細胞中同時檢測特定標(biāo)志物蛋白和基因表達方法的建立

賈坤，蘇建榮

組織切片中常采用免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）對特定標(biāo)志物的蛋白和基因水平進行檢測，其對生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、預(yù)防臨床醫(yī)學(xué)的研究、軍事醫(yī)學(xué)的應(yīng)用研究以及病理的輔助診斷等方面都具有重要意義[1-2]。免疫組織化學(xué)是指利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記在抗體上的顯色物質(zhì)（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來檢測組織細胞抗原，對其進行定位、定性和定量檢測的技術(shù)[1]。熒光原位雜交是依據(jù)堿基互補原理，應(yīng)用熒光素直接或間接標(biāo)記的核酸探針在復(fù)制切片、細胞涂片、染色體輔片上檢測間期細胞核染色質(zhì)數(shù)量即結(jié)構(gòu)變化，進行定性和相對定量的分析檢測技術(shù)[2]。采用免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交兩種方法分別在蛋白和基因水平對特定標(biāo)志物的表達進行檢測，從而為臨床提供輔助的診斷信息。在大多數(shù)情況下兩者的檢測結(jié)果是一致的，即標(biāo)志物基因和蛋白水平的表達存在明確的相關(guān)性[3]，然而在有些情況下，由于翻譯后修飾和基因表達調(diào)控等原因，特定標(biāo)志物基因和蛋白表達水平不完全一致，這種情況下就需要將兩種方法聯(lián)合起來進行檢測[4-5]。常規(guī)的做法是在兩張切片中分別進行 IHC 和 FISH的檢測，首先在 IHC 染色片子上確定待復(fù)核的區(qū)域；然后在 FISH 標(biāo)本上低倍鏡下找到相同的組織細胞結(jié)構(gòu)，采用高倍鏡進一步的觀察。該方法受切片質(zhì)量、腫瘤異質(zhì)性、染色過程等的影響[4-6]。

本文建立了一種在同一張片子上同時對特定標(biāo)志物進行蛋白和基因水平檢測的方法，聯(lián)合蛋白的 IHC 和基因的 FISH 檢測方法，在同一張片子上進行同一種標(biāo)志物蛋白水平和基因水平的檢測，提高這兩種方法的匹配度和適用性，可為臨床提供更好的輔助診斷方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人乳腺癌細胞系 JIMT-1 購自上海子實生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗人 HER2 單克隆抗體 ab214275、兔抗人 pan-CK 單克隆抗體ab234297、兔抗人 Ki67 單克隆抗體 ab92742、Alexa Fluor 488 標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗均購自Abcam 公司；抗兔二抗 SP 試劑盒、DAB 顯色液購自北京中杉金橋公司；Alexa Fluor 555 標(biāo)記的HER2 基因探針購自美國雅培公司；胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基、 胰蛋白酶均購自美國Sigma-Aldrich 公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國 Napco公司；超凈工作臺購自北京冠鶴凈化設(shè)備有限公司；原位雜交儀 Hydridizer 購自丹麥 Dako 公司；熒光顯微鏡 Nikon-Ni 購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 JIMT-1 細胞培養(yǎng)和細胞涂片的制備 細胞采用含有 10% 胎牛血清和 1% 雙抗（青霉素和鏈霉素）的 RPMI1640 完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞融合度 80%～90% 時，采用 1×PBS 洗滌3 次后，胰蛋白酶消化 3 min，完全培養(yǎng)基終止后，800 r/min 離心 5 min，棄上清，得到細胞沉淀，然后采用培養(yǎng)基重懸后傳至 2～3 個新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

