Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法用于茶飲料抗氧化活性的評價(jià)

馬 天 ,王靜雨 ,張敏昕 ,張春發(fā) ,張津津 ,馬 莉,2*

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,石家莊 050017;2.河北省環(huán)境與人群健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050017)

我國是產(chǎn)茶和飲茶大國,由茶葉開發(fā)出的茶飲料是重要的暢銷飲料之一。茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱,是茶葉中具有保健功能的主要成分,包括兒茶素類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類化合物等。沒食子酸(GA,CAS 號:149-91-7)及7種兒茶素化合物[(－)-兒茶素(C,CAS 號:154-23-4)、(－)-表兒茶素(EC,CAS 號:490-46-0)、(－)-表沒食子兒茶素(EGC,CAS 號:970-74-1)、(－)-表兒茶素沒食子酸酯(ECG,CAS號:1257-08-5)、(－)-沒食子兒茶素(GC,CAS 號:3371-27-5)、(－)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG,CAS 號:4233-96-9)、(－)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG,CAS號:989-51-5)]占所有茶多酚總量的90%以上;其中,EGCG 約占50%,EGC 占約占20%,ECG 約占15%,EC 約占5%,它們是茶葉中的重要活性物質(zhì),清除自由基能力顯著,具有優(yōu)異的抗氧化能力[1-4]。

目前,體外抗氧化活性評價(jià)方法很多,主要包括2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除法[5-8]、鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學(xué)發(fā)光法[9]和魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光法[10]等。DPPH 自由基清除法是基于測定褪色程度的變化來評價(jià)抗氧化活性的[5]。DPPH 會產(chǎn)生一種氮自由基,其醇溶液呈紫色,在517 nm 處有強(qiáng)吸收,當(dāng)加入抗氧化劑時(shí),抗氧化物中活性氫解離并與DPPH 自由基結(jié)合,DPPH 自由基被清除,且被清除的自由基越多,溶液顏色越淺,溶液的褪色程度與吸光度的變化成正比,可用自由基清除率為50%時(shí)對應(yīng)的抗氧化劑濃度即IC50來準(zhǔn)確評價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性[7],活性物質(zhì)的IC50越小,則抗氧化劑對DPPH 自由基的清除能力越強(qiáng),抗氧化能力越強(qiáng)。鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學(xué)發(fā)光法是通過測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的減弱程度來評價(jià)抗氧化活性的,鄰苯三酚在堿性條件下會被氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2－·),O2－·將與魯米諾反應(yīng),產(chǎn)生含有一個(gè)電子的激發(fā)態(tài)中間產(chǎn)物,當(dāng)這個(gè)中間產(chǎn)物返回基態(tài)時(shí),會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,而抗氧化劑能捕獲O2－·,使產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度減弱。魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光法是通過測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的減弱程度來評價(jià)對過氧化氫中活性氧的清除能力的。在堿性條件下,過氧化氫-魯米諾體系會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,且這種化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與過氧化氫含量成正比,抗氧化劑通過清除過氧化氫而使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度下降。

三價(jià)銀配合物[Ag(Ⅲ)]與魯米諾組成的化學(xué)發(fā)光體系也可用于測定抗氧化劑,抗氧化劑可與Ag(Ⅲ)發(fā)生氧化還原反應(yīng),并使體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng),增強(qiáng)的程度與抗氧化劑含量在一定范圍內(nèi)成正比,已用于抗壞血酸[11]、多巴胺[12]、皮質(zhì)醇[13]、青霉胺[14]等物質(zhì)含量測定,但是用該方法評價(jià)茶飲料抗氧化活性的文章還未見報(bào)道。據(jù)此,本工作以Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法測定了茶葉中主要存在的沒食子酸和7 種兒茶素化合物,并同DPPH 自由基清除法、鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學(xué)發(fā)光法和魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果比較,研究了該方法的可行性,以期為茶飲料抗氧化性能評價(jià)提供一種新方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀。

