免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常綜合征家系永生化淋巴細胞系的建立

劉靜，王佳，馬金海

免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常（ immunodeficiency,centromeric instability and facial anomalies，ICF）綜合征是一種極其罕見的常染色體隱性遺傳疾病[1]，截至 2019年全世界范圍內僅有 70 多例報道[2]，因不易得到臨床血樣標本，極大限制了對該病的長期深入研究[3]。利用 EB 病毒轉染技術，建立永生化淋巴細胞系，可以保存家系成員完整的基因組，為今后長期研究提供珍貴的材料[4]。本研究利用 EB 病毒轉染 ICF 綜合征家系外周血淋巴細胞，為原發(fā)性免疫缺陷病患者建立永生化細胞系提供可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞和耗材 胎牛血清購自美國 Hyclone公司；淋巴細胞分離液、青霉素/鏈霉素、環(huán)孢素 A（CyA）、丁酸鈉和植物凝集素均購自美國 Sigma公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；B95-8 細胞由卡羅林斯卡醫(yī)學院惠贈。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺購自蘇州市潔凈技術研究所；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國 Shellba 公司；-80 ℃ 超低溫冰箱購自日本 Sanyo 公司；24、96 孔細胞培養(yǎng)板、25 cm2一次性培養(yǎng)瓶、凍存管均購自美國 Costar 公司；離心機購自上海安亭科學儀器廠；FACSAria II 流式細胞分選儀購自美國BD 公司。

1.1.3 樣本 2 歲女孩，因反復感染 1年余就診，體格檢查發(fā)現(xiàn)患兒面部發(fā)育異常（低耳位、眼距寬），輔助檢查免疫球蛋白 IgG、IgM、IgA 均低于正常，T 細胞數(shù)量正常，基因檢測 CDCA7 基因復合雜合突變（c.974_975del p.Thr325Arg fs ter 17），確診為免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常綜合征。患兒為家系中先證者，其父母及姐姐無臨床癥狀。

1.2 方法

1.2.1 EB 病毒懸液的制備 將 B95-8 凍存細胞復蘇后重懸于 5 ml 完全培養(yǎng)液中（RPMIl640 中添加 20% 胎牛血清、鏈霉素/青霉素），移至 24 孔培養(yǎng)板，每孔 2 ml，置于 5% CO2、37 ℃ 條件下，當細胞濃度達到 0.5×106個/ml，加入濃度為20 ng/ml 的佛波酯（TPA）200 ng、3 mmol/L 的丁酸鈉 0.6 mmol，室溫培養(yǎng) 6 h 后用完全培養(yǎng)液洗3 次，3500 r/min 離心 10 min，棄上清，在 10% FBS培養(yǎng)液中以 0.75×106個/ml 濃度重懸，10～14 d離心含有病毒的培養(yǎng)液后，使用 0.8 μm 濾膜過濾，上清液即為 EB 病毒液，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ICF 綜合征家系外周血單個核細胞的分離 取 ICF 綜合征家系（患兒、父親、母親及姐姐）和健康對照共 5 份外周肝素抗凝血各 3 ml，加入 3 ml PBS 等量稀釋，緩慢加于 4 ml 淋巴細胞分離液頂部，2000 r/min 室溫離心 20 min。將含有單個核細胞的中間層移至新的 15 ml 離心管中，重懸在 PBS 中，1500 r/min 室溫離心 10 min，小心棄去上清液，加入 3 ml ACK 使紅細胞破裂，室溫下靜置 3 min。加入 PBS，1500 r/min 室溫離心10 min，棄去上清。加入 15 ml 完全培養(yǎng)液，對各個樣本進行計數(shù)。

