藥源性眼損傷快速評價的斑馬魚模型

張苗青，胡昌勤，張靖溥

滴眼液是直接用于眼部發(fā)揮治療眼部疾病的無菌制劑。為更好地保護滴眼液，防止在使用和保存過程中被微生物污染，多種滴眼液中均加有防腐劑。防腐劑會對眼部產(chǎn)生刺激，長期用藥會產(chǎn)生局部毒副作用[1]。苯扎溴銨和羥苯乙酯為滴眼液中最常用的防腐劑。苯扎溴銨是由溴化二甲基芐基烴銨同系物所組成的混合物，廣泛用作抑菌劑[2]。羥苯乙酯，化學(xué)名為對羥基苯甲酸乙酯，是尼泊金酯類防腐劑，具有廣譜的抑菌作用。有研究表明，長期使用含苯扎溴銨或羥苯乙酯的滴眼液對眼部有不同程度的損傷，導(dǎo)致眼部不適、過敏、纖維化、結(jié)膜鱗狀化、角膜厚度變化以及炎癥等癥狀[3-6]。至今，有效的快速評價化合物致眼損傷的體內(nèi)模型尚未見報道。

近年來，斑馬魚憑借其繁殖周期短，使用藥物量少、遺傳水平與人類相似、個體小、胚胎透明、便于顯微操作等優(yōu)勢，被廣泛用于藥物篩選和安全性評價的疾病模型。斑馬魚的視覺系統(tǒng)與包括人類在內(nèi)的其他脊椎動物非常相似，例如其視網(wǎng)膜和晶狀體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，以及其在受精后第5 天（days post fertilization，dpf）后就具有視覺功能，因此斑馬魚眼睛可作為較好的視覺模型，受到視覺科學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[7-8]。

本研究以苯扎溴銨和羥苯乙酯為探針?biāo)幬?，建立藥源性斑馬魚眼損傷模型，并探討苯扎溴銨和羥苯乙酯誘導(dǎo)斑馬魚眼損傷的作用機制。以期為評價這兩類化合物類似物的眼毒性提供理論依據(jù)和評價參照標(biāo)準(zhǔn)，并為快速評價化合物的眼毒性提供體內(nèi)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 斑馬魚野生型 AB 系，飼養(yǎng)溫度為（28.5 ± 1）℃，光照條件為 14 h 光照/10 h 黑暗，飼養(yǎng)液的電導(dǎo)率為 500～550 μS/cm。斑馬魚幼體的獲得：取野生型斑馬魚成魚雌雄各兩條交配，收集受精卵，清洗后，挑選表型正常的受精卵養(yǎng)殖在斑馬魚飼養(yǎng)液中，待發(fā)育至 3 dpf 用于后續(xù)實驗。本實驗程序符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的動物實驗倫理規(guī)則，并獲得所實驗動物管理委員會的準(zhǔn)許。

1.1.2 試劑 苯扎溴銨（濃度為 10.9 mg/ml）和羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度為 99.9 %）來自中國食品藥品檢定研究院；4% 多聚甲醛（PFA）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；pGEM-T 載體和 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自美國 Promega 公司；地高辛 RNA標(biāo)記試劑盒購自瑞士 Roche 公司；Trizol 試劑購自美國 Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 LD5和 LD50測定 隨機選取發(fā)育正常的3 dpf 斑馬魚，每組各 30 條。給予不同濃度的苯扎溴銨（10、20、40、60、80、100 和 120 μg/ml）和不同濃度的羥苯乙酯（50、100、200、400、600、800、1000 和 1200 μg/ml），以 0.1% DMSO 為對照組。給藥 72 h 后，統(tǒng)計每組斑馬魚死亡情況，計算死亡率（%），用 GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學(xué)軟件繪制“致死率-濃度”效應(yīng)曲線，用 Bliss 法計算苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚毒性的 LD5和LD50值。

1.2.2 活體觀察斑馬魚眼損傷 隨機選取發(fā)育正常的 3 dpf 斑馬魚，每組各 20 條，以 0.1% DMSO為對照組，給藥組置于不同濃度的苯扎溴銨（4 和10 μg/ml）和羥苯乙酯（10 和 50 μg/ml）藥液中，28.5 ℃ 培養(yǎng) 72 h，每 24 小時換液一次，在體式顯微鏡下觀察斑馬魚幼魚眼部形態(tài)變化并拍照記錄。利用 Image J 軟件測量虹膜帶寬和瞳孔直徑，并計算兩者的比值。