1.2.2 腫瘤細胞系涂片中 HER2 免疫熒光和熒光原位雜交檢測 ①預(yù)處理：培養(yǎng)的 JIMT-1 細胞系，消化后離心，取細胞懸液涂片在 1 cm×1 cm組化框的載玻片上，自然干燥后，采用 4% 的多聚甲醛固定 10 min；②免疫組化檢測：采用免疫組化染色 SP 三步法對細胞涂片進行染色，抗原在堿性檸檬酸鈉緩沖液中高溫高壓修復(fù)，過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，山羊血清封閉后，加入一抗 37 ℃ 孵育 1 h，后續(xù)處理采用 SP 和 DAB 顯色試劑盒中提供步驟對細胞涂片進行免疫組織化學(xué)染色；③熒光原位雜交檢測：將載玻片浸入 37 ℃預(yù)熱的 2×SSC 中 5 min，然后依次采用預(yù)冷的75%、85%、100% 乙醇脫水，切片風(fēng)干后，加入HER2 探針，蓋上蓋玻片后用封片劑外封，置于雜交儀中，設(shè)置變性 76 ℃ 10 min，雜交 37 ℃ 24 h；雜交后洗滌，依次采用 43 ℃ 預(yù)熱的甲酰胺和含有0.1% Triton X-100 的 2×SSC 分別洗滌 2 次，每次 5 min，采用含有防淬滅劑的 DAPI 染色液進行封片；④免疫熒光檢測：將固定后的載玻片浸入1×PBS 中，浸泡 5 min，采用含有 0.2% Triton X-100 的 1×PBS 透化處理 5 min，然后加入10% 的山羊血清封閉 30 min；采用 2% 的山羊血清稀釋 HER2 抗體，滴加在標(biāo)本區(qū)，37 ℃ 孵育1 h，采用 PBST 洗滌后加入熒光二抗染色 37 ℃30 min，PBST 洗滌后采用含有防淬滅劑的 DAPI染色液進行封片；⑤免疫熒光和熒光原位雜交聯(lián)合檢測：采用先進行基因的 FISH 后進行蛋白的免疫熒光檢測的方法進行聯(lián)合檢測，具體的步驟為：先參照 FISH 的檢測方法，一直到雜交后的洗片，不進行 DAPI 封片，直接進行 IF 染色中的 PBS洗片和后續(xù)處理。

1.2.3 觀察 染色后的片子采用熒光顯微鏡觀察，分別在橙色通道、綠色通道和藍色通道下對HER2 的基因擴增、蛋白的表達和細胞核進行觀察。陽性結(jié)果判定：藍色通道下細胞核聚集并且輪廓清晰；免疫熒光檢測中綠色通道下目的蛋白檢測為明顯的一圈或者一片，細胞定位與理論相符，背景信號無或弱；熒光原位雜交檢測中橙色通道下為細胞核區(qū)域的明顯點狀著色，靶點信號強，背景信號無或弱；陰性結(jié)果判定為：沒有細胞核著色或者細胞核散、綠色通道無著色或者不是細胞膜定位、FISH 信號不是明顯的點狀著色而是一片，包含有以上任意情況均認為是陰性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化和免疫熒光法檢測JIMT-1 細胞中HER2 表達

采用 JIMT-1 細胞系作為檢測細胞，其為HER2 高表達乳腺癌細胞系，并且 HER2 基因大多為 4 倍體。JIMT-1 細胞涂片中 HER2 蛋白檢測分別參照上述免疫組化和免疫熒光檢測方法，二抗分別采用 Alexa Fluor 488 標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗和 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔酶標(biāo)二抗。結(jié)果如圖1所示：分別采用熒光二抗和酶標(biāo)二抗均可以在JIMT-1 細胞中檢測到 HER2 蛋白的細胞膜定位，兩者在結(jié)果判讀上沒有明顯差異。

圖1 JIMT-1 細胞中 HER2 蛋白表達檢測（400 ×；A：免疫熒光染色；B：免疫組織化學(xué)染色）Figure 1 Detection of HER2 expression in JIMT-1 cell(400 ×; A:Immunofluorescence stain; B:Immunohistochemical stain)