EGC、ECG、C、EC、GC、GA 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶 液:0.01 mol·L－1,分別稱取一定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中,用少量乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中,用水稀釋至刻度。

EGCG 和GCG 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:0.01 mol·L－1,取一定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解并定容至10.0 mL。

其他所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液均由上述溶液用水逐級稀釋制得。

GA 標(biāo)準(zhǔn)品和魯米諾為分析純;C 標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于97%;EC、EGC、ECG、GC、GCG、EGCG和DPPH 標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于98%;所用其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為高純水;綠茶、烏龍茶、茉莉花茶和紅茶飲料均采購于超市。

1.2 儀器工作條件

載流為純水,蠕動泵轉(zhuǎn)速為25 r·min－1,光電倍增管負(fù)高壓為600 V。裝置示意圖見圖1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法

通過蠕動泵將氧化劑3×10－5mol·L－1Ag(Ⅲ)溶液(內(nèi)含0.1 mol·L－1氫氧化鈉)和化學(xué)發(fā)光 劑1×10－7mol·L－1魯米諾溶 液(內(nèi) 含0.01 mol·L－1氫氧化鈉)混合,再與載流混合流入檢測池,測定產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光基線強(qiáng)度。切換進(jìn)樣閥,將樣品溶液(將茶飲料用水稀釋2 000倍制成)或1μmol·L－1的8種茶多酚化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液由載液攜帶,與Ag(Ⅲ)溶液和魯米諾溶液的混合液混合后流入檢測池,測定由樣品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光峰值強(qiáng)度,計(jì)算化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差值(化學(xué)發(fā)光峰值強(qiáng)度與基線強(qiáng)度的差值)。

1.3.2 DPPH 自由基清除法

圖1 裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the device

參考文獻(xiàn)[8],加入1μmol·L－1茶多酚化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液或用水稀釋2 000 倍的樣品溶液0.2 mL,再加入水0.8 mL和0.002 5 g·L－1DPPH溶液(介質(zhì)為乙醇)5 mL,混合均勻,室溫避光反應(yīng)30 min,以溶劑為參比,測定樣品在517 nm 處的吸光度,記為A樣品。以乙醇代替DPPH 溶液,測定吸光度,記為A空白。以水代替茶多酚化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液,進(jìn)行對照試驗(yàn),得到的吸光度,記為A對照。按公式(1)計(jì)算:

以8種目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo),以自由基清除率為縱坐標(biāo)構(gòu)建線性回歸方程,求出清除率為50%時(shí)對應(yīng)的茶多酚化合物的濃度(IC50)。

1.3.3 鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學(xué)發(fā)光法

參考文獻(xiàn)[9],按1.3.1 節(jié)方法,其中,載流為Na HCO3-Na2CO3緩沖溶液,氧化劑為0.25 mmol·L－1鄰苯三酚溶液,化學(xué)發(fā)光試劑為0.4 mmol·L－1魯米諾溶液,其余儀器工作條件不變進(jìn)行測定。

以8種目標(biāo)化合物的濃度的自然對數(shù)為橫坐標(biāo),以自由基清除率為縱坐標(biāo)構(gòu)建線性回歸方程,求出清除率為50%時(shí)對應(yīng)的茶多酚化合物的濃度(IC50)。

1.3.4 魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光法

參考文獻(xiàn)[10],按1.3.1 節(jié)方法,其中,載流為Na HCO3-Na2CO3緩沖溶液,氧化劑為0.3%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫溶液,化學(xué)發(fā)光試劑為0.2 mmol·L－1魯米諾溶液,其余儀器工作條件不變進(jìn)行測定。

以8種目標(biāo)化合物的濃度的自然對數(shù)為橫坐標(biāo),以自由基清除率為縱坐標(biāo)構(gòu)建線性回歸方程,求出清除率為50%時(shí)對應(yīng)的各茶多酚化合物的濃度(IC50)。