1.2.3 行為學(xué)檢測 取野生型斑馬魚 3 dpf 幼魚，以未處理組為對照，分別給予不同濃度的苯扎溴銨和羥苯乙酯，72 h 后，清洗 3 遍，置于 96 孔板中，每孔一條魚，每組 12 條魚，放入斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)（斑馬魚行為檢測儀）中靜置10 min，黑暗中 5 min 后立即給予光刺激 20 s，每20 s 記錄一次數(shù)據(jù)，以此循環(huán)重復(fù) 3 次，計算黑暗中第280～300 秒的平均速度、光照 20 s 的平均速度，以及對應(yīng)的運動距離。并跟蹤記錄各處理組幼魚在黑暗條件下最后 20 s（第280～300 秒）和光照條件下 20 s 的游泳軌跡。

1.2.4 RT-PCR 方法檢測眼部發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平 取野生型斑馬魚 3 dpf 幼魚給予不同濃度的苯扎溴銨（2、4 和 10 μg/ml）和羥苯乙酯（5、10 和 50 μg/ml）藥液，以 0.1% DMSO 為對照組，72 h 后收集各組斑馬魚幼魚。Trizol 法提取總 RNA，利用 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以 cDNA 為模板進行 RT-PCR。以β-actin為內(nèi)參對照，以對照組為外對照，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀拍照記錄，用 Gel-pro Analyzer 軟件對電泳圖進行灰度掃描分析，得到條帶的灰度值，每組實驗平行重復(fù) 3 次。所用引物序列如表1 所示。

表1 RT-PCR 引物Table 1 Primers used in the RT-PCR analysis of different gene markers

1.2.5 斑馬魚整體原位雜交 將靶基因six3和pitx2編碼區(qū)片段克隆至 pGEM-T 載體上，以此作為模板，按照地高辛標(biāo)記 RNA 試劑盒說明書，制備反義 RNA 探針。收集藥物處理后的斑馬魚幼魚（6 dpf），4% 多聚甲醛固定過夜，原位雜交程序按照文獻(xiàn)[9]進行。顯微鏡下對幼體眼睛拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用 GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以三個獨立實驗的±s表示。兩組間比較采用t檢驗，P ＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚幼魚的整體毒性

野生型斑馬魚 3 dpf 幼魚分別置于不同濃度的苯扎溴銨溶液和羥苯乙酯溶液中培養(yǎng) 3 d，將每組斑馬魚幼魚死亡數(shù)計數(shù)，繪制兩種化合物的致死率-濃度曲線（圖1），通過計算得出苯扎溴銨對斑馬魚幼魚的 LD5和 LD50，分別為 13.5 μg/ml和 37.5 μg/ml，羥苯乙酯的 LD5和 LD50分別為53.6 μg/ml 和 226.3 μg/ml。以小于 1/3 LD50和小于 LD5值為給藥濃度依據(jù)，確定后續(xù)實驗苯扎溴銨的給藥濃度為 2、4 和 10 μg/ml，羥苯乙酯的給藥濃度為 5、10 和 50 μg/ml。根據(jù)兩種化合物的LD50值，苯扎溴銨對斑馬魚幼魚的整體毒性大于羥苯乙酯。

圖1 苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚幼魚的致死率Figure 1 Dose-mortality curve of benzalkonium bromide and ethylparaben

2.2 苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚的眼損傷

野生型斑馬魚 3 dpf 幼魚分別置于上述實驗確定的苯扎溴銨濃度溶液和羥苯乙酯濃度溶液中，給藥 3 d，利用體式顯微鏡觀察眼部表型變化。如圖2 所示，與對照組相比，苯扎溴銨和羥苯乙酯均能顯著降低虹膜帶寬/瞳孔直徑的比值，并呈濃度依賴性，且導(dǎo)致虹膜邊緣不規(guī)則，這一結(jié)果與人類虹膜括約肌撕裂或斷裂癥狀相似[10]，說明這兩種化合物均可造成虹膜損傷。同時，兩種化合物均能使幼魚的眼部有斑塊樣病變（綠色箭頭），主要集中在虹膜和鞏膜邊緣，由于角膜在顯微鏡下呈透明狀，無法直接觀測，根據(jù)角膜在眼部的位置（覆蓋在虹膜和鞏膜鄰接上方），我們推測該斑塊樣病變是發(fā)生在角膜上。這一結(jié)果與人類的斑點角膜營養(yǎng)缺陷癥狀（fleck corneal dystrophy，CFD）相似[11]。同時，藥物處理組幼魚眼部的鞏膜凸起（白色橢圓），這與人類高度近視后鞏膜凸起病變相似[12-13]。該結(jié)果還顯示苯扎溴銨和羥苯乙酯在相同濃度條件下（10 μg/ml）對斑馬魚眼損傷程度相似。以上結(jié)果說明苯扎溴銨和羥苯乙酯均能夠誘導(dǎo)斑馬魚幼魚眼損傷，且病癥與人類眼部損傷的某些病癥相似。