2.2 免疫熒光和熒光原位雜交聯(lián)合檢測

由于免疫熒光和免疫組化對蛋白標(biāo)志物的檢測原理是相同的，并且兩者在細胞定位和結(jié)果判讀上沒有明顯差異，而特定標(biāo)志物基因水平的檢測一般采用的是熒光原位雜交，為將兩者結(jié)合起來，采用免疫熒光作為特定標(biāo)志物蛋白表達水平的檢測方法，建立同時檢測標(biāo)志物蛋白和基因水平的方法。JIMT-1 細胞涂片分別采用上述方法進行HER2 蛋白的免疫熒光檢測和 HER2 基因的熒光原位雜交檢測以及兩者的聯(lián)合檢測。結(jié)果如圖2所示，JIMT-1 細胞中 HER2 蛋白圍繞細胞的一圈，HER2 基因檢測為細胞核內(nèi)的多個信號點；HER2 蛋白和基因聯(lián)合檢測中，可在同一細胞，不同通道下分別檢測到 HER2 蛋白和基因的表達情況，并且與單純的免疫熒光檢測 HER2 蛋白和熒光原位雜交檢測 HER2 基因結(jié)果相同，不影響HER2 蛋白表達水平和細胞定位以及基因拷貝數(shù)的判讀。兩種方法的聯(lián)合檢測結(jié)果與單純的蛋白和基因檢測結(jié)果相比，HER2 蛋白的定位和熒光強度均不受影響。

圖2 JIMT-1 細胞中 HER2 蛋白和基因檢測（400 ×；A：HER2 蛋白的 IF 檢測；B：HER2 基因的 FISH 檢測；C：IF 和FISH 聯(lián)合檢測）Figure 2 HER2 protein and gene detection of JTMT-1 cell (400 ×; A:IF stain of HER2 protein expression; B:FISH of HER2 gene expression; C:IF-FISH combined detection)

2.3 不同亞細胞定位靶標(biāo)的蛋白和基因聯(lián)合檢測

分別對不同細胞亞定位的靶標(biāo)進行蛋白和基因水平的聯(lián)合檢測，選取不同細胞定位的 HER2、pan-CK 和 Ki67，分別與 HER2 基因聯(lián)合檢測。結(jié)果如圖3 所示，HER2 為細胞膜定位，在細胞中為圍繞細胞的圈狀著色；pan-CK 為細胞漿定位，在細胞中為胞漿的片狀著色；Ki67 為細胞核定位，在細胞中為與細胞核重合的片狀著色。采用該方法可以在 JIMT-1 細胞中對不同定位的蛋白和 HER2基因進行聯(lián)合檢測。

圖3 細胞涂片中不同定位蛋白和 HER2 基因聯(lián)合檢測（400 ×）Figure 3 IF-FISH combined detection of different location protein in (400 ×)

3 討論

免疫組織化學(xué)是指將顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)，其在病理診斷中具有重要的臨床意義，尤其是腫瘤的輔助診斷、標(biāo)志物篩選和指導(dǎo)用藥等方面[7-8]。熒光原位雜交主要用于病理的輔助診斷和鑒別診斷、疾病預(yù)后評估和指導(dǎo)臨床靶向治療等，是近十年來臨床病理檢測中運用最為廣泛的一種分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)[2]。兩者的應(yīng)用領(lǐng)域和檢測方法有很高的重復(fù)性，并且目前的一些診療指南中已將兩者的應(yīng)用聯(lián)合起來。例如乳腺癌病理檢測中 IHC 和 FISH 檢測HER2 蛋白和基因的表達狀態(tài)一致性很高，但也存在著差異，在不同研究中發(fā)現(xiàn)切片中進行 HER2蛋白和基因的檢測，其符合性差異較大，尤其對IHC 結(jié)果為 ++ 的情況下，其大約有一半是 FISH陰性[9]，《2014年NCCN 乳腺癌臨床實踐指南》和《乳腺癌 HER2 檢測指南（2014 版）》均建議先進行 HER2 蛋白的 IHC 檢測，HER2++ 樣本進行 FISH 的檢測。