1.2.3 EB 病毒轉染淋巴細胞系的建立 ICF 綜合征家系 4 個樣本和 1 個健康對照樣本單個核細胞，加入 1 ml EB 病毒后重懸于 15 ml 離心管中，每個離心管中的單個核細胞數(shù)量至少大于4.9×105個，放置在 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱 1.5 h，1500 r/min 離心 10 min 后棄上清，加入 1 ml 完全培養(yǎng)液重懸，同時加入 20% FBS 及 0.5 μg/ml 環(huán)孢素 A，置于 96 孔板，每隔一周半量換液，且每次培養(yǎng)基中均加入濃度為 0.5 μg/ml 的環(huán)孢素 A。見淋巴細胞增大且形成大小不等的多個細胞團時，以 1:3 傳代至 24 孔培養(yǎng)板，進而轉至 25 cm2培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。1 個月后可見較黑細胞團，打散后很快再次形成團塊狀，即獲得穩(wěn)定的淋巴細胞系。

1.2.4 轉染細胞的凍存與復蘇 細胞凍存時將轉化成功的細胞系（細胞計數(shù) ＞ 2×106個），1500 r/min離心 10 min，棄上清液，在 500 μl 完全培養(yǎng)液中重懸，加 500 μl 細胞凍存液（10% DMSO 的胎牛血清 + 40% FBS）， 混勻后分裝于凍存管，置-80% 冰箱過夜，次日轉入液氮中保存。凍存時行半量凍存，其余繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

凍存細胞復蘇時，將凍存管取出后迅速放置5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱 2 min，融化后用 RPMI1640清洗，1500 r/min 離心 10 min，棄上清，加完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，取 10 μl 用臺盼藍檢測，細胞活性應大于 90%。

2 結果

2.1 利用 B95-8 細胞系制備 EB 病毒

B95-8 細胞系為猴的淋巴瘤細胞，半貼壁生長，可見桿狀及橢圓形細胞，當細胞在視野中占2/3，且多為桿狀細胞，可加入 TPA 及丁酸鈉，促使細胞裂解，釋放 EB 病毒，此時可見少量大小不一的細胞團塊，大概 10～14 d 培養(yǎng)液中所有細胞死亡（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡觀察 B95-8 細胞系制備 EB 病毒（A：B95-8 細胞；B：加入 TPA 及丁酸鈉后細胞裂解，釋放 EB 病毒；C：10～14 d 后培養(yǎng)液中所有細胞已死亡，可見細胞碎片）Figure 1 B95-8 cell observation during the EBV preparation (A:B95-8 cells; B:After adding TPA and sodium butyrate,the cells lysed and released the EBV; C:Ten to fourteen days later,all the cells were dead in the media,and the cell fragments were visible)

2.2 采用流式細胞技術檢測 ICF 綜合征家系 B細胞表達水平

該家系中患兒及其母親初始 B 細胞占總 B細胞比例較其他家庭成員及正常對照有下降。而患兒記憶 B 細胞在分化成熟階段出現(xiàn)障礙，比例明顯低于健康對照，但有大量的漿母細胞，故可行 EB病毒轉染技術，建立 ICF 綜合征家系永生化淋巴細胞系（圖2）。

圖2 正常對照者、患兒父親、患兒母親、患兒姐姐、患兒的 B 細胞表達水平Figure 2 The expression of B cells from normal control,the patient's father,mother,sister and the patient

2.3 建立 EB 病毒轉染 ICF 綜合征家系永生化淋巴細胞系

根據(jù)流式細胞技術對 ICF 家系的 B 細胞分群分析的結果，選取不同濃度的細胞數(shù)進行 EB 病毒轉染，24 孔培養(yǎng)板可見細胞多于中央聚集，而在 96 孔培養(yǎng)板中細胞多于周圍壁聚集，B 細胞體積增大，變?yōu)閳A形、橢圓形，在光學顯微鏡下很難與 T 細胞辨別。每周半量換培養(yǎng)液，大概 2 周后T 細胞大量死亡，視野可見少量散在分布的圓形細胞，多數(shù)細胞逐漸聚集，成小團或簇狀，細胞增殖旺盛，可轉移至培養(yǎng)瓶中，細胞很快形成團簇狀生長，4～5 周后逐漸變大變黑，可傳代培養(yǎng)，表明成功獲得永生細胞系（圖3）。