2.3 苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚幼魚運動行為的影響

用斑馬魚行為檢測儀測量發(fā)現(xiàn)對照組中幼魚在黑暗和光照條件下平均速率和運動總距離無明顯差異，而苯扎溴銨和羥苯乙酯處理組中的幼魚在光照刺激下的平均速率和運動總距離顯著性低于黑暗條件下的平均速度和運動總距離。同時，藥物處理組幼魚的平均速度和運動總距離與對照組相比，在黑暗條件下無明顯差異，但在光照條件下運動速度和運動總距離呈劑量依賴性降低（圖3A、B）。運動軌跡圖顯示在黑暗條件下，藥物處理組中個別斑馬魚的運動軌跡呈現(xiàn)輕度異常，多數(shù)未見明顯異常，說明這兩種化合物對斑馬魚的運動神經(jīng)和肌組織無明顯損傷；在突然的光照刺激條件下，與對照組相比，苯扎溴銨和羥苯乙酯處理組幼魚呈不規(guī)則游動且運動速度和運動距離明顯下降（圖3C、D），說明給藥組幼魚對光刺激的調(diào)節(jié)能力降低，有可能是由于藥物處理組的斑馬魚眼部虹膜損傷，產(chǎn)生畏光反應(yīng)。

2.4 苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚眼部發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

為進一步探討這兩種化合物誘導(dǎo)眼損傷的分子機制，用 RT-PCR 檢測兩種化合物對斑馬魚幼魚眼部發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，例如與光感受器發(fā)育相關(guān)的crb1[14]、與鞏膜發(fā)育相關(guān)的lumican[15]、與虹膜發(fā)育相關(guān)的pax6a[16]、與視網(wǎng)膜發(fā)育相關(guān)的six3[17]、與角膜發(fā)育相關(guān)的pip5k3和pitx2[18-19]、與晶狀體發(fā)育相關(guān)的bumper[20]。結(jié)果表明，隨著給藥濃度的增加，兩種化合物不同程度地抑制crb1、six3、lumican、pax6a、pip5k3和pitx2的轉(zhuǎn)錄水平，但對bumper的轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響（圖4A、B），表明兩種化合物選擇性地下調(diào)了斑馬魚幼魚眼發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。原位雜交實驗也驗證了苯扎溴銨和羥苯乙酯能抑制six3和pitx2基因在斑馬魚眼部的表達(dá)，其表達(dá)水平呈劑量依賴性降低（圖4C），說明苯扎溴銨和羥苯乙酯可能通過降低一些眼發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平，破壞了斑馬魚眼部正常發(fā)育，從而導(dǎo)致眼損傷。

圖2 苯扎溴銨（A）和羥苯乙酯（B）對斑馬魚幼魚的眼毒性[活體觀察不同濃度的苯扎溴銨和羥苯乙酯處理后斑馬魚幼魚的眼部表型，包括虹膜帶寬（紅色箭頭）、斑點角膜（綠色箭頭）和鞏膜凸起（白色橢圓）。其中虹膜帶寬與瞳孔直徑的比值呈濃度依賴性降低，與 Control 組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，右下角的數(shù)字表示每組陽性結(jié)果的數(shù)量，標(biāo)尺 = 200 μm]Figure 2 Visual phenotype of eye injury of benzalkonium bromide (A) and ethylparaben (B) in larval zebrafish [Viviperception of the larvae eye phenotype by using light microscopic images,including iris bandwidth (red arrows),fleck corneal (green arrows),and scleral protrusion (white coil).The ratio of iris bandwidth to pupil diameter were decreased in a concentration-dependent manner.*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001 vs Control.The digit on the bottom right corner indicates the number of positive images.Scale bar = 200 μm]