免疫組織化學(xué)染色中通過顯色底物的不同，可以將目的蛋白顯示為不同的顏色[10]。文中比對了采用熒光二抗和酶標(biāo)二抗對 HER2 蛋白進行檢測。兩者均可檢測到 HER2 的細胞膜定位，沒有明顯差異，同時比對其他的研究，可以看出兩種方法分別用于檢測目的蛋白的表達沒有明顯差異[11]。由于顯色原理的差異，染色后兩者片子的讀片情況和保存條件不同。IF 染色后顯色為熒光信號，因此熒光信號隨著觀察的次數(shù)和曝光時間的長短而逐漸淬滅，添加防淬滅劑，可以在一定程度上減少熒光的淬滅，另外采用量子點等新型熒光基團作為標(biāo)記熒光有更好的效果，總的來說，IF 染色后的片子應(yīng)盡快讀片并將其保存在避光、低溫的環(huán)境中。酶標(biāo)二抗顯色的原理為 DAB 催化底物后，特定位置色素的沉積，其在封片后會一直保存在原來的位置，顯微鏡的觀察不會對其產(chǎn)生影響，因此 IHC 染色的片子可以進行長期的觀察，并且對其染色后片子的保存沒有特定要求。關(guān)于結(jié)果的定性和半定量研究，與免疫組化相比，免疫熒光同樣可以采用熒光強度值來顯示蛋白的表達量[12]。同時 FISH 檢測中多數(shù)為熒光素標(biāo)記的探針識別目的基因特定片段，顯色后在熒光顯微鏡下觀察。同一細胞特定標(biāo)志物不同表達層面的研究，對于基礎(chǔ)研究和臨床診斷都具有重要的意義，尤其在乳腺癌 HER2 的臨床診療過程中。目前已有相關(guān)研究在 mRNA 水平研究中采用 FISH 和 IF 結(jié)合的方法來對標(biāo)志物的表達進行檢測[13]，但是分別用于檢測基因和蛋白表達水平的未見報道。本研究中優(yōu)化 IF 和 FISH 檢測方法，將蛋白和基因水平表達研究方法結(jié)合起來，采用HER2 蛋白高表達細胞系 JIMT-1，作為研究對象[14]，選用熒光素標(biāo)記的二抗作為顯色底物進行特定標(biāo)志物蛋白水平的檢測，同時結(jié)合不同波長熒光素標(biāo)記的基因探針，進行特定標(biāo)志物基因水平的檢測，可以達到同一細胞中特定標(biāo)志物蛋白和基因水平兩個層面的檢測，排除了切片厚度、腫瘤異質(zhì)性、染色差異等對特定標(biāo)志物表達情況判讀的影響。組織病理檢測與細胞系涂片相比，前者需要的額外操作是組織切片的脫蠟和抗原的修復(fù)，而這些步驟的操作并不會影響細胞中 HER2 蛋白和基因的表達，同時不會影響方法中 IF 和 FISH 聯(lián)合檢測和結(jié)果的判讀，只需要在前處理操作過程中添加相應(yīng)步驟，因此本方法在組織病理上應(yīng)用的可行性很高。

本文介紹的方法適用于細胞中所有標(biāo)志物的檢測，同時 FISH 檢測中，同樣可以對其他的基因探針和染色體探針進行檢測，不局限于 HER2 基因。值得注意的是，采用該方法還可以對多個標(biāo)志物同時檢測，例如分別采用不同波長熒光素（647～700 nm 附近的近紅外、594 nm 附近的紅色、555 nm附近的橙色、488 nm 附近的綠色、360 nm 附近的藍色等）標(biāo)記的不同蛋白標(biāo)志物或者基因[15]，通過調(diào)整熒光素的選擇和顯微鏡不同通道的波長選擇，可以對多個標(biāo)志物的蛋白和基因水平進行檢測。

本文提供了一種用于細胞和組織中同時進行IF 和 FISH 的檢測方法，以達到在同一細胞中對蛋白和基因水平的同時檢測。該方法在組織中的應(yīng)用和結(jié)果的判讀方面還需要更多的研究，進一步完善該方法并將其真正應(yīng)用到臨床輔助診斷中，有希望減少臨床的工作量同時提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，為臨床診斷提供一種更方便、可靠的檢測方法。