圖3 轉染 4 周后倒置顯微鏡下永生化淋巴細胞的形態(tài)（× 100）Figure 3 Morphology of immortalized lymphocytes after four weeks under inverted microscope (× 100)

3 討論

ICF 綜合征是一類常染色體隱性遺傳的疾病，臨床上極其罕見，而此類患者不宜反復抽取血樣，也有患者因免疫缺陷重癥感染離世，這些寶貴的具有特定生物學性狀的資料也隨之丟失，嚴重影響我國對于罕見病發(fā)病機制的長期深入研究，導致臨床醫(yī)生對此類疾病的認識不足，易造成誤診漏診[5]。而利用 EB 病毒轉染外周血淋巴細胞，使其成為一種能連續(xù)分裂、體外可培養(yǎng)、永存的淋巴細胞系，保存家系成員完整的基因組，可為后期深入長期研究提供保障[6]，也為原發(fā)性免疫缺陷病患者建立永生化細胞系提供可行性依據(jù)，對現(xiàn)有技術不能明確診斷以及研究的珍貴樣本，長期保存遺傳信息以便進行回顧性研究具有重大意義[7]。

利用 EB 病毒轉染技術得到永生化淋巴細胞的報道始見于 1985年[8]。目前國內進行的實驗多為 EB 病毒轉染健康細胞后得到永生淋巴樣細胞系，對正常人體淋巴細胞體外分子生物學特征研究起到推動作用，具有重要意義[9]。ICF 綜合征這類罕見疾病存在免疫缺陷，B 細胞增殖、活化、分化均存在不同程度的缺陷，轉染過程困難重重。本研究針對原發(fā)性免疫缺陷病，使用流式細胞儀重點對淋巴細胞進行分群分析，使用最佳數(shù)量的外周血單個核細胞與 EB 病毒進行轉染，并對轉染后的永生化細胞生長周期進行預判，在不同時期選擇換培養(yǎng)液或收集細胞，調整細胞濃度，最終成功地在 ICF家系獲得永生化淋巴細胞系。

正常人群外周血單個核細胞的提取技術已經(jīng)很成熟，但對于免疫缺陷的患者，需采用流式細胞儀檢測外周血中淋巴細胞亞群比例[10]。ICF 家系中，初始 B 細胞比例基本正常，而患者記憶 B 細胞比例明顯低于健康對照，該患者的記憶 B 細胞在分化成熟階段出現(xiàn)障礙，但有大量的漿母細胞。根據(jù)流式細胞儀的結果，我們選取不同細胞濃度進行 EB 病毒轉染，根據(jù)細胞生長情況及培養(yǎng)液顏色進行半量換液，且在換液時注意勿將移液器觸及培養(yǎng)瓶底部，培養(yǎng)液中加入 CyA（終濃度 0.5 μg/ml），以抑制可能殘留的 T 細胞活性。一個月后成功獲得永生化淋巴細胞系，細胞增殖活躍，可以不停傳代培養(yǎng)。同時我們對比 EB 病毒轉染凍存外周血單個核細胞和新鮮外周血單個核細胞，所需血量無明顯差別，操作相同，轉化效率、建系周期基本一致，在操作時需注意 EB 病毒轉染凍存外周血單個核細胞起初 1 小時可能會有大量黏滯的液體，為細胞破裂大量 DNA 釋放后的產物，無需反復吹打，如果病人 B 細胞總數(shù)較少，可將黏滯的液體另轉移至 96 孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

對于凍存 EB 病毒轉染后的 ICF 家系永生淋巴細胞系，10% DMSO 作為滲透性冷凍保護劑，對淋巴細胞起到很好的冷凍保護作用[11]。復蘇后的細胞活性在 90% 以上，為 ICF 綜合征等罕見病體外長期研究提供材料。對于目前無法明確病因和基因診斷的疾病建立永生化細胞系保存細胞基因組，保存罕見疾病珍貴的遺傳資料，以期日后進一步研究，這個方法的建立對該病發(fā)病機制的免疫學研究具有重要意義。