3 討論

圖3 苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚行為學(xué)的影響[A：苯扎溴銨和羥苯乙酯對幼魚在 5 min 黑暗刺激的最后 20 s 和光刺激 20 s 平均速度的統(tǒng)計結(jié)果，與黑暗刺激條件下平均速度相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，與對照組光刺激條件下平均速度相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001；B：苯扎溴銨和羥苯乙酯對幼魚在 5 min 黑暗刺激的最后 20 s 和光刺激 20 s 運動總距離的統(tǒng)計結(jié)果，與黑暗刺激條件下運動總距離相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，與對照組光刺激條件下運動總距離相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001；苯扎溴銨和羥苯乙酯對幼魚在黑暗刺激最后 20 s（C）和光刺激 20 s（D）的運動軌跡的影響]Figure 3 Effect of benzalkonium bromide and ethylparaben on behavior of zebrafish larvae [A:The data show average speed in the last 20 s of the 5 min dark stimulation and in 20 s in light stimulation in benzalkonium bromide and ethylparaben groups.*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 vs average speed in darkness of each group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01,###P ＜ 0.001 vs average speed in light of control group; B:The data show total distance in the last 20 s of the 5 min dark stimulation and in 20 s in light stimulation in benzalkonium bromide and ethylparaben groups,respectively.*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 vs total distance in darkness of each group,#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01,###P ＜ 0.001 vs total distance in light of control group; Drugs effect on swim behavioral of larvae.Swim behavioral tracks were recorded in the last 20 s of the 5 min dark stimulation (C) and in 20 s in light stimulation (D)]

圖4 苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚幼魚眼發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響（A、B：利用 RT-PCR 檢測苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚眼發(fā)育相關(guān)基因 crb1、six3、lumican、pax6a、pip5k3、pitx2 和 bumper 的表達(dá)水平的影響，并掃描條帶的灰度，做柱狀圖，與 Control 組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，每組實驗重復(fù)三次；C：利用原位雜交實驗驗證調(diào)節(jié)基因 six3和 pitx2 在斑馬魚眼部的表達(dá)水平的變化，右下角的數(shù)字表示每組陽性結(jié)果的數(shù)量，標(biāo)尺 = 200 μm）Figure 4 The effect of benzalkonium bromide and ethylparaben on expression levels of the selected genes related to eye development in zebrafish larvae (A,B:The expression level of crb1,six3,lumican,pax6a,pip5k3,pitx2 and bumper were determined by using RT-PCR analysis.*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001 vs Control group,n = 3; C:The transcription of regulator genes six3 and pitx2 in the eye of zebrafish were detected via the whole-mount in situ hybridization.The digit on the bottom right corner indicates the number of positive images.Scale bar = 200 μm)

