、0.250、4.424、0.572、1.114、0.120、0.323 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 精密吸取蒲地藍消炎口服液1 mL，置于量瓶中，加入甲醇1 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，補足減失的質量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4陰性樣品溶液的制備 根據(jù)蒲地藍消炎口服液的處方，分別制備缺蒲公英、苦地丁和黃芩的陰性樣品，按照2.3項下方法制成陰性樣品溶液。

2.5線性關系考察 將2.2項下制備的混合對照品溶液分別稀釋0、2、4、8、16倍，將稀釋液注入液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件進樣測定，以質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線，結果見表1。

表1 9種成分的標準曲線Tab.1 Calibration curves of the 9 components

2.6精密度實驗 精密吸取2.3項下制備的供試品溶液，重復進樣6次，計算得9種成分峰面積的RSD值均小于1.46%，表明該儀器精密度良好。見表2。

2.7穩(wěn)定性實驗 按照2.3項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 精密吸取10 μL，按照2.1項下色譜條件進樣測定，計算9種成分峰面積的RSD值均小于1.90%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。見表2。

2.8重復性實驗 按照2.3項下方法重復制備6份供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定9種成分的含量，計算得RSD值均小于2.59%，表明該方法重復性良好。見表2。

表2 9種成分的精密度、穩(wěn)定性、重復性實驗的RSD值Tab.2 RSD values of precision，stability and reproducibility tests of the 9 compounds

2.9回收率實驗 精密量取已知含量的蒲地藍消炎口服液(批號1808121)，每份0.5 mL，共6份。分別精密加入2.2項下制備的綠原酸、咖啡酸、紫堇靈、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素單一對照品儲備液各25 μL及菊苣酸單一對照品儲備液50 μL、黃芩苷單一對照品儲備液70 μL。按照2.3項下方法制備溶液，補充甲醇使總體積為2 mL，按照2.1項下色譜條件進樣測定，計算9種成分的平均回收率。結果見表3。

表3 9種成分的回收率 (n=6)Tab.3 Recovery rates of the 9 compounds (n=6)

2.10樣品的含量測定 取蒲地藍消炎口服液適量，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣，測定9種成分的含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果Tab.4 Results of sample content determination

3 討論

本實驗通過DAD檢測器對供試品溶液進行全波長掃描，結果發(fā)現(xiàn)，供試品溶液在280 nm波長處各成分峰形良好，且分離度較高。此外，實驗初期對流動相進行了考察，分別考察了水-甲醇、水-乙腈、甲酸-乙腈、磷酸-乙腈、三氟乙酸-甲醇和三氟乙酸-乙腈系統(tǒng)。結果發(fā)現(xiàn)，樣品在1 mL·L-1三氟乙酸-甲醇系統(tǒng)下，響應最好，峰形最佳，最終通過多個洗脫梯度的考察，優(yōu)選了本文的洗脫條件，可以達到峰形好、分離度高的效果。

《中國藥典》2015年版中對蒲地藍消炎口服液的質量控制含量測定指標為菊苣酸和黃芩苷，其所用方法為HPLC法，存在耗時長、不能同時測定的缺點。本實驗利用UPLC法，在含量測定的基礎上增加了綠原酸、咖啡酸、紫堇靈、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素7種成分的含量測定，具有簡便、快捷的優(yōu)勢，能夠更加全面地評價蒲地藍消炎口服液的質量，符合中藥制劑整體評價的要求。

本實驗采用UPLC法在17 min內同時測定了蒲地藍消炎口服液中9種成分的含量，該方法快速、準確、重復性高、可操作性強，為蒲地藍消炎口服液的質量標準研究提供了參考。