2 結(jié)果與討論

2.1 4種方法的結(jié)果分析

DPPH 自由基清除法(方法1)、鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學(xué)發(fā)光法(方法2)、魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光法(方法3)和Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法(本方法)的測試結(jié)果見表1。

表1 4種方法的試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of tests of the 4 methods

由表1可知:DPPH 自由基清除法所得的8種茶多酚化合物IC50按照從小到大排序依次為GCG、EGCG、EGC、GC、ECG、GA、C、EC,說明GCG 對DPPH 自由基的清除能力最強(qiáng),EC 對DPPH 自由基清除能力最弱;鄰苯三酚-碳酸鹽-魯米諾化學(xué)發(fā)光法所得的8種茶多酚化合物的IC50按照從小到大排序依次為ECG、GCG、C、EGC、EGCG、GC、EC、GA,說明ECG 對O2－·的清除能力最強(qiáng),而GA對O2－·清除能力最弱;魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光法所得的8種茶多酚化合物IC50按照從小到大排序依次為ECG、GCG、EC、EGCG、C、GA、EGC、GC,說明ECG 對過氧化氫清除能力最強(qiáng),而GC清除過氧化氫的能力最弱;Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法所得的8種茶多酚化合物化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差值按照從小到大排序依次為EC、C、GA、ECG、GC、EGC、EGCG、GCG,說明GCG 與Ag(Ⅲ)的反應(yīng)速度最快,最易被Ag(Ⅲ)氧化[15],抗Ag(Ⅲ)氧化活性最強(qiáng),而EC與Ag(Ⅲ)的反應(yīng)速率最慢,說明其最難被Ag(Ⅲ)氧化,抗Ag(Ⅲ)氧化活性最弱。前3種方法得到IC50的排序不同,是由于不同的茶多酚化合物捕獲的活性物種不同(分別為DPPH 自由基、O2－·和過氧化氫活性氧),故表現(xiàn)出的抗氧化能力不同。DPPH 自由基清除法得到的8種茶多酚化合物的抗氧化能力大小排序與Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法的一致,這是由于這兩種方法的信號強(qiáng)弱均與釋放的活性氫和電子數(shù)目有關(guān)[16-17]。以DPPH 自由基清除法所得的IC50為橫坐標(biāo),以Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法所得的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差值為縱坐標(biāo)繪制了線性擬合曲線(圖2),其線性擬合方程為y＝－101.8x＋1 408,相關(guān)系數(shù)為0.949 0,進(jìn)一步說明了2 種方法具有較好的相關(guān)性。

圖2 2種方法的相關(guān)性Fig.2 Correlation between the 2 methods

2.2 樣品分析

按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)試驗(yàn)方法,將Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法和DPPH 自由基清除法分別用于市售綠茶、烏龍茶、茉莉花茶和紅茶飲料的抗氧化活性分析。結(jié)果表明:DPPH 自由基清除法所得的抗氧化能力綠茶最強(qiáng),紅茶最弱,烏龍茶和茉莉花茶能力相當(dāng);而Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法所得的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差值排序按照從大到小的排序依次為綠茶、烏龍茶、茉莉花茶、紅茶。

以DPPH 自由基清除法所得自由基清除率為橫坐標(biāo),以Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法所得的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差值為縱坐標(biāo)繪制線性擬合曲線(圖3),所得相關(guān)系數(shù)為0.966 5,說明Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法也能用于茶飲料中抗氧化活性的評價(jià)。

本工作采用Ag(Ⅲ)-魯米諾流動注射化學(xué)發(fā)光法和文獻(xiàn)報(bào)道的其他3種方法評價(jià)了8種茶多酚化合物的抗氧化活性,結(jié)果顯示,本方法與DPPH 自由基清除法具有較好的一致性。將該法應(yīng)用于4種茶飲料抗氧化活性的評價(jià),所得結(jié)果也與DPPH 自由基清除法的一致,說明本方法可用于茶飲料的抗氧化活性評價(jià)。

圖3 實(shí)際樣品分析中2種方法的相關(guān)性Fig.3 Correlation between the 2 methods in analysis of the actual samples