眼科疾病是影響生活質(zhì)量的最常見感官損傷。斑馬魚視覺系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)和功能組成與人類相似，視網(wǎng)膜中包含典型的脊椎動物光感受器，并且它們的視覺系統(tǒng)發(fā)育迅速。斑馬魚胚胎 3 dpf 發(fā)育成幼體、孵化（此時絨毛膜脫落，眼睛裸露），且與視覺有關(guān)的結(jié)構(gòu)和視網(wǎng)膜細(xì)胞基本發(fā)育成熟，細(xì)胞的種類及神經(jīng)細(xì)胞的突觸連接也基本建立，并開始發(fā)揮其部分功能，適于給藥。幼體 5 dpf 開始自主游動捕食，視覺系統(tǒng)發(fā)揮作用，適于檢測其視覺功能。因此，選擇 3 dpf 給藥，5 dpf 檢測視覺相關(guān)指標(biāo)，常用于眼部發(fā)育、功能和疾病的研究[8,21]。防腐劑是滴眼液中的主要成分，具有抗菌活性。研究表明長期使用含防腐劑的滴眼液可能會導(dǎo)致眼表損傷[1]。目前，快速評價防腐劑眼損傷的體內(nèi)模型尚未有報道。目前用于眼部疾病研究的主要模型為大鼠或小鼠模型，其高成本導(dǎo)致這些哺乳動物模型不適用于高通量篩選。近年來，鑒于斑馬魚自身的優(yōu)勢，以斑馬魚為模式動物來研究視覺功能已成為熱點，并建立了斑馬魚眼動反應(yīng)（optokinetic response，OKR）行為模型[22]，該模型主要應(yīng)用于視覺信息處理[22-23]、神經(jīng)環(huán)路[24]、視覺系統(tǒng)發(fā)育[25]以及藥物毒理[26]等方面的研究。然而，該模型的使用范圍較窄，并且操作繁瑣，不適用于大規(guī)模的藥物篩選和評價。因此，本研究以苯扎溴銨和羥苯乙酯為探針?biāo)幬?，建立了一種快速篩選和評價化合物眼毒性的斑馬魚模型和方法。通過活體表型顯微觀察，發(fā)現(xiàn)苯扎溴銨和羥苯乙酯能導(dǎo)致斑馬魚幼魚眼部虹膜損傷、角膜斑塊樣病變以及鞏膜凸起樣病變，這些表型特征與人類的某些眼疾病癥相似。因此，活體觀察斑馬魚幼體眼部表型可以作為一種簡單、快速、高效的初步評價眼損傷的檢測方法。行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)苯扎溴銨和羥苯乙酯對斑馬魚運動神經(jīng)和肌肉組織未見明顯損傷，其導(dǎo)致幼魚光反應(yīng)能力降低，這與哺乳動物的一些畏光行為相似。為進一步探討苯扎溴銨和羥苯乙酯誘導(dǎo)藥源性眼損傷的作用機制，檢測了這兩種化合物對斑馬魚眼發(fā)育相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。根據(jù)文獻(xiàn)報道，crb1基因與光感受器發(fā)育相關(guān)，該基因的缺失會導(dǎo)致斑馬魚眼角膜上皮和基質(zhì)層的發(fā)育異常，造成角膜形狀異常[14]；lumican基因編碼脊椎動物角膜和鞏膜中一種主要的硫酸角蛋白多糖，與人類的軸性近視有關(guān)，有研究表明該基因被敲低之后會導(dǎo)致斑馬魚鞏膜變薄，眼球變大，類似軸性近視[15]；pax6a基因編碼轉(zhuǎn)錄因子 PAX6，是正常眼發(fā)育所必需，能夠調(diào)節(jié)晶狀體、角膜和虹膜等的形成，研究表明PAX6 突變與嚴(yán)重的眼部疾病有關(guān)，如無虹膜、角膜緣干細(xì)胞功能不全，同時，pax6a功能缺失會導(dǎo)致角膜基因調(diào)控程序嚴(yán)重紊亂[16]；pip5k3基因編碼激酶 PIKfyve，參與磷脂酰肌醇途徑，該基因突變后會導(dǎo)致斑點狀角膜營養(yǎng)不良癥狀[18]；pitx2基因調(diào)節(jié)角膜上皮和內(nèi)皮基因的表達(dá)，該基因的異常表達(dá)會導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細(xì)胞破裂[19]；six3基因與斑馬魚視覺系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)，在視網(wǎng)膜同一性的建立和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17,27-28]；bumper基因與斑馬魚眼晶狀體發(fā)育相關(guān)，該基因突變使得晶狀體上皮細(xì)胞增生和纖維細(xì)胞變性，會導(dǎo)致功能性失明[20]。我們對上述基因的表達(dá)水平進行了檢測，結(jié)果顯示除了對bumper轉(zhuǎn)錄水平無影響外，苯扎溴銨和羥苯乙酯均能顯著下調(diào)crb1、six3、lumican、pax6a、pip5k3和pitx2的轉(zhuǎn)錄水平。進一步選擇可調(diào)節(jié)角膜上皮細(xì)胞基因表達(dá)和協(xié)調(diào)視網(wǎng)膜統(tǒng)一性的基因pitx2和six3進行原位雜交實驗，也驗證了這兩種化合物對基因pitx2和six3在幼魚眼部表達(dá)的抑制作用。這些結(jié)果說明兩種化合物對斑馬魚眼發(fā)育相關(guān)基因的影響具有選擇性，過量的眼部積累可能影響斑馬魚眼部虹膜、鞏膜、角膜和視網(wǎng)膜等的正常發(fā)育，從而導(dǎo)致眼損傷。

綜上，本研究利用斑馬魚作為模式動物評價苯扎溴銨和羥苯乙酯的眼毒性，并初步探討了其作用機制，這為苯扎溴銨和羥苯乙酯類似物的眼毒性評價提供了基本的判斷標(biāo)準(zhǔn)和理論基礎(chǔ)。同時，本研究建立了一種快速評價化學(xué)藥品眼損傷的體內(nèi)篩選模型和評價方法。

志謝感謝孟杰技師在斑馬魚飼養(yǎng)上提供的